基础生物学实验六实验手册.docx
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基础生物学实验六实验手册
襄樊学院
化学工程与食品科学学院生物系
基础生物学实验六实验手册
目录
一、植物DNA的提取2
二、琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段4
三、聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段6
四、DNA片段回收及与载体连接8
五、大肠杆菌感受态细胞制备与转化10
六、碱裂解法小量提取质粒及质粒酶切12
七、细胞特异性染色15
八、动物细胞的基本形态观察和细胞计数19
九、细胞凝集反应和细胞膜通透性的观察23
十、线粒体和液泡的超活染色与观察26
十一、聚乙二醇(PEG)介导的细胞融合28
十二、细胞骨架系统的显示与观察30
十三、植物细胞的有丝分裂染色体标本制片及观察33
十四、蚕豆根尖微核检测技术36
一、植物DNA的提取
【目的要求】
学习提取和纯化高等植物总DNA的方法,理解其原理。
【基本原理】
通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞,由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响,在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。
在液氮中研磨,材料易于破碎,并减少研磨过程中各种酶类的作用。
十二烷基肌酸钠(sarkosyl)、十六烷基三甲基溴化铵(hexadyltrimethylammomumbromide,简称为CTAB)、十二烷基硫酸钠(sodiumdodecylsulfate,简称SDS)等离子型表面活性剂,能溶解细胞膜和核膜蛋白,使核蛋白解聚,从而使DNA得以游离出来。
再加入苯酚和氯仿等有机溶剂,能使蛋白质变性,并使抽提液分相,因核酸(DNA、RNA)水溶性很强,经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。
上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀,沉淀DNA溶于TE溶液中,即得植物总DNA溶液。
【实验用品】
1、实验材料
幼嫩叶子
2、器材
移液器,台式高速离心机,水浴锅,陶瓷研钵,1.5ml离心管,。
3、药品
2%CTAB抽提缓冲溶液:
CTAB4gNaCl16.364g1MTris-HCl20ml(PH8.0)0.5MEDTA8ml,先用70mlddH2O溶解,再定容至200ml灭菌,冷却后0.2-1%2-巯基乙醇(400ul)
3、24:
1/氯仿:
异戊醇
4、RnaseA母液
5、其它试剂:
异丙醇、TE缓冲液,无水乙醇、70%乙醇。
【方法步骤】
1、取冷冻保存或新鲜的植物材料,液氮下研磨,然后转移到液氮预冷的1.5ml离心管中,加入500μlDNA提取缓冲液,65℃水浴1hr‘每隔15min上下颠倒一次;
2、从水浴中取出后,冷却至室温,加入500μl24:
1氯仿:
异戊醇,上下轻柔颠倒混匀;
3、12,500rpm离心5分钟,取上清,加入500μl24:
1氯仿:
异戊醇,上下轻柔颠倒混匀;
4、如果中间层蛋白质过多,重复步骤2;
5、12,500rpm离心5分钟,取上清,加入2.5倍体积的无水乙醇,冰箱冷藏沉淀30分钟;
6、12,500rpm离心5分钟,弃上清,用70%乙醇洗涤沉淀,12,500rpm收集沉淀;
7、干燥沉淀,用50μl含有RnaseA的TE溶解沉淀;
【实验结果】
【实验报告】
二、琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段1
【目的要求】
学习水平式琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术
