酶工程原理与技术.docx

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酶工程原理与技术

第一章绪论

酶：

具有生物催化功能的生物大分子。

酶工程：

酶的生产与应用的技术过程。

第一节酶的基本概念

同时酶的催化作用具有：

专一性、高效性，作用条件温和等特点

第二节酶的分类与命名

按其化学组成不同，酶可以分为主要由蛋白质组成蛋白类酶（P酶）和主要由核糖核酸组成的核酸类酶（R酶）两大类别。

蛋白类酶和核酸类酶的分类命名的总原则是相同的（根据酶的作用底物和催化反应的类型），同时又有所区别

一、蛋白类酶的分类与命名

推荐名：

在惯用名称的基础上，加以选择和修改而成。

酶的推荐名一般由两部分组成：

第一部分为底物名称，第二部分为催化反应的类型。

后面加一个“酶”字（-ase）。

不管酶催化的反应是正反应还是逆反应，都用同一个名称。

系统名称（Systematicname）：

包括了酶的作用底物，酶作用的基团及催化反应的类型。

（一）蛋白类酶（P酶）的分类原则

按照酶催化作用的类型，将蛋白类酶分为6大类。

第1大类，氧化还原酶第2大类，转移酶第3大类，水解酶第4大类，裂合酶第5大类，异构酶第6大类，合成酶（或称连接酶）

每个大类中，按照酶作用的底物、化学键或基团的不同，分为若干亚类。

每一亚类中再分为若干小类。

每一小类中包含若干个具体的酶

六大类蛋白类酶简介

1、氧化还原酶（Oxidoreductases）催化氧化还原反应，其催化反应通式为：

AH2+B＝A+BH2

2、转移酶（Transferases）反应通式为：

AB+C＝A+BC

3、水解酶（Hydrolases）催化各种化合物进行水解反应的酶称为水解酶。

其反应通式为：

AB＋H2O＝AOH＋BH

4、裂合酶（Lyases）催化一个化合物裂解成为两个较小的化合物及其逆反应的酶成为裂合酶。

其反应通式为：

AB＝A＋B乙酰乳酸合酶（2-乙酰乳酸＋CO2＝2-丙酮酸）

5、异构酶（Isomerases）催化分子内部基团位置或构象的转换的酶称为异构酶其反应通式为：

A＝B。

异构酶按照异构化的类型不同，分为6个亚类。

命名时分别在底物名称的后面加上异构酶（isomerase）、消旋酶（racemase）、变位酶（mutase）、表异构酶（epimerase）、顺反异构酶（cis-trans-isomerase）等。

