流式细胞术实验方案最终版.docx
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流式细胞术实验方案最终版.docx
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流式细胞术实验方案最终版
实验设计流程
样本处理:
实验前需准备的试剂及耗材
常规耗材
1.10μlTip(Axygen,价格:
70/包,20包)
2.10μlTipRNAseFree(Axygen,价格:
22.00/10盒,30盒)
3.200μlTip(Axygen,价格:
70/包,20包)
4.200μlTipRNAseFree(Axygen,价格:
22.00/10盒,30盒)
5.1mllTip(Axygen,价格:
90.00/包,20包)
6.0.2mlPCR管(Axygen,价格:
180.00/包,5包)
7.0.6mlEP管(Axygen,价格:
120.00/包,5包)
8.1.5mlEP管(Axygen,价格:
180.00/包,5包)
9.12x75mm流式上样管(BectonDickinsonCat.No.352008,价格:
420.00/箱,5箱)
10.12x75mm无菌包装带盖流式上样管(BectonDickinsonCat.No.352003,价格:
491.00/箱,3箱)
所需仪器
11.10μl移液器(Eppendorf,价格:
2000.00/支,支)
12.20μl移液器(Eppendorf,价格:
2000.00/支,1支)
13.100μl移液器(Eppendorf,价格:
2000.00/支,1支)
14.200μl移液器(Eppendorf,价格:
2000.00/支,1支)
15.1000μl移液器(Eppendorf,价格:
2000.00/支,1支)
流式检测Th1/Th2/Th17细胞实验流程
实验试剂、耗材
1.FetalBovineSerum(Gibco,Cat.No.10100-147,价格:
约3000.00-4000.00,1瓶)
2.RPMI1640培养基(Corning,R10040512,价格:
80.00,5瓶)
3.PMA(Sigma-Aldrich,Cat.No.P1585-1mg,价格:
1122.00,1瓶)
4.Ionomycin(Sigma-Aldrich,Cat.No.I0634-1mg,价格:
1432.00,1瓶)
5.Monensin(Sigma-Aldrich,Cat.No.M5273-500mg,价格:
621.00,1瓶)
6.IntracellularFixationandPermeabilizationBufferSet(eBioscienceCat.No.88-8824-00,价格:
1341.00,2支)
7.NormalMouseSerum(eBioscienceCat.No.24-5544-94,价格:
891.00,3支)
8.FlowCytometryStainingBuffer(实验室自配)
9.1XRBCLysisBuffer(实验室自配)
10.Anti-HumanCD4eFlour450(eBioscienceCat.No.48-0049-42,价格:
2241.00,3支)
11.Anti-HumanIL-4FITC(eBioscienceCat.No.BMS129FI,价格:
1859.22,1支)
12.MouseIgG1KIsotypeControlFITC(eBioscienceCat.No.11-4714-42,价格:
1161.00,1支)
13.Anti-HumanIFN-γAPC(eBioscienceCat.No.17-7319-82,价格:
2421.00,1支)
14.MouseIgG1KIsotypeControlAPC(eBioscienceCat.No.17-4714-42,价格:
1341.00,1支)
15.Anti-HumanIL-17APE-Cyanine7(eBioscienceCat.No.25-7179-42,价格:
3141.00,1支)
16.MouseIgG1KIsotypeControlPE-Cyanine7(eBioscienceCat.No.25-4714-42,价格:
1701.00,1支)
操作流程
1.取无菌分离的抗凝外周血0.5ml,加入等体积的RPMI1640培养基,混匀;