【基本原理】
琼脂糖凝胶电泳技术是DNA分子片段的分子量测定和分子构象研究以及DNA分离纯化的重要实验手段。
DNA分子在琼脂糖凝胶电泳中泳动时受到电场驱动力和凝胶的摩擦阻力。
一般情况下,单位长度双链DNA带有几乎相等的电荷,故在一定电场强度下,DNA分子的迁移速度取决于凝胶的摩擦阻力,即DNA分子本身的大小和构型。
DNA分子的迁移速度与相对分子量的对数值成反比关系,具有不同长度的DNA片段由于其泳动速度不同而得到分离。
具有相同一级结构但构型不同的DNA分子也可以通过这种方法进行分离。
溴化乙锭(EB)是一种荧光染料,在紫外光照射下可发出波长590nm的红色荧光,DNA分子与EB形成荧光络合物后,其发射的荧光比原来要增强数十倍,常用来观察凝胶中DNA条带的位置。
【实验用品】
1、实验材料
上次实验提取的DNA
2、器材
刻度量筒、玻璃棒、三角烧瓶、移液枪及枪头、微波炉或沸水浴、凝胶灌制平板(塑料或玻璃制成)、凝胶样品梳、稳压稳流电泳仪、凝胶成像系统、电源等。
3、药品
琼脂糖凝胶(0.7~1.5%,琼脂糖粉末与1×TAE配成),TAE(Tris-乙酸盐,EDTA)电泳缓冲液[50×浓缩贮存液:
Tris碱242g;冰醋酸57.1mL;0.5mol/LEDTA(pH8.0),100mL;加600mL、蒸馏水,剧烈搅拌,加蒸馏水至1000mL,]。
溴化乙锭(EB)贮存液(10mg/mL):
在100mLH2O中加入1g溴化乙锭用磁力搅拌器搅拌几个小时,然后转至棕色瓶中,4℃贮存(溴化乙锭是强诱变剂,称量时需要戴手套和口罩,万一接触了溴化乙锭,立即用大量的水冲洗)。
10×加样缓冲液:
0.25%溴酚蓝、0.25%二甲苯青FF、15%的Ficoll水溶液、0.1mol/LNa2EDTA,pH8.0、1.0%SDS。
【方法步骤】
1、将琼脂糖电泳的磨具置一个水平台上。
2、根据被分离DNA片段的大小用电泳缓冲液配制适宜浓度琼脂糖溶液:
应准确称量琼脂糖干粉将其加入到盛有已定量电泳缓冲液的三角烧瓶或玻璃瓶中,用玻璃棒搅拌均匀后放入沸水浴或微波炉中加热至琼脂糖熔化。
3、待凝胶稍微冷却后,将胶缓慢倒入模具中,胶厚度以3~5mm为宜。
4、让凝胶溶液完全凝结,室温下30~45min,待胶略凝结时放入4℃冰箱可大大缩短凝结时间。
小心拔出梳子,将凝胶安放到电泳槽内,加样孔一侧靠近阴极(黑末端)。
5、向电泳槽加入电泳缓冲液,刚好没过凝胶约1mm。
6、取适量的DNA样品与10×加样缓冲液混合,然后用移液枪将样品加入样品孔内。
7、加样完毕后,关上电泳槽盖,接好电极插头。
DNA应向阳极(红色插头)侧泳动。
给予1~5V/cm的电压,其中距离以阳极至阴极之间的测量为准。
若电极插头连接正确,阳极和阴极由于电解作用将产生气泡。
8、电泳时间的选择取决于胶的长度、电压和DNA片段的大小。
胶越长,电压越低,DNA片段越大,所需时间就越长。
然而使用高压时,大的DNA片段的分辨率很低,电泳出的条带不清晰。
9、当DNA样品在凝胶中迁移足够距离时,关上电源并取出样品放入事先配好的EB溶液中染色5~7min(EB见光分解,应置于暗室中),在紫外分析仪上观察并可用数码相机进行拍摄。
【实验结果】
【实验报告】
三、聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段
【目的要求】
掌握PCR实验的操作方法,并理解其原理。
【基本原理】
类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
PCR由变性--退火(复性)--延伸三个基本反应步骤构成:
①模板DNA的变性:
模板DNA经加热至93℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;②模板DNA与引物的退火(复性):
模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;③引物的延伸:
DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,于72℃左右,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。
每完成一个循环需2~4分钟,2~3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
【实验用品】
1、实验材料
第一次实验提取的DNA
2、器材
PCR仪、台式离心机、移液器、PCR管、凝胶灌制平板(塑料或玻璃制成)、凝胶样品梳、稳压稳流电泳仪、凝胶成像系统、电源等。
3、药品
Taq酶、10x扩增缓冲液、dNTP、正向引物(10pmol/μl,溶于无菌水中,贮于-20℃)、反向引物(10pmol/μl,溶于无菌水中,贮于-20℃)、无菌水、50xTAE、EB、加样缓冲液。
【方法步骤】
1、在PCR管中加入适量缓冲液、模板DNA、dNTP,正向引物、反向引物和Taq酶,将上述物质混合均匀后,短暂离心收集于管底。
2、设定PCR程序,把样品放入PCR仪进行扩增。
3、扩增结束后,琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。
标准PCR反应体系
___________________________________________________
10XPCRbuffer5.0μl
10mMdNTP1.0μl
正向引物1.0μl
反向引物1.0μl
模板2.0μl
TaqDNA聚合酶0.5μl
ddH2O39.5μl
____________________________________________________
总体积50μl
【实验结果】
【实验报告】
四、DNA片段回收及与载体连接
【目的要求】
掌握DNA片段回收及与载体连接的方法及原理。
【基本原理】
质粒、噬菌体等经酶切,电泳;PCR产物经电泳后,常常需要对一些DNA电泳片段进行回收和纯化,用于亚克隆、探针标记等。
DNA回收和纯化常用方法有压碎法、低融点琼脂糖法、冻融法等,也有现成的试剂盒供应。
利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收DNA,快速,而且回收率高。
其原理是融化含有目的片段的琼脂糖后,让DNA吸附在硅基质材料上,同时去除蛋白质、其他有机化合物、无机盐离子及寡核苷酸等杂质。
某些PCR产物3’端带有一个凸出的dAMP的特性,构建3’端带有凸出的dTMP的载体。
一般采用的方法是先把载体用某种限制性内切酶消化成平头,在70℃或72℃下在只加入一种dNTP、即dTTP的反应体系中用TaqDNA聚合酶处理半小时(也有人报道处理1~2小时能提高克隆效率,这样加T反应会更彻底)。
也可以用末端转移酶来完成加T反应。
载体自连、PCR产物串连可以忽略。
如果使用ddTTP,效果会更好。
这种方法一般称为加T/A法克隆,比平头连接效率高50~100倍。
【实验用品】
1、实验材料
上次实验的PCR产物。
2、仪器
台式高速离心机、低温水浴锅、水浴锅。
3、药品
琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、T-载体连接试剂盒、无水乙醇,无菌水。
【方法步骤】
1、紫外灯下仔细切下含待回收DNA的凝胶,置1.5ml离心管中,称重。
2、加入3倍体积的溶胶液(每100mg凝胶加BufferQG300μl),置50℃水浴10min,其间不断温和地上下翻转离心管,以确保胶块充分溶解。
若回收片段小于500bp或大于4kb,则需加入异丙醇(每100mg凝胶加异丙醇100μl),混匀。
3、将小柱放在2ml收集管上,将上述溶液加于柱上。
13000rpm离心1min,弃去收集管中液体,将吸附柱重新放入收集管中。
4、向吸附柱中加入700μlBuffer漂洗液,13000rpm离心1min,倒掉废液,将吸附柱重新放入收集管中。