6、连接酶（Ligases）或合成酶（Synthetases）连接酶是伴随着ATP等核苷三磷酸的水解，催化两个分子进行连接反应的酶。

其反应通式为：

A+B+ATP＝AB+ADP+Pi或AB+AMP+PPi

R酶采用的分类原则：

①根据酶作用的底物是其本身RNA分子还是其它分子，将核酸类酶分为分子内催化（incis）R酶和分子间催化（intrans）R酶两大类。

②在每个大类中，根据酶的催化类型不同，将R酶分为若干亚类。

如剪切酶，剪接酶，多功能酶等

可将分子内催化的R酶分为自我剪切酶（Self-cleavage）自我剪接酶（Self-splicing）等亚类

分子间催化的R酶可以分为RNA剪切酶，DNA剪切酶，多肽剪切酶，多糖剪接酶等亚类。

③在每个亚类中，根据酶的结构特点和催化特性的不同，分为若干小类。

第三节酶活力的测定

酶活力（enzymeactivity）的大小可以用一定条件下酶所催化的反应初速度表示。

在外界条件相同的情况下，反应初速度越大，酶的活力越高。

一、酶活力测定方法

酶活力测定的方法：

化学测定法、光学测定法、气体测定法等。

酶活力测定的要求：

快速、简便、准确。

酶活力测定的步骤：

（1）根据酶催化的专一性，选择适宜的底物，并配制成一定浓度的底物溶液。

（2）根据酶的动力学性质，确定酶催化反应的温度、pH值、底物浓度、激活剂浓度等反应条件。

（3）在一定的条件下，将一定量的酶液和底物溶液混合均匀，适时记下反应开始的时间。

（4）反应到一定的时间，取出适量的反应液，运用各种生化检测技术，测定产物的生成量或底物的减少量。

注意：

若不能即时测出结果的，则要及时终止反应，然后再测定。

终止酶反应的方法：

（1）加热使酶失活

（2）加入适宜的酶变性剂（如三氯醋酸）；（3）调节pH值；（4）低温终止反应。

二、酶活力单位

在特定条件下，每1min催化1μmol的底物转化为产物的酶量定义为1个酶活力单位。

这个单位称为国际单位（IU）

国际上另一个常用的酶活力单位是卡特（Kat）。

在特定条件下，每秒催化1mol底物转化为产物的酶量定义为1卡特（Kat）1Kat=6×107IU

酶的比活力是酶纯度的一个指标，是指在特定条件下，单位重量（mg）蛋白质或RNA所具有的酶活力单位数。

酶比活力＝酶活力（单位）/mg（蛋白或RNA）

三、酶的转换数与催化周期

酶的转换数（Kp），又称为摩尔催化活性（molarcatalyticactivity），是指每个酶分子每分钟催化底物转化的分子数。

即是每摩尔酶每分钟催化底物转化为产物的摩尔数。

Kp是酶催化效率的一个指标。

通常用每微摩尔酶的酶活力单位数表示。

单位为min-1

转换数的倒数称为酶的催化周期。

催化周期是指酶进行一次催化所需的时间。

单位为毫秒（msec）或微秒（μsec）。

四、固定化酶的活力测定

（4）固定化酶的比活力测定：

在固定化酶中，一般采用每克（g）干固定化酶所具有的酶活力单位数表示。

即：

比活力=酶活力单位/cm2（5）酶结合效率与酶活力回收率的测定

酶结合效率又称为酶的固定化率，是指酶与载体结合的百分率。

酶活力回收率是指固定化酶的总活力与用于固定化的总酶活力的百分率。

（6）相对酶活力的测定

具有相同酶蛋白（或酶RNA）量的固定化酶活力与游离酶活力的比值称为相对酶活力。

酶在应用过程中也表现出一些不尽人意之处:

活力不高稳定性差分离纯化困难

第二章酶生物合成的基本理论

★酶的生产方法

1、提取分离法

定义：

采用各种技术从动植物或微生物细胞中将酶提取出来，再与所含杂质进行分离的技术过程。

优点：

设备简单，操作方便缺点：

原料的周期长，来源有限，并受地理气候和季节等因素的影响，受经济、技术及伦理各方面的限制。

2、生物合成法：

最广泛使用的方法

定义：

经过预先设计，通过人工操作，利用微生物细胞、动植物细胞的生命活动而获得人们所需酶的技术过程。

分类：

微生物发酵产酶（应用最广）、植物细胞培养产酶、动物细胞培养产酶优点：

生产周期短，酶的产率高，不受生物资源、地理环境和气候条件等影响。

缺点：

对发酵设备和工艺条件要求高。

3、化学合成法

定义：

按照酶的化学结构中氨基酸或核苷酸的排列顺序，通过化学反应将一个一个的单体（氨基酸或核苷酸）连接起来而获得所需酶的技术过程。

缺点：

反应步骤多，只适于短肽，受试剂、设备和成本等因素限制。

只合成化学结构十分清楚的少数酶

★转录的基本过程：

（转入的起始、RNA链的延伸和RNA链合成的终止）转录以DNA为模板，以核苷三磷酸为底物，在RNA聚合酶（转录酶）的作用下，生成RNA分子的过程。

转录过程的特点

转录的不对称性：

在RNA的合成中，DNA的二条链中仅有一条链可作为转录的模板，称为转录的不对称性。

（反义链，有义链）

反义链antisensestrand（无意义链，负链）：

在RNA的转录中，用作模板的DNA链称为反义链。

有义链codingstrand（编码链，正链）：

在RNA的转录中，不作为模板的DNA链称为有义链。

转录所需酶：

依赖DNA的RNA聚合酶又称为转录酶，是以DNA为模板的一类RNA聚合酶。

原核生物：

核心酶，全酶（核心酶+σ因子）。

真核生物：

RNA聚合酶Ⅰ、RNA聚合酶Ⅱ和RNA聚合酶Ⅲ，都属于寡聚酶，酶的亚基数目为4～10个，亚基种类有4～6种。

转录过程起始位点的识别recognition转录起始initiation链的延伸elongation转录终止termination转录后加工modification