2.加入终浓度为300ng/mlPMA、1ug/mlIonomycin,于37℃、5%CO2的饱和湿度下培养60min;
3.加入终浓度为2μmol/L的蛋白转运抑制剂Monensin,继续培养6hrs;
4.各取100μl刺激培养后的血于2支流式管中,分别加入2ml红细胞裂解液,室温下放置3~10min至澄清;
5.300g离心5min,去除上清液,加入2mlStainingBuffer;
6.300g离心5min,去除上清液,底部留约100μl液体,混匀;
7.每管加入100μlICFixation,混匀,室温下放置20min;
8.直接加入2ml1×PermeabilizationBuffer,450g离心5min后,小心去除上清液;
9.重复步骤9,底部留约100μl液体,加入2μlNormalMouseSerum,混匀,室温下孵育15min;
10.分别加入5μl同型对照及荧光标记抗体,室温下孵育30min;
管1:
CD4-eFluor450、IgG1kFITC、IgG1kAPC、IgG1kPE-Cyanine7
管2:
CD4-eFluor450、IL-4FITC、IFN-γAPC、IL-17APE-Cyanine7
11.直接加入2ml1×PermeabilizationBuffer,500g离心5min后,小心去除上清液;
12.重复步骤12,底部留约100μl液体,加入200μlStainingBuffer,上机检测;
流式细胞仪检测调节性T细胞实验流程
实验试剂、耗材
1.Anti-HumanCD4FITC(eBioscienceCat.No.11-0049-42,价格:
1701.00,3支)
2.Anti-HumanCD25PE(eBioscienceCat.No.12-0259-42,价格:
2061.00,1支)
3.MouseIgG1KIsotypeControlPE(eBioscienceCat.No.12-4714-42,价格:
1071.00,1支)
4.Anti-HumanFoxp3APC(eBioscienceCat.No.17-4777-42,价格:
2691.00,1支)
5.MouseIgG1KIsotypeControlAPC(eBioscienceCat.No.17-4714-42,价格:
1341.00,1支)
6.NormalmouseSerum(eBioscienceCat.No.24-5544-94)
7.FlowCytometryStainingBuffer(实验室自配)
8.1XRBCLysisBuffer(实验室自配)
9.Foxp3/TranscriptionFactorStainingBufferSet(eBioscienceCat.No.00-5523-00,价格:
1341.00,2支):
Fixation/PermeabilizationDiluent按1:
3稀释;PermeabilizationBuffer(10X)用蒸馏水进行10倍稀释;
操作步骤:
1.取3支流式管,分别标记为1、2、3管,加入100μl肝素抗凝的外周血;
2.分别加入适量5μl抗体和同型对照,混匀,4°C避光保存30min;
管1:
CD4FITC、IgG1KPE
管2:
CD4FITC、CD25PE
管3:
CD4FITC、CD25PE
3.加入2ml红细胞裂解液,混匀后避光保存3-5min,300g离心5min,弃上清液;
4.加入2ml预冷的细胞染色液洗涤2次,300g离心5min,弃上清;
5.加入1ml新鲜制备、预冷的eBioscienceFixation/Permeabilization溶液,混匀,4°C避光60min;
6.加入2mlPermeabilizationbuffer洗涤2次,500g离心5min,弃上清;
7.重悬细胞沉淀于100μlPermeabilizationbuffer,加入3μlmouseserum,室温下避光孵育15min;
8.取出后不洗,分别加入5μl抗体和同型对照,混匀,4°C避光保存30min;
管1:
管2:
IgG1KAPC
管3:
FOXP3APC
9.加入2mlPermeabilizationBuffer洗涤2次,500g离心5min,弃上清;
10.加入200μl细胞染色液,1h内上机,结果分析;
流式细胞仪检CD4+T细胞pAkt/Akt蛋白表达实验流程
实验试剂、耗材
