生物化学课堂内容汇集.docx
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生物化学课堂内容汇集
生物化学课堂内容汇集200712
生命物质有蛋白质,核酸,糖类、脂类、维生素、激素、萜类,卜啉等。
生命物质包括基础物质(蛋白质、核酸)、能源物质(糖、脂)、活性物质(酶、维生素、激素)、次生代谢物质(抗生素、萜类、生物碱、毒素等)。
生物大分子:
蛋白质、核酸、多糖和结合态的脂质
生物化学发展简史?
静态生物化学时期(二十世纪20年代以前)、动态生物化学时期(二十世纪前半叶)、机能生物化学及分子生物学时期(二十世纪50年代以后)
生物化学的研究方法?
分离与分析。
包括结构与性质、功能、代谢及其细胞调控、改造和利用等方面的研究。
通过抽提、过滤、离心、色谱(层析)等生化技术分离出某种未知的生化物质(生化组分,比如新的未知蛋白组分,新基因片段,或新的次生代谢物),然后进行分析。
采用系列测定、X-射线衍射、波谱、质谱、圆二色散性等技术分析其结构和功能。
生物化学的特点?
所有的生命过程都发生在细胞中,生命是高度有序的;生命过程都是化学过程,都是由酶催化的(高效性、高度有序性);生命化学过程具有相对区域性(细胞中核、线体等);没有不与生命发生联系的生物化学(严格的自我调节);包括生命物质、生命现象、化学反应。
蛋白质的主要功能?
有催化、运输和贮存、机械支持、运动、免疫防护、接受和传递信息、调节代谢和基因表达等。
近年来的研究还指出,蛋白质在遗传信息的控制、细胞膜的通透性以及高等动物的记忆等方面起了重要作用。
总而言之,一切重要的生理活动都离不开蛋白质,蛋白质是生命现象的最基本的物质基础。
蛋白质化学组成?
所有蛋白质都含有C、H、O、N四种元素,大多数蛋白质还含有少量的S,有些蛋白质还含有一些其它元素,如P、Fe、Cu、Mo、I等。
各种蛋白质的含氮量接近平均16%,1克氮就相当于6.25克蛋白质,可通过测定生物样品中的含氮量计算出样品中蛋白质的含量。
蛋白质形状可分为,球蛋白和纤维蛋白。
氨基酸是蛋白质的基本结构单位,是构成蛋白质的基体。
蛋白质中的氨基酸都是L-型(Gly除外)。
通式
构型:
组成蛋白质的氨基酸除甘氨酸Gly以外都有手性碳原子,在三维空间上就有两种不同的排列方式,它们互为镜影,这两种不同的构型分别称为D-型和L-型。
蛋白质的光吸收特点?
组成蛋白质的氨基酸中,色氨酸Trp、酪氨酸Tyr和苯丙氨酸Phe对紫外光有一定的吸收,这是因为它们分子中含有芳环,是芳环的共轭双键造成的,这三个氨基酸的光吸收都在280nm附近。
紫外吸收和荧光特性:
色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸。
肽键的紫外吸收在210-230nm。
荧光法要求酶反应的底物或产物有荧光变化。
酶蛋白分子中的Tyr、Trp、Phe残基以及一些辅酶、辅基,如NADH、NADPH、FMN、FAD等都能发出荧光。
碱基的紫外吸收:
最大吸收峰在260nm附近。
氨基酸的两性解离?