5、向吸附柱中加入500μl漂洗液,13,000rpm离心1min,倒掉废液。
6、将离心吸附柱放回收集管中,13000rpm离心2min,尽量除去漂洗液。
将吸附柱开盖置于室温1-2min,彻底晾干,以防止残留的漂洗液影响下一步的实验。
7、将吸附柱放到一个干净离心管中,向吸附膜中间位置悬空滴加50μl65-70℃预热的洗脱缓冲液,室温放置2min,13,000rpm离心2分钟收集DNA溶液。
取5μl进行电泳检测。
8、将回收产物按照T-载体连接试剂盒说明书与T-载体进行连接。
【实验结果】
【实验报告】
五、大肠杆菌感受态细胞制备与转化
【目的要求】
掌握大肠杆菌感受态的制备及转化的原理,熟悉实验的具体操作步骤,掌握无菌操作技术。
【基本原理】
所谓感受态是指受体细胞处于容易吸收外源DNA的一种生理状态,可以通过物理与化学方法诱导形成,也可以自然形成,在基因工程技术中通常采用诱导的方法。
用于转化的受体菌细胞一般是限制-修饰系统(Restriction-Modification)缺陷的变异株,以防止对导入的外源DNA的切割,用符号R-M-表示。
其基本原理是:
细菌处于0℃的CaCl2低渗溶液中,会膨胀成球形,细胞膜的通透性发生变化,转化混合物中的质粒DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物黏附于细胞表面,经过42℃短时间的热激处理,促进细胞吸收DNA复合物,在丰富的培养基上生长数小时后,球状细胞复原并分裂增殖,在选择培养基上可获得所需的转化子。
【实验用品】
1、实验材料
Top10受体菌,上次实验的连接产物。
2、仪器与耗材
恒温摇床,电热恒温培养箱,台式高速离心机,无菌工作台,低温冰箱,恒温水浴锅,制冰机,分光光度计,微量移液枪;
1.5mL与0.5mLEppendorf管、tip头、烧杯、量筒。
镊子、试管三角瓶、玻璃涂棒、酒精灯、无菌牙签、吸水纸,一次性塑料手套等。
3、药品
LB培养基:
蛋白胨10g/L,酵母提取物5g/L,NaCl10g/L,琼脂粉15g/L(固体培养基);
氨苄青霉素贮存液:
浓度50-100mg/mL;
含有抗菌素的LB平板培养基:
将配置好的LB固体培养基高压灭菌后,冷却到60度左右,加入氨苄青霉素(终浓度为50µg/mL浓度50-100µg/mL);
0.1mol/LCaCl2,含15%甘油的0.05mol/LCaCl2。
【方法步骤】
1.挑取一Top10单菌落于5mlLB培养液中37℃过夜培养;
2.取其中500ul菌液于一含50mlLB培养液的锥形瓶中,37℃振摇培养至OD600值达到0.5-0.6之间;
3.取50ml菌液置于离心管内,4℃4500g离心5分钟;
4.加入30ml,100mM的冰冷CaCl2溶液,摇荡重悬细胞,冰浴30分钟;
5.4℃4500g离心5分钟收集细胞后,加2ml,100mM的冰冷CaCl2溶液轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液;
6.感受态细胞分装成200μl的小份,暂且不用的贮存于-70℃可保存半年。
取其中一份进行转化;
7.向转化管中加入DNA(不超过10ul),轻度摇晃混合后于冰上放置30分钟;
8.将上述混合物转移到预热到42℃的水浴锅中,热休克90秒(不要摇动试管),然后将试管迅速转移到冰浴,冷却1-2分钟;
9.向管内加入500ul的LB培养液。
然后37℃培养45分钟;
10.取适量体积的转化细胞转移到含有适当抗生素的LB固体平板上,用灭过菌的玻璃棒涂布均匀。
室温放置几分钟;
11.倒置平板于37℃培养12-16个小时。
【实验结果】
【实验报告】
六、碱裂解法小量提取质粒及质粒酶切
【目的要求】
掌握碱裂解法小量提取质粒的原理和方法,学习质粒酶切的原理。
【基本原理】
碱裂解法是较常用的提取的方法。
其优点是收获率高,适于多数的菌株,所得产物经纯化后可满足多数的DNA重组操作。