1.Anti-HumanCD4-eFlour450(eBioscienceCat.No.48-0049-42,价格:
2241.00)
2.AKTtotal+PhosphoS473FlowKit(abcamCat.No.ab126580,价格:
4495.5,1支)
3.RabbitIgGmonoclonalIsotype(abcamCat.No.ab172730,价格:
1998.75)
4.Goatanti-RabbitIgG–H&LDyLight®650(abcamCat.No.ab96902,价格:
1707.00,3支)
5.NormalRabbitSerum()
6.Methanol(实验室自配)
7.FlowCytometryStainingBuffer(实验室自配)
8.1XRBCLysisBuffer(实验室自配)
操作步骤:
1.实验前准备工作
(1).将methanol冷却至-20℃;
(2).配制1×PBS溶液,冰上冷却;
(3).采用1×PBS配制含0.05%Tween-20、1%Blockingsolution的1×WashBuffer,4℃保存不超过24hrs;
(4).采用1×PBS配制含0.05%Tween-20、10%Blockingsolution的1×blockingBuffer,4℃保存不超过24hrs;
2.流式样本处理
(1).取2支流式管,分别标记为1、2管,分别加入100μl肝素抗凝的外周;
(2).分别加入适量5μl抗体,混匀,4°C避光保存30min;
管1:
CD4FITC
管2:
CD4FITC
(3).加入2ml红细胞裂解液,混匀后避光保存3-5min,300g离心5min,弃上清液;
(4).加入2ml预冷的细胞染色液洗涤2次,300g离心5min,弃上清;
(5).加入100μl1×PBS溶液,旋转混匀,使细胞重悬;
(6).加入20%paraformaldehyde至终浓度为4%,室温下孵育15min;
(7).300g离心5min,吸除上清液,加入100μl1×PBS溶液,旋转混匀,使细胞重悬;
(8).加入900μlmethanol,-20℃下孵育至少30min;
(9).500g离心5min,吸除上清液,轻轻敲打管底至细胞沉淀松;
(10).加入1mlWashbuffer,500g离心5min,吸除上清液,轻轻敲打管底至细胞沉淀松;
(11).加入50μl1×blockingBuffer,混匀,室温下孵育15min;
(12).采用1×blockingBuffer按1:
25的比例稀释成2×PrimaryAntibody,每管加入50μl稀释后的2×PrimaryAntibody,混匀,室温下孵育至少1hrs;
管1:
MouseIgG、RabbitIgG
管2:
anti-AKT、anti-pAKT
(13).500g离心5min,吸除上清液,轻轻敲打管底至细胞沉淀松;
(14).加入1mlWashbuffer洗涤2次,500g离心5min,吸除上清液,轻轻敲打管底至细胞沉淀松;
(15).每管加入100μl采用1×blockingBuffer配制的SecondaryAntibody,室温下遮光孵育至少1hrs;
(16).500g离心5min,吸除上清液,轻轻敲打管底至细胞沉淀松;
(17).加入1mlWashbuffer洗涤2次,500g离心5min,吸除上清液,轻轻敲打管底至细胞沉淀松;
(18).加入100μlPBS溶液,重悬细胞,上机检测、分析;
流式细胞仪检CD4+T细胞pAMPK/AMPK蛋白表达
实验试剂、耗材
1.Anti-HumanCD4eFluor450(eBioscienceCat.No.11-0049-42,价格:
2241.00)
2.RabbitAnti-AMPKalpha1(phosphoT183)+AMPKalpha2(phosphoT172)antibody[EPR5683](abcamCat.No.ab133448,价格:
2997.00,1支)
3.RabbitIgG,monoclonalIsotypeControl(abcamCat.No.ab172730,价格:
2665.00,1支)
4.Goatanti-RabbitIgG–H&LDyLight®650(abcamCat.No.ab96902,价格1707.00)
5.Methanol(实验室自配)
6.FlowCytometryStainingBuffer(实验室自配)