氨基酸在水中的两性离子既能像酸一样放出质子,也能像碱一样接受质子,氨基酸具有酸碱性质,是一类两性电解质。
不同pH时氨基酸以不同的离子化形式存在。
在水溶液中氨基酸可以呈酸性和碱性;侧链可以在大小、形状、电荷和化学性质上不同,导致了不同蛋白质的性质各异。
氨基酸的等电点(isoelectricpoint):
氨基酸所带静电荷为“零”时,溶液的pH值称为该氨基酸的等电点(isoelectricpoint),以pI表示。
实验证明在等电点时,氨基酸主要以两性离子形式存在,但也有少量的而且数量相等的正、负离子形式,还有极少量的中性分子。
当溶液pH=pI时,氨基酸主要以两性离子形式存在。
pH pH>pI时,氨基酸主要以负离子形式存在。 半胱氨酸的-SH很活泼,很容易在空气中重新氧化形成二硫键,一般可用卤代化物对-SH进行保护。 酰基化反应: 一个氨基酸分子的羧基与另一个氨基酸分子的氨基发生反应生成酰胺键,即蛋白质化学中的肽键形成。 脱氨基反应: 是氨基酸代谢的重要反应,是氨基酸转氨作用和进一步合成或分解的基础。 反应产物一般是游离的NH3和α-酮酸。 分配层析法原理: 根据被分析的样品(如aa混合物)在两种互不相溶的溶剂中分配系数的不同而达到分离的目的。 离子交换层析法原理: 分离氨基酸时,用离子交换树脂作为支持物,利用离子交换树脂上的活性基团与溶液中的离子进行交换反应,由于各种离子交换能力不同,与树脂结合的牢固程度就不同,在洗脱过程中,各种离子以不同的速度移动,从而达到分离的目的。 这种分离主要与各种离子所带电荷有关,在电荷相同时,与极性,非极性有关。 离子交换树脂法: 化学本质: 是一种人工合成的聚苯乙烯一苯二乙烯组成的具有网状结构的高分子聚合物。 阳离子交换树脂: 活性基团是酸性的。 如,磺酸基-SO3H(强酸型)羧基-COOH(弱酸型)。 阴离子交换树脂: 活性基团是碱性的。 如,季胺基-N+(CH3)3OH- 电泳法: 在电解质溶液中,带电粒子在外加电场的作用下,向与其本身电荷相反电极方向移动的现象。 目前,电泳技术已被广泛应用于蛋白质、核酸和氨基酸等物质的分离和鉴定。 电泳技术优点: 快速、准确、重现性好。 移动方向: 带电性质决定。 泳动度μ: 带电颗粒在单位电场强度下的移动速度。 影响μ的因素: 颗粒本身的带电、大小、形状;外界因素,电场强度E、pH、离子强度I、电渗、缓冲液粘度及温度等。 醋酸纤维素薄膜电泳: 利用醋酸纤维素薄膜做固体支持物的电泳技术,和纸上电泳相似并且在其基础上发展起来的,该电泳技术具有比纸电泳电渗小,分离速度快、样品用量小、而分辨率高、分离清晰等优点。 薄层电泳: 将支持物与缓冲液调制成适当厚度的薄层进行电泳。 常用支持物: 淀粉、琼脂、纤维素粉、硅胶等。 凝胶电泳支持物: 多孔凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶等。 具有电泳和分子筛的双重作用,分辨力高。 最常用的。 根据凝胶支柱形状不一可分为垂直管型盘状电泳、垂直板型电泳;还可分为连续、不连续、梯度、SDS凝胶电泳。 琼脂糖凝胶电泳的特点: 琼脂糖主要通过氢键而形成凝胶。 电泳时因凝胶含水量大(98~99%),近似自由电泳,固体支持物的影响较少,故电泳速度快,区带整齐。 而且由于琼脂糖不含带电荷的基团,电渗影响很少,是一种较好的电泳材料,分离效果较好。 