十二烷基磺进行质粒的小量制备。
十二烷基磺酸钠(SDS)是一种阴离子表面活性剂,它既能使细菌细胞裂解,又能使一些蛋白质变性。
用SDS处理细菌后,会导致细菌细胞破裂,释放出质粒DNA和染色体DNA,两种DNA在强碱环境都会变性。
由于质粒和主染色体的拓扑结构不同,变性时前者虽然两条链分离,却仍然缠绕在一起不分开;但后者完全变性分甚至出现断裂,因此,当加入pH4.8的酸性乙酸钾降低溶液pH值,使溶液pH值恢复较低的近中性水平时,质粒的两条小分子单链可迅速复性恢复双链结构,但是主染色体DNA则难以复性。
在离心时,大部分主染色体与细胞碎片,杂质等缠绕一起被沉淀,而可溶性的质粒DNA留在上清夜中。
再由异丙醇沉淀、乙醇洗涤,可得到纯化的质粒DNA。
碱裂解法提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析等。
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【实验用品】
1、实验材料
上次实验转化的菌落。
2、仪器与耗材
台式高速离心机,恒温水浴锅,制冰机、移液枪、琼脂糖凝胶电泳系统,琼脂糖凝胶成像系统,无菌工作台。
1.5mlEppendorf,PCR管,tip头、烧杯、酒精灯、无菌牙签、吸水纸,一次性塑料手套等。
3、药品
溶液Ⅰ:
50mM葡萄糖,25mMTris-HCl(pH8.0),10mMEDTA(pH8.0)。
1MTris-HCl(pH8.0)12.5ml,0.5MEDTA(pH8.0)10ml,葡萄糖4.730g,加ddH2O至500ml。
在10lbf/in2高压灭菌15min,贮存于4℃。
溶液Ⅱ:
0.2NNaOH,1%SDS。
2NNaOH1ml,10%SDS1ml,加ddH2O至10ml。
使用前临时配置。
溶液Ⅲ:
醋酸钾(KAc)缓冲液,pH4.8。
5MKAc300ml,冰醋酸57.5ml,加ddH2O至500ml。
4℃保存备用。
TE:
10mMTris-HCl(pH8.0),1mMEDTA(pH8.0)。
1MTris-HCl(pH8.0)1ml,0.5MEDTA(pH8.0)0.2ml,加ddH2O至100ml。
15lbf/in2高压湿热灭菌20min,4℃保存备用。
苯酚/氯仿/异戊醇(25:
24:
1)
乙醇(无水乙醇、70%乙醇)
50×浓缩贮存液:
Tris碱242g;冰醋酸57.1mL;0.5mol/LEDTA(pH8.0),100mL;加600mL、蒸馏水,剧烈搅拌,加蒸馏水至1000mL。
溴化乙锭(EB):
10mg/ml
RNaseA(RNA酶A):
不含DNA酶(DNase-free)RNaseA的10mg/ml,TE配制,沸水加热15min,分装后贮存于-20℃。
6×loadingbuffer(上样缓冲液):
0.25%溴酚蓝,0.25%二甲苯青FF,40%(W/V)蔗糖水溶液。
1%琼脂糖凝胶:
称取1g琼脂糖于三角烧瓶中,加100ml0.5×TBE,微波炉加热至完全溶化,冷却至60℃左右,加EB母液(10mg/ml)至终浓度0.5μg/ml(注意:
EB为强诱变剂,操作时带手套),轻轻摇匀。
缓缓倒入架有梳子的电泳胶板中,勿使有气泡,静置冷却30min以上,轻轻拔出梳子,放入电泳槽中(电泳缓冲液0.5×TBE),即可上样。
内切酶。
【方法步骤】
1、无菌操作台上,取1.5ml培养菌体置于离心管(Eppendorf管)中,微量离心机上以10000rpm离心1min,弃上清液,离心管倒扣于干净的吸水纸上吸干;_{{_hp;&x
2、沉淀中加100μl用冰预冷的溶液I,充分混合(需要剧烈振荡);
3、加入200μl溶液II(新鲜配置),加盖后轻轻快速颠倒离心管数次混匀(千万不要振荡),冰浴2min;gYeKeW3)_
4、加入150μl预冷溶液III,轻轻颠倒数次混匀(10s),置于冰浴5min;___-^1_}J
5、12500rpm离心10min,取上清液于另一新Eppendorf管中;&c____ZQ,o