7.1XRBCLysisBuffer(实验室自配)
操作步骤:
3.实验前准备工作
(1).将methanol冷却至-20℃;
(2).配制FACS:
含0.05%NaN3、0.5%bovineserumalbumin的1×PBS
4.流式样本处理
(1).取2支流式管,分别标记为1、2管,分别加入100μl肝素抗凝的外周血;
(2).加入2ml红细胞裂解液,混匀后避光保存3-5min裂解至澄清,375g离心5min,弃上清液;
(3).加入2mlFACS染色液洗涤2次,375g离心5min,弃上清;
(4).加入100μlFACS染色液,旋转混匀,使细胞重悬;
(5).加入20%paraformaldehyde至终浓度为4%,室温下孵育10min;
(6).加入3mlFACS液,旋转混匀,375g离心5min,弃上清;
(7).加入100μlFACS染色液,拍打混匀,使细胞重悬;
(8).分别加入适量5μl抗体,混匀,冰上避光孵育30min;
管1:
CD4FITC
管2:
CD4FITC
(9).加入3mlFACS液,旋转混匀,375g离心5min,弃上清,轻轻拍打使细胞重悬;;
(10).加入1ml预冷的methanol,4℃下孵育至少20min;
(11).加入3mlFACS液,旋转混匀,375g离心5min,弃上清;
(12).加入100μlFACS染色液,拍打混匀,使细胞重悬;
(13).每管加入5μl一抗及同型对照,混匀,室温下遮光孵育至少30min;
管1:
MouseIgG、RabbitIgG
管2:
anti-AMPK、anti-pAMPK
(14).加入3mlFACS液洗涤2次,旋转混匀,375g离心5min,弃上清;
(15).加入100μlFACS染色液,拍打混匀,使细胞重悬;
(16).每管加入5μl荧光二抗,混匀,室温下遮光孵育至少30min;
管1:
Goatanti-MouseIgG、Goatanti-RabbitIgG
管2:
Goatanti-MouseIgG、Goatanti-RabbitIgG
(17).加入3mlFACS液洗涤2次,旋转混匀,375g离心5min,弃上清;
(18).加入200μlFACS染色液,旋转混匀,上机检测;
流式细胞仪检CD4+T细胞S6K/pS6蛋白表达实验流程
实验试剂、耗材
1.Anti-HumanCD4eFlour450(eBioscienceCat.No.11-0049-42,价格:
2241.00)
2.RabbitAnti-HumanS6K1(phosphoT421+S424)antibody[E135](abcamCat.No.ab32525,价格:
2500.50,1支)
3.RabbitIgG,monoclonalIsotypeControl(abcamCat.No.ab172730,价格:
2665.00,1支)
4.Goatanti-RabbitIgG–H&LDyLight®650(abcamCat.No.ab96902,价格:
1707.00)
5.Methanol(实验室自配)
6.FlowCytometryStainingBuffer(实验室自配)
7.1XRBCLysisBuffer(实验室自配)
操作步骤:
1.实验前准备工作
(1).将methanol冷却至-20℃;
(2).配制FACS:
含0.05%NaN3、0.5%bovineserumalbumin的1×PBS
2.流式样本处理
(1).取2支流式管,分别标记为1、2管,分别加入100μl肝素抗凝的外周血;
(2).加入2ml红细胞裂解液,混匀后避光保存3-5min裂解至澄清,375g离心5min,弃上清液;
(3).加入2mlFACS染色液洗涤2次,375g离心5min,弃上清;
(4).加入100μlFACS染色液,旋转混匀,使细胞重悬;
(5).加入20%paraformaldehyde至终浓度为4%,室温下孵育10min;
(6).加入3mlFACS液,旋转混匀,375g离心5min,弃上清;
(7).加入100μlFACS染色液,拍打混匀,使细胞重悬;
(8).分别加入适量5μl抗体,混匀,冰上避光孵育30min;
管1:
CD4FITC
管2:
CD4FITC
(9).加入3mlFACS液,旋转混匀,375g离心5min,弃上清,轻轻拍打使细胞重悬;;
(10).加入1ml预冷的methanol,4℃下孵育至少20min;
(11).加入3mlFACS液,旋转混匀,375g离心5min,弃上清;