聚丙烯酰胺凝胶电泳的作用原理、优点和用途? 聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的凝胶,具有机械强度好、弹性大、透明、化学稳定性高、无吸附作用和电渗作用、设备简单、样品最小(1-100μg)、分辨率高等优点。 并可通过控制单体浓度或单体与交联剂的比例,聚合成不同孔径大小的凝胶,可用于蛋白质、核酸等分子大小不同物质的分离、定性和定量分析。 还可结合解离剂十二烷基硫酸钠(SDS),以测定蛋白质亚基的相对分子质量。 SDS-凝胶电泳: 聚丙烯酰胺凝胶系统中加入SDS,蛋白质电泳迁移率取决于其分子量,而与形状及所带电荷无关。 加入SDS和巯基乙醇后,巯基乙醇使蛋白质二硫键还原,SDS使氢键、疏水键打开,并结合到蛋白质分子上形成蛋白质-SDS。 SDS的重要作用? 凝胶电泳的操作要点? 凝胶制备,电极缓冲液,样品处理及加样,电泳,染色与固定,脱色,分析。 电渗(electroosmosis): 在高电压作用下双电层中的水合阳离子引起流体整体地朝负极方向移动的现象。 肽: 由两个或两个以上的氨基酸通过肽键连接而形成的化合物。 氨基酸之间通过肽键连接形成的链称肽链。 有链状、环状和分支状。 肽链书写方式: N端→C端;命名: 根据氨基酸组成,由N端→C端命名。 肽与氨基酸一样具有酸、碱性质,它的解离主要取决于肽链的末端氨基、末端羧基和侧链R基。 肽的等电点: 肽所带净电荷为“零”时,溶液的pH值。 甲硫氨酸中S的孤对电子进攻溴化氰的-Br,最终生成高丝氨酸内酯等。 特点是专一性强,产率高。 特别有意义的是,一般多肽中所含的甲硫氨酸数目较少且分布较分散,可以得到较理想的小肽段。 谷胱甘肽(glutathione,GSH)的生物学功能: 保护体内蛋白质或酶分子中的巯基免遭氧化,使其处于活性状态;还原细胞内产生的H2O2,使其变成H2O;GSH的巯基有嗜核特性,保护机体免遭毒物损害。 蛋白质分类: (一)根据蛋白质在生物体内的作用分为结构蛋白质和功能蛋白质(活性蛋白质和信息蛋白质); (二)根据蛋白质分子的形状分为球状蛋白质(轴比10)和纤维状蛋白质;(三)根据组成和溶解度分为单纯蛋白质和结合蛋白质;(四)根据功能分为活性蛋白质和非活性蛋白质。 单纯蛋白质? 例举出3类,说明其特点。 也称简单蛋白质,完全由氨基酸组成的蛋白质。 例如, (1)清蛋白或白蛋白(albumin),溶于水及稀盐、稀酸或稀碱溶液,如血清清蛋白; (2)球蛋白(globulin),不溶于水而溶于稀盐溶液,如血清球蛋白;(3)谷蛋白(glutelin),不溶于水、醇及中性盐溶液,但溶于稀酸、稀碱,如米谷蛋白;(4)醇溶谷蛋白(prolamine),不溶于水,但溶于70%-80%乙醇,如玉米醇溶蛋白;(5)组蛋白(histone),溶于水及稀酸溶液,分子中含Arg、Lys较多,呈(弱)碱性,如小牛胸腺组蛋白;(6)精蛋白(spermatin),溶于水及稀酸溶液,分子中含碱性氨基酸特别多,呈(强)碱性,如鲑精蛋白;(7)硬蛋白(scleroprotein),不溶于水、盐、稀酸、稀碱溶液。 如胶原蛋白、角蛋白、丝蛋白、弹性蛋白等。 结合蛋白质(conjugatedprotein): 由蛋白质和非蛋白质两部分组成,以共价键。 根据非蛋白质即辅基的不同可分为: (1)糖蛋白(glycoprotein),胶原蛋白; (2)脂蛋白(lipoprotein),血浆脂蛋白;(3)核蛋白(nucleoprotein),核糖体;(4)磷蛋白(phosphoprotein),酪蛋白;(5)金属蛋白(metalloprotein),铁蛋白;(6)血红素蛋白(hemoprotein),血红蛋白;(7)黄素蛋白(flavoprotein),琥珀酸脱氢酶。 