蛋白质的合成过程（P25）

★酶生物合成的调节（P29）

适应酶：

通过调节酶合成的量来控制微生物代谢速度的调节机制，是在基因转录水平上进行的。

通过阻止酶的过量合成，节约生物合成的原料和能量。

酶在细胞内的含量取决于酶的合成速度和分解速度。

细胞根据自身活动需要，严格控制细胞内各种酶的合理含量，从而对各种生物化学过程进行调控。

酶浓度调节的化学本质是基因表达的调节。

在细胞内，所合成的酶的种类及数量是由特殊的基因信息决定的。

DNA所携带的酶蛋白遗传信息，需要通过转录和翻译而合成酶蛋白。

在细胞内进行的转录或翻译过程都有特定的调节控制机制，其中转录的调控占主导地位。

因此，基因表达的调控主要在转录水平上进行。

★分解代谢物阻遏作用（原核生物酶简述分解代谢物阻遏作用的原理及解除方法）

分解代谢物阻遏作用是指某些物质（主要是指葡萄糖和其他容易利用的碳源等）经过分解代谢产生的物质阻遏某些酶（主要是诱导酶）生物合成的现象。

原理：

★酶生物合成的诱导作用（什么是酶合成的诱导作用？

其原理是什么？

）酶生物合成的诱导作用是指加入某些物质，使酶的生物合成开始或加速进行的现象。

原理？

？

★酶生物合成的反馈阻遏作用（什么是酶生物合成的反馈阻遏作用？

其原理？

）酶生物合成的反馈阻遏作用有称为产物阻遏作用，是指酶催化反应的产物或代谢途径的末端产物使该酶的生物合成受到阻遏的现象。

原理？

★端粒酶（P33）是催化端粒合成和延伸的酶。

端粒酶是一种核糖核蛋白，包含蛋白质和RNA两种基本成分。

★抗体酶（P34）又称为催化性抗体，是一类具有生物催化功能的抗体分子。

第三章酶的生物合成法生产

第一节细胞的选择

酶生产的细胞必须具备的条件：

1、酶的产量高2、容易培养和管理3、产酶稳定性好4、利于酶的分离纯化

5、安全无毒

微生物的基本要求

1不是致病菌2发酵周期短,产酶量高3不易变异退化4最好是产生胞外酶的菌种,利于分离5对医药和食品用酶,还应考虑安全性：

6由非致病微生物制取的酶,需作短期毒性实验。

7非常见微生物制取的酶,需做广泛的毒性实验,包括慢性中毒实验。

第二节培养基的配制

一、培养基的基本成分

1、碳源

大多数产酶微生物采用淀粉或其水解产物，如糊精、淀粉水解糖、麦芽糖、葡萄糖等为碳源。

植物细胞以蔗糖为碳源；动物细胞以谷氨酰胺或谷氨酸为碳源

2、氮源：

有机氮源和无机氮源两大类。

不同的细胞对氮源有不同的要求：

动物细胞要求有机氮源；植物细胞主要使用无机氮源；微生物细胞中，异养型细胞要求有机氮源自养型细胞采用无机氮源

在使用无机氮源时要注意铵盐和硝酸盐的比例

碳和氮两者的比例，即碳氮比（C/N），对酶的产量有显著影响。

所谓碳氮比一般是指培养基中碳元素（C）的总量与氮元素（N）总量之比。

培养基的设计原则

1、选择适宜的营养物质2、营养物的浓度及配比合适3、物理、化学条件适宜4、经济节约5、精心设计、试验比较

三、植物细胞培养基

1、植物细胞培养基的特点

（1）植物细胞的生长和代谢需要大量的无机盐

（2）植物细胞需要多种维生素和植物生长激素，如硫胺素、吡哆素、烟酸、肌醇、生长素、分裂素等。

（3）植物细胞要求的氮源一般为无机氮源

（4）植物细胞一般以蔗糖为碳源

2、常用的植物细胞培养基

MS培养基：

硝酸盐浓度高，广泛应用于植物细胞、组织和原生质体培养

B5培养基：

铵盐浓度低，适于双子叶植物特别是木本植物的组织、细胞培养

White培养基：

无机盐浓度低，适合生根培养

KM-8P培养基：

有机成分种类全面，广泛应用与原生质体的培养

（一）动物细胞培养基的组分

1氨基酸：

必需氨基酸、谷氨酰胺、谷氨酸2维生素：

无血清需补充VB、VC3无机盐：

调节渗透压4葡萄糖：

5激素：

胰岛素、生长激素、氢化可的松6生长因子：

无血清需添加适量的表皮生长因子、神经生长因子、成纤维细胞生长因子

（二）动物细胞培养基的配制