(12).加入100μlFACS染色液,拍打混匀,使细胞重悬;
(13).每管加入5μl一抗及同型对照,混匀,室温下遮光孵育至少30min;
管1:
MouseIgG、RabbitIgG
管2:
anti-S6K1、anti-pS6K1
(14).加入3mlFACS液洗涤2次,旋转混匀,375g离心5min,弃上清;
(15).加入100μlFACS染色液,拍打混匀,使细胞重悬;
(16).每管加入5μl荧光二抗,混匀,室温下遮光孵育至少30min;
管1:
Goatanti-MouseIgG、Goatanti-RabbitIgG
管2:
Goatanti-MouseIgG、Goatanti-RabbitIgG
(19).加入3mlFACS液洗涤2次,旋转混匀,375g离心5min,弃上清;
(20).加入200μlFACS染色液,旋转混匀,上机检测;
荧光定量PCR实验操作流程
实验试剂、耗材
1.无RNAse的Ethanol(SigmaCat.No.,价格:
828.00/瓶,3瓶)
2.Dynabeads®CD4Microbead(Invitrogen,Cat.No.111.45D,价格:
7755.00/Kit,1Kit)
3.淋巴细胞分离液(GPCat.No.,价格:
,3瓶)
4.RNAExtractionKit(AmbionCat.No.AM1912,价格:
3160.00,2kits)
5.1stStrandSynthesisKit(FermentasCat.No.K1632,价格:
2453.20,3kits)
6.SYBR®PremixExTaq™II(TAKARA,Cat.No.RR820A,价格:
1320.00/Kit,后期再订)
7.荧光定量PCR96孔板(Roche,Cat.No,后期再订)
操作流程
1.免疫磁珠分离CD4+T细胞
(5).将免疫磁珠翻转、混匀后,吸取25μl免疫磁珠至1支流式上样管,加入1ml磁珠洗液,混匀后放置于磁力架上,静置2min后吸除管内液体;
(6).再次加入1ml磁珠洗液,混匀后放置于磁力架上,静置2min后吸除管内液体,加入100μl磁珠洗液,混匀、备用;
(7).另取1支流式上样管,加入0.5ml无菌EDTA抗凝静脉血及2倍体积PBS,混匀并从管壁轻轻加入1ml淋巴细胞分离液,使其缓慢流入管底,于4℃下500g离心20min;
(8).小心吸取中间白色去雾状细胞层至1.5mlEP管,加入PBS至总体积1ml,旋转混匀,于4℃下6000rpm离心20min,去除上清液;
(9).加入1mlPBS洗涤后,离心、去上清液,加入200μl磁珠洗液,混匀,制备单细胞悬液;
(10).吸取单细胞悬液至装有磁珠的流式上样管中,混匀,于4℃下孵育30min,每隔10min轻轻旋转混匀;
(11).将装有磁珠和单细胞悬液的上样管置于磁力架上,放置2min后,吸除管内液体;
(12).加入1ml磁珠洗液,混匀后置于磁力架上,放置2min后,吸除管内液体;
(13).再次加入1ml磁珠洗液,混匀后置于磁力架上,放置2min后,吸除管内液体;
(14).加入200μlRNA细胞裂解液,吹打混匀,使细胞充分裂解,移至1.5mlEP管中,于-80℃保存备用;
2.总RNA抽提
(1).取RNA裂解液,加入等体积的64%的乙醇,混匀后,吸取混合液至吸附柱中,6,000rmp离心3min,去除下层滤过液体;
(2).加入350μlWashBufferI至吸附柱中,6,000rmp离心3min,去除下层滤过液体;
(3).加入350μlWashBufferII至吸附柱中,6,000rmp离心3min,去除下层滤过液体;
(4).再次加入350μlWashBufferI至吸附柱中,12,000rmp离心3min,去除下层滤过液体;
(5).加入75℃预热的30μlElutionBuffer至吸附柱中,室温下静置3min,12,000rmp离心3min;
(6).再次加入75℃预热的20μlElutionBuffer至吸附柱中,室温下静置3min,12,000rmp离心3min,弃去吸附柱,于-80℃保存备用;
3.cDNA合成操作
(1).按7μlRNA溶液、4μlddH2O、1μlOligodT引物配制混合液,于65℃下孵育5min;
(2).每管加入2μlBuf
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