活性蛋白质: 包括生命活动过程中一切有活性的蛋白质以及它们的前体分子,绝大多数蛋白质属于活性蛋白质,包括酶、激素蛋白、运输蛋白(转运蛋白)、贮存蛋白、运动蛋白、保护或防御蛋白、受体蛋白、控制生长和分化蛋白、毒蛋白、膜蛋白等。 非活性蛋白质: 对生物体起支持和保护作用,主要指硬蛋白包括胶原蛋白、角蛋白、丝蛋白、弹性蛋白等。 蛋白质的结构包括哪几个方面? 氨基酸的组成和含量;氨基酸的连接方式;氨基酸的排列顺序;空间结构(二级结构、超二级结构和结构域、三级结构、四级结构的三度空间排列称蛋白质的空间结构、高级结构、三维结构或构象)。 蛋白质的二级结构(超二级结构、结构域)、三级结构和四级结构,称为蛋白质的高级结构或空间结构。 蛋白质的一级结构决定高级结构。 高级结构决定于一级结构中氨基酸的组成和顺序。 蛋白质的一级结构: 指蛋白质多肽链中氨基酸的排列顺序(sequence),一级结构的主要连接键是肽键,还有二硫键。 是各种α-氨基酸以一定的比例、按一定的顺序,通过肽键连接而成的多肽链。 蛋白质的二级结构指蛋白质多肽链在空间的走向和排布(折叠和盘绕)方式。 主要有α-螺旋和β-折叠两种形式。 肽键中羰基和氨基等基团的高极性使C-N键具有部分双键性质,使得肽键单元有刚性和平面性,尽管相邻肽键间存在自由旋转。 这种极性有利于在适当的空间和方向上的肽键单元间形成氢键,因此多肽链能够折叠成几种由氢键维持的规则结构。 蛋白质分子结构中的化学键(维持蛋白质构象的化学键): 共价键C-C、C-H、C-O、C-S、O-H、S-H;肽键;维持蛋白质空间结构的次级键(氢键、离子键或盐键、疏水键、范德华引力、二硫键、酯键、配位键)。 肽键peptidebond,肽键平面(或酰胺平面,amide plane) : 肽键中的四个原子和它相邻的两个α-碳原子处于同一平面,形成了酰胺平面,也称肽键平面。 肽键中-C-N-键的性质介于单、双键之间,具有部分双键的性质,因而不能旋转,这就将固定在一个平面之内(共轭效应导致键长平均化)。 肽链中只有α碳原子所形成的单键能够旋转,该单键的旋转决定两个肽键平面的位置关系,肽键平面成为肽链盘曲折叠的基本单位。 肽键中的C-N既具有双键性质,就会有顺反不同的立体异构,已证实CO和NH处于稳定的反式构型(生理条件下不解离)。 α-螺旋结构的要点: ①蛋白质多肽链像螺旋一样盘曲上升,每3.6个氨基酸残基螺旋上升一圈,每圈螺旋的高度为0.54nm,每个氨基酸残基沿轴上升0.15nm,螺旋上升时,每个残基沿轴旋转100º。 ②在同一肽链内相邻的螺圈之间形成氢链。 ③α-螺旋有右手螺旋和左手螺旋之分,天然蛋白质绝大部分是右手螺旋,到目前为止仅在嗜热菌蛋白酶中发现了一段左手螺旋。 α-螺旋的稳定性主要靠氢键来维持。 一些侧链基团虽然不参与螺旋,但他们可影响α-螺旋的稳定性。 α-螺旋在什么地方盘绕? 结构松散的不完整部位。 盘绕是有序的还是无序的? 有序的。 对某一种蛋白质而言,α-螺旋的盘绕是有方向性的。 β-折叠: ①β-折叠主链骨架以一定的折叠形式形成一个折叠的片层。 ②在两条相邻的肽链之间形成氢链。 由肽键N-H和C=O基团与肽链上另一段互补的基团间形成氢键③β-折叠有平行和反平行的两种形式④每一个氨基酸在主轴上所占的距离,平行的是0.325nm,反平行的是0.35nm。 β-转角(β-turn): 指蛋白质分子的多肽链经常出现180º的回折,在回折角上的结构就称β-转角,也称发夹结构,或称U形转折。 