第三节产酶工艺条件及其调节P45

培养基中溶解氧的量决定于一定条件下氧气的溶解速度

氧的溶解速度又称为溶氧速率或溶氧系数，以Kd表示。

溶氧速率是指单位体积的发酵液在单位时间内所溶解的氧的量。

其单位通常以[mmol氧/h·L]表示。

溶氧速率与通气量、氧气分压、气液接触时间、气液接触面积以及培养液的性质等有密切关系。

耗氧速率、细胞浓度的概念P48

第四节微生物发酵产酶

一、微生物发酵产酶的方式及其特点

固体培养发酵液体深层发酵固定化细胞发酵固定化原生质体发酵

二、提高酶产量的措施

1、添加诱导物（诱导物的分类：

酶作用底物型诱导物酶的反应产物酶作用底物类似物作诱导物）

酶最有效的诱导物往往不是酶的作用底物，也不是酶的反应产物，而是可以与酶结合又不能被酶催化的底物类似物。

2、控制阻遏物浓度3、添加表面活性剂表面活性剂分为离子型和非离子型两大类

适量的非离子型表面活性剂，如吐温（Tween）、特里顿（Triton）等可以加速胞外酶的分泌，而使酶的产量增加。

离子型表面活性剂对细胞有毒害作用

4、添加产酶促进剂

三、酶发酵动力学

（一）酶生物合成的模式；同步合成型延续合成型中期合成型滞后合成型

中期合成型酶的共同特点是：

酶的生物合成受到产物的反馈阻遏作用或分解代谢物阻遏作用，而且酶所对应的mRNA稳定性差

滞后合成型的酶，之所以要在细胞生长一段时间甚至进入平衡期以后才开始合成，主要原因是由于受到培养基中存在的阻遏物的阻遏作用。

只有随着细胞的生长，阻遏物几乎被细胞用完而使阻遏解除后，酶才开始大量合成。

若培养基中不存在阻遏物，该酶的合成可以转为延续合成型。

该类型酶所对应的mRNA稳定性很好，可以在细胞生长进入平衡期后的相当长的一段时间内，继续进行酶的生物合成。

在酶的发酵生产中，为了提高产酶率和缩短发酵周期，最理想的合成模式应是延续合成型。

对于滞后合成型的酶，要设法降低培养基中阻遏物的浓度，尽量减少甚至解除产物阻遏或分解代谢物阻遏作用，使酶的生物合成提早开始；

对于中期合成型的酶，则要在提高mRNA的稳定性以及解除阻遏两方面下功夫，使其生物合成的开始时间提前，并尽量延迟其生物合成停止的时间。

（二）细胞生长动力学

1950年，法国的莫诺德（Monod）首先提出了表述微生物细胞生长的动力学方程？

莫诺德方程中的μm和KS可以通过双倒数作图法求出？

宏观产酶动力学的研究表明：

产酶速率与细胞比生长速率、细胞浓度以及细胞产酶模式有关。

产酶动力学模型或称为产酶动力学方程可以表达为？

（一）固定化细胞发酵产酶的特点

（1）提高产酶率

（2）可以反复使用或连续使用较长时间（3）发酵稳定性好，对温度、pH的适应范围扩大，基因工程菌的质粒稳定，不易丢失：

（4）缩短发酵周期，提高设备利用率（5）产品易于分离纯化（6）只适用于胞外酶等胞外产物的生产

固定化原生质体的特点

（1）变胞内产物为胞外产物：

（2）提高酶产率：

（3）稳定性较好：

（4）易于分离纯化

固定化原生质体发酵产酶在工艺条件控制方面需要注意下列问题：

（1）渗透压的控制：

（2）防止细胞壁再生：

（3）保证原生质体的浓度

第四章酶的提取与分离纯化

酶的分离纯化：

细胞破碎方法：

机械破碎、物理破碎、化学破碎、酶促破碎机械破碎通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。

捣碎法、研磨法、匀浆法

★物理破碎（P74）通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎温度差破碎法；压力差破碎法；超声波破碎法

★酶的提取（概念及注意事项）概念：

酶的提取即酶的抽提，是指在一定的条件下，用适当的溶剂（或溶液）处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂（或溶液的）中的过程。