由第一个氨基酸残基的C=O与第四个氨基酸残基的N-H之间形成氢键。 无规卷曲: 指没有规律性的肽链结构,但许多蛋白质的功能部位常常埋伏在这里。 蛋白质的超二级结构: 指二级结构的基本结构单位(α-螺旋,β-折叠等)相互聚集,形成有规律的二级结构的聚集体。 已知的超二级结构主要有αα,βxβ,β-曲折和β-折叠筒等。 蛋白质的结构域: 指在较大的球状蛋白质分子中,多肽链往往形成几个紧密的球状构象,彼此分开,以松散的肽链相连,此球状构象。 结构域是球状蛋白质的折叠单位,多肽链折叠的最后一步是结构域的缔合。 一般来说,大的蛋白质分子可以由2个或更多个结构域组成。 结构域有时也称功能域,功能域是指有功能的部分。 功能域可以是一个结构域,也可以是两个或两个以上的结构域组成。 从功能的角度耒看,酶蛋白的活性中心往往位于结构域之间,因为连接各个结构域的常常是一条松散的肽链,使结构域在空间上摆动比较自由,容易形成适合底物结合的空间。 蛋白质的三级结构: 指在二级结构基础上,多肽链再进一步折叠盘绕成更复杂的空间结构(球状、颗粒状等),三级结构主要靠非共价键(疏水相互作用、氢键、范德华力、盐键)来维持。 蛋白质的三级结构是在二级结构和连接进一步折叠成的三维构象的组织水平,即多肽的三级结构。 在合适的条件下,大多数多肽均能自发折叠成正确的三级结构,因为这通常是序列能量最低的构象。 要实现正确折叠需“蛋白质伴侣”的参与,其作用是蛋白质合成结束前阻止新生多肽的错误折叠。 折叠过程中带有亲水侧链的氨基酸主要位于蛋白质外部,可与水或溶剂离子作用;而疏水氨基酸则主要位于蛋白质内部,使得结构总体上是稳定的。 从目前对球状蛋白质二、三级结构研究的资料来看,它们有一些共同的特点: (1)在球状蛋白质分子中,一条多肽链往往通过一部分α-螺旋,一部分β-折叠,一部分β-转角和无规卷曲等使肽链折叠盘绕成近似球状的构象。 (2)球状蛋白质的大多数极性侧链总是暴露在分子表面形成亲水面,而大多数非极性侧链总是埋在分子内部形成疏水核。 (3)球状蛋白质的表面往往有内陷的空穴,空穴周围有许多疏水侧链,是疏水区,这空穴往往是酶的活性部位或蛋白质的功能部位。 所以,对蛋白质结构、功能及相互作用的研究,重点就在对疏水性区域的研究。 通过多种使蛋白质变性(全部或者部分破坏其高级结构)的方法,结合光谱分析等手段(荧光探针法、疏水结合法、疏水色谱和疏水分级法等)开展。 蛋白质的四级结构蛋白质的亚基聚合成大分子蛋白质的方式。 蛋白质多由1-12个亚基构成。 一般来说,亚基不具有生物活性(即使有也很小),只有当这些亚基聚合成一个完整的蛋白质分子后,才具有生物活性。 亚基: 指一条多肽链或以共价链连接在一起的几条多肽链组成的蛋白质分子的最小共价结构单位。 亚基属于三级结构。 稳定三级结构的力同样可以维系亚基,包括不同肽链间中半胱氨酸间的二硫键。 重要性: 可构成很大的蛋白质分子;通过亚基复合不同活性于一个整体,赋予一个蛋白质以更多的功能。 一条多肽链的一端含有一个游离的氨基,另一端含有一个游离的羧基。 所以,一般肽链中形成的肽键数比氨基酸分子数少一个。 每两个分子的氨基酸脱水缩合反应成一个肽键失去一个水分子,肽键数等于失去的水分子数等于氨基酸数减形成的肽链数。 氢键的破坏: 脲及胍等更能形成氢键的物质,均容易破坏氢键,导致蛋白质变性。 脲及胍等使蛋白质变性 过高或过低的pH值、高浓度的盐,都可破坏蛋白质分子中的离子键。 