抽提原则：

根据酶的结构和溶解特性，选择适当的溶剂。

极性物质易溶于极性溶剂中；非极性物质易溶于非极性有机溶剂中；酸性物质易溶于碱性溶剂中；碱性物质易溶于酸性溶剂中。

酶都能溶解于水，通常可用水或稀酸、稀碱、稀盐溶液等进行提取，有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团，则可用有机溶剂提取。

提高温度，降低溶液粘度、增加扩散面积、縮短扩散距离，增大浓度差等都有利于提高酶分子的扩散速度，从而增大提取效果。

影响酶提取的主要因素温度适当提高→酶溶解度↑，扩散速度↑→提取效果↑；过度提高→酶失活有机溶剂提取时：

应控制温度在0~10℃的低温条件下。

pH影响酶的溶解度和稳定性提取液的体积提取液的总量一般为原料体积的3~5倍，最好分几次提取。

第三节沉淀分离

沉淀分离是通过改变某些条件或添加某种物质，使酶的溶解度降低，而从溶液中沉淀析出，与其它溶质分离的技术过程

沉淀分离的方法主要有：

盐析沉淀法、等电点沉淀法、有机溶剂沉淀法、复合沉淀法、选择性变性沉淀法等

一、盐析沉淀法

盐析沉淀法简称盐析法，是利用不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同的特性，通过在酶液中添加一定浓度的中性盐，使酶或杂质从溶液中析出沉淀，从而使酶与杂质分离的过程

一般在低盐浓度的情况下，蛋白质的溶解度随盐浓度的升高而增加，这种现象称为盐溶。

而在盐浓度升高到一定浓度后，蛋白质的溶解度又随盐浓度的升高而降低，结果使蛋白质沉淀析出，这种现象称为盐析

盐之所以会改变蛋白质的溶解度，是由于盐在溶液中离解为正离子和负离子。

由于反离子作用，使蛋白质分子表面的电荷改变，同时由于离子的存在改变了溶液中水的活度，使分子表面的水化膜改变

饱和度是指溶液中加入的饱和硫酸铵的体积与混合溶液总体积之比值

饱和硫酸铵的配制方法：

过量硫酸铵——50~60℃保温——趁热过滤——0或25℃平衡1~2天——有固体析出即为饱和硫酸铵溶液

★等电点沉淀法79原理：

两性电解质在等电点时溶解度最低；不同的两性电解质有有不同的等电点。

缺点：

沉淀不完全。

因为等电点时两性电解质分子表面的水化膜仍然存在，使酶等大分子仍有一定的溶解性，而使沉淀不完全。

注意：

调节pH时，防止局部过酸或过碱。

★有机溶剂沉淀法80有机溶剂使酶沉淀析出的原因：

1、有机溶剂的存在使溶液的介电常数降低，从而使溶质分子间的静电引力增大，互相吸引而易于凝集。

2、有机溶剂与水作用，使溶质分子表面的水膜破坏，也使其溶解度降低而沉淀析出。

操作注意：

有机溶剂的用量一般为酶液体积的2倍；pH一般调到欲分离酶的等电点附近；一般在低温条件下操作。

凝胶电泳（P104）？

？

聚丙烯凝胶电泳（为什么SDS-凝胶电泳不受蛋白分子电荷及分子形状影响？

）P106

（1）连续凝胶电泳：

只用一层凝胶，采用相同的pH和相同的缓冲液进行的电泳。

（2）不连续凝胶电泳：

采用2层或3层性质不同的凝胶（样品胶、浓缩胶和分离胶）重叠起来使用，采用两种不同的pH和不同的缓冲液进行的电泳。

二、离心方法的选择

对于超速离心，可以根据需要采用差速离心、密度梯度离心或等密梯度离心等方法。

1、差速离心：

差速离心是指采用不同的离心速度和离心时间，使不同沉降速度的颗粒分批分离的方法。

2、密度梯度离心

样品在密度梯度介质中进行离心，使沉降系数比较接近的物质分离的一种区带分离方法。

3、等密梯度离心

当欲分离的不同颗粒的密度范围处于离心介质的密度范围内时，在离心力的作用下，不同浮力密度的颗粒或向下沉降，或向上飘浮，只要时间足够长，就可以一直移动到与它们各自的浮力密度恰好相等的位置（等密度点），形成区带。