强酸、强碱、盐使蛋白质变性 络合/螯合剂的加入可以使蛋白质结构破坏或失活 非共价键破坏: 用变性剂(脲、胍、酸、碱、盐等) 二硫键的破坏: 氧化还原法(过甲酸、巯基乙醇);过量碘乙酸或二硫苏糖醇等保护 有的蛋白质仅有三级结构,如鲸肌红蛋白。 加热血红蛋白则粘度,说明有球状受热变成线性分子;吸收光谱,因为有基团伸展出来。 镰刀状红细胞贫血病: 是最早被认识的一种分子病。 这种疾病在非洲的某些地区十分流行,它是由于遗传基因突变导致血红蛋白分子中氨基酸残基被更换所造成的。 最清楚地反映出蛋白质的氨基酸序列在决定它的二、三、四级结构及其生物功能方面的重大作用。 分子病: 即分子结构、特别是蛋白质分子结构发生遗传性变化而造成的病变。 高等生物的胰岛素,它是一种分泌蛋白质,具有信号肽。 氧合作用显著改变Hb的四级结构,血红素铁的微小移动导致血红蛋白构象的转换(从T态→R态)。 Hb的运O2功能通过R态和T态构象的互变实现。 别构效应: 亦称变构效应,含亚基的蛋白质分子由于一个亚基构象的改变而引起其余亚基以至整个分子构象、性质和功能发生变化。 蛋白质的空间结构与功能的关系: 1.同功能蛋白质中氨基酸顺序的种属差异。 不同来源的同功能蛋白质,化学结构基本相同。 有差异则表现其种属的特异性。 如,胰岛素的差异 2.在生物进化过程中同功能蛋白质,结构上变化。 亲缘关系 3.蛋白质结构变化引起功能变化。 分子病,结构改变导致功能改变或丧失 4.一级结构的局部断裂与蛋白质的激活。 5.蛋白质构象与功能相关。 一定构象或者构象改变下,功能体现。 结构的进化引起功能的进化。 6.蛋白质结构与功能的进化。 蛋白质结构与功能相互依赖、相互制约。 蛋白质的性质: (1)胶体性质。 由于蛋白质分子很大,在水中形成胶体溶液。 蛋白质主要是指球状蛋白质有亲水面,它的亲水基团都在表面,因此与水有很大的亲和力,成为亲水胶体。 蛋白质的亲水胶体溶液是相当稳定的。 一方面由于蛋白质表面的亲水基团会吸引它周围的水分子,使水分子定向排列在它的周围,形成“水化层”。 另一方面由于蛋白质在非等电点时带有同种电荷,同种电荷相斥,也使蛋白质分子保持一定的距离而不会聚合。 水化作用、电荷排斥作用(表面电荷、水化膜) (2)蛋白质和氨基酸一样,也具有两性和等电点。 不同的pH条件下,蛋白质可主要以正离子、负离子或偶极离子形式存在。 氨基、羧基、巯基-SH、二硫键-S-S-、胍基的多价解离。 蛋白质等电点: 在某一pH值时,蛋白质所带的正电荷与负电荷恰好相等,即净电荷为零,此时溶液的pH值就是蛋白质的等电点。 每种蛋白质都有它特有的等电点,这也是鉴别蛋白质的指标之一。 电荷主要取决于可解离基团、数目及pH。 等电点和蛋白质分子中所含氨基酸的种类有关。 等电点时蛋白质的特征: 导电率最低、渗透压最低、溶解度最低、极性最小。 人体大部分蛋白质的pI点为5.0左右,因此在生理pH7.4电环境下带负电荷。 (3)蛋白质的变性: 指蛋白质受物理或化学因素的影响,使蛋白质分子原有的特定的空间结构发生改变,从而导致蛋白质性质的改变以及生物活性的丧失。 理论: 吴宪提出,肽链从天然的紧密有序结构→松散无序的结构。 变性的因素: 物理因素有加热、紫外线、X-射线、振动、搅拌、超声波等;化学因素有强酸、强碱、有机溶剂、蛋白变性剂(尿素、盐酸胍、三氯乙酸)、重金属盐等。 变性蛋白质的特性: (1)生物活性全部或部分丧失; (2)一些侧链基团暴露,可滴定基团增加;(3)一些物理化学性质的改变。 如,溶解度降低,粘度增大,容易沉淀等。 (4)生化性质的改变。 变性的可逆性(可逆变性才可能部分或完全复性)。 