这种方法称为等密梯度离心，或称为平衡等密度离心。

等密梯度离心常用的离心介质是铯盐，

离心条件：

离心机、离心方法、离心介质、密度梯度、离心力（或离心速度）和离心时间

第五节过滤与膜分离

过滤是借助于过滤介质将不同大小、不同形状的物质分离的技术过程。

根据过滤介质的不同,过滤可以分为膜过滤和非膜过滤两大类。

根据过滤介质截留的物质颗粒大小不同，过滤可以分为粗滤、微滤、超滤和反渗透等4大类

第六节层析分离

层析分离是利用混合液中各组分的物理化学性质（分子的大小和形状、分子极性、吸附力、分子亲和力、分配系数等）的不同，使各组分以不同比例分布在两相（固定相、流动相）中。

当流动相流经固定相时，各组分以不同的速度移动，从而使不同的组分分离纯化。

分离纯化酶常采用：

吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶层析和亲和层析等

一、吸附层析

1、吸附层析原理：

任何两个相之间都可以形成一个界面，其中一个相中的物质在两相界面上的密集现象称为吸附。

凡是能够将其它物质聚集到自己表面上的物质称为吸附剂。

吸附剂一般是固体或者液体，在吸附层析中通常应用的是固体吸附剂。

能聚集于吸附剂表面的物质称为被吸附物。

吸附剂与被吸附物之间的相互作用力主要是范德华力。

其特点是可逆的。

吸附层析通常采用柱型装置，先装柱、加液，而后洗脱

在洗脱时，层析柱内不断发生解吸、吸附、再解吸、再吸附的过程。

适当时间后，不同物质在吸附柱内形成各自的区带

2、洗脱方法

三种方法：

溶剂洗脱法、置换洗脱法、前缘洗脱法

３、吸附剂与洗脱剂的选择

①吸附剂的选择：

吸附层析的关键因素

极性物质容易被极性表面吸附；非极性物质容易被非极性表面吸附；溶解度越大的物质越难被吸附。

吸附剂可分为无机吸附剂和有机吸附剂。

吸附剂通常由一些化学性质不活泼的多孔材料制成，比表面积很大

②洗脱剂的选择：

要根据吸附剂的性质和被吸附物的特点来选择合适的洗脱剂。

对于极性组分，用极性大的溶剂洗脱效果较好。

而对于非极性组分，则用非极性溶剂洗脱较佳。

洗脱剂的种类有：

饱和烃、醇、酮、酚、醚、卤代烷、水等。

洗脱剂的选择要注意下列各点：

洗脱剂不会与吸附剂起化学反应，也不会使吸附剂溶解。

洗脱剂对混合液中的各组分的溶解度大，粘度小，流动性好，容易与被洗脱的组分分离。

洗脱剂要求一定的纯度，以免杂质对分离带来不利影响

二、分配层析

分配层析是利用各组分在两相中的分配系数不同，而使各组分分离的方法。

分配系数是指一种溶质在两种互不相溶的溶剂中溶解达到平衡时，该溶质在两项溶剂中的浓度的比值。

在层析条件确定后，分配系数是一常数，以K表示。

三、离子交换层析

离子交换层析是利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对各种离子的亲和力不同而达到分离目的的一种层析分离方法。

按活性基团的性质不同，离子交换剂可以分为阳离子交换剂和阴离子交换剂

由于酶分子具有两性性质，所以可用阳离子交换剂，也可用阴离子交换剂进行酶的分离纯化。

在溶液的pH值大于酶的等电点时，酶分子带负电荷，可用阴离子交换剂（引入碱性基团）进行层析分离；

四、凝胶层析

又称为凝胶过滤，分子排阻层析，分子筛层析等。

是指以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达到物质分离的一种层析技术

1、凝胶层析的基本原理

凝胶层析柱中装有多孔凝胶，当含有各种组分的混合溶液流经凝胶层析柱时，大分子物质以较快的速度流过凝胶柱。

而小分子物质向下移动的速度比大分子的速度慢，从而使混合溶液中各组分按照相对分子质量由大到小的顺序先后流出层析柱，而达到分离的目的

凝胶层析的操作一般包括装柱、上柱、洗脱等过程

五、亲和层析原理

六、层析聚焦原理

（1）电场强度是指每厘米距离的电压降。

（2）溶液的pH值:

（3）溶液的离子强度:

（4）电渗:

8.1有机溶剂萃取

用于萃取的有机溶剂主要有乙醇、丙酮、丁醇、苯酚等。

例如，用丁醇萃取微粒体或线粒体中的酶；用苯酚萃取RNA等