变性实质是空间构象的改变,影响次级键,二级以上结构改变,一级结构不变。 (4)蛋白质的复性renaturation: 蛋白质变性程度较轻,去除变性因素后,有些蛋白质仍可恢复其原有的构象和功能。 (5)蛋白质的凝固作用: 变性蛋白质互相凝聚或互相穿插在一起的现象称蛋白质的凝固。 变性蛋白质结成絮状的不溶解物后,再加热可变为比较坚固凝块的现象。 蛋白质的不可逆沉淀一定是蛋白质发生了变性。 沉降常数(沉降系数)S: 当沉降界面以恒速移动时,单位离心场中的沉降速度。 1S=10-13秒 蛋白质、多肽与α-氨基酸都能与水合茚三酮一起加热,生成蓝紫色物质。 细胞破碎: 机械方法如高速组织捣碎器、玻璃匀浆器(低温,特点是动物样品)、在研缽中或球磨机上磨等。 还有超声法、反复冻融法、加溶菌酶自溶等方法。 根据蛋白质溶解性用适当溶剂来抽提,总的原则是用制备的蛋白质可溶的溶剂来抽提。 盐析法: 在蛋白质抽提液中加入一定量的中性盐,使蛋白质沉淀下来常用的中性盐(NH4)2SO4、NH4Cl等。 利用蛋白质在等电点时溶解度最小的特性,调溶液的pH,尽量接近它的等电点,而使蛋白质沉淀。 透析和超滤法: 最近几年发展起来的一种新技术,半透膜可将蛋白质与小分子分开,但是不能将蛋白质之间分开。 用于分离蛋白质的最重要的特性有: 分子大小、电荷、疏水性、亲和性 离子交换层析: 根据蛋白质所带电荷的不同进行分离纯化。 常用的阳离子交换剂为羧甲基纤维素(CM-C),阴离子交换剂为二乙氨基乙基纤维素(DEAE-C)。 凝胶过滤也称分子排阻层析、分子筛层析: 根据蛋白质分子大小不同来分离纯化蛋白质的一种方法。 大分子先、小分子后,洗下;常用的凝胶有葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶。 亲和层析: 根据蛋白质能与特异的配体结合而设计的方法。 这种分离纯化方法由于专一性强,理论上可以从复杂的体系中一步提取所需的物质。 SDS可将蛋白质解离成亚基,所以测出的分子量是亚基的分子量。 Rf: 电泳中样品移动距离与前沿所到的距离之比值 蛋白质测序: 蛋白质在测序之前首先需要经过水解,得到小肽,然后用自动蛋白质测序仪用Edman降解法测定氨基酸序列。 X-晶体衍射: X射线可与蛋白质中的电子作用得到特有的衍射图谱,可用于确定晶体中原子的位置。 酶: 是生物催化剂,参与新陈代谢(物质、能量);酶是催化功能的蛋白质。 酶具有一般催化剂的特性。 酶作为生物催化剂的特性: (1)高的催化效率; (2)高的专一(特异)性,酶的特异性是调节代谢方向及蛋白质的水解、生成;旋光异构特异性是蛋白质水解酶只对L-氨基酸作用。 (3)温和的反应条件;(4)可催化某些特异的反应;(5)酶的催化活力在体内受到严格调控;(6)酶的催化活力与辅酶、辅基和金属离子有关。 酶的专一性(特异性): 一种酶仅作用于一种或一类化合物或一定的化学键,催化一定的化学反应并产生一定的产物。 抗体酶: 指具有催化功能的抗体分子,在抗体分子的可变区(即肽链的N端)是识别抗原的活性区域,这部分区域被赋予了酶的属性。 根据酶催化反应类型的分类(6类): 氧化还原酶类、转移酶类、水解酶类、裂合酶类、异构酶类、连接酶类或合成酶类 单体酶: 一般是一条肽链组成,多是催化水解酶。 如,溶菌酶、羧肽酶A 寡聚酶: 两条及以上亚基,大多数以聚合形式是活性型,代谢调控作用
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