6、上清夜中加入等体积酚/氯仿(1:
1)混匀,12500rpm,离心5min。
7、小心转上层至一新的离心管弃去中层的蛋白质和下层的有机相。
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8、小心移出上清于一新Eppendorf管中,加入2倍体积无水乙醇,混匀后-20℃放置半小时,12500rpm离心10min;[B{F(~_O
9、70%乙醇洗涤沉淀,沉淀在室温下晾干。
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10、加入50μlTE缓冲液(PH8.0含20μg/mlRNaseA)溶解质粒粗提物,琼脂糖凝胶电泳分析提取的质粒,直接用于酶切或在-20℃保存。
11、按照内切酶说明书的要求,加入相应的内切酶、质粒和内切酶缓冲液;
12、混匀后,37℃水浴4小时,琼脂糖凝胶电泳分析酶切结果。
【实验结果】
【实验报告】
七、细胞特异性染色
【目的要求】
1.熟悉并掌握Feulgen反应的原理及其实验操作方法
2.对细胞的免疫组化研究方法有初步的认识
【基本原理】
Feulgen反应(Feulgenreaction)是显示DNA的最典型的组织化学反应,为学者Feulgen和Rossenbeck于1924年发明,简称为Feulgen法。
因对DNA的显示反应具有高度专一性,故常被用来显示细胞内DNA的分布情况。
自Feulgen等发明该显示DNA的Feulgen反应法以来,其作用机制也久经研究和讨论,现已取得一致意见。
其具体反应原理是,标本经稀盐酸水解后,DNA分子中的嘌呤碱基被解离,从而在核糖的一端出现了醛基。
Schiff试剂中的无色品红可与醛基反应,形成含有醌基的化合物分子,因醌基为发色团,故可呈现出紫红色。
也就是说,DNA经稀酸水解后产生的醛基,具有还原作用,可与无色品红结合形成紫红色化合物,从而显示出DNA的分布。
其反应机制如下图所示。
2HCl+Na2S2O5→2NaCl+SO2+H2SO3
【实验用品】
1、器材
显微镜、立式染色缸、水浴锅
2、材料
香柏油,擦镜纸,盖玻片,载玻片
3、试剂
schiff氏试剂将0.5g碱性品红置入三角烧瓶内100ml沸腾的蒸馏水中,时时摇动玻璃瓶,煮沸5min使之充分溶解,冷却至50℃时过滤,加入10ml1mol/LHCl,冷至25℃时,加入0.5g偏重亚硫酸钠(Na2S2O3),在室温冷暗处至少放置24h(有时需2~3天),使其颜色退至淡黄色,密封瓶口,藏于暗处,最好保存于4℃冰箱中(可保存数月或更长时间)。
在使用前加入0.5g活性碳,用力震荡1min,用粗滤纸过滤,放入棕色瓶中,封严瓶塞,外包黑纸。
滤液应为无色也无沉淀;贮于4℃冰箱中备用。
如有白色沉淀,就不能再使用;若液体颜色变为粉红色,可加入少许偏重亚硫酸钠使之再转变为无色时,仍可再用。
亚硫酸水(洗涤剂):
用200ml普通自来水(不要用蒸馏水,以免引起误差)、10ml10%的偏重亚硫酸钠水溶液和10ml1mol/LHCl,三者在使用前混合,现用现配。
1mol/LHCl(水解用):
取82.5ml比重为1.19的盐酸加蒸馏水1000ml即成(应将盐酸缓缓加入水中)。
【方法步骤】
1、材料准备取大蒜若干头,剥皮后置于盛有水的培养皿内使其长出新根。
待根尖长1cm时,剪下根尖固定在Carnoy固定液内、保存备用。
2、水解实验时,从冰箱取出预先准备好的大蒜根尖,分装到若干个青霉素瓶中,用自来水洗3次,蒸馏水水洗3次,换1mol/LHCl洗一次,倾去,换入预热60℃的1mol/LHCl3ml,放入恒温水浴锅中在60±0.5℃下水解8-15分钟(视材料而定,水解时间可以从8分钟延长至30分钟)。
然后吸去热1mol/LHCl,换入冷1mol/LHCl洗1次,再用蒸馏水将根尖洗3次。
水解是本实验成败的关键之一。
重要的是温度,应保持在60±0.5℃之间。
如果温度过高或时间过长,造成水解过度,醣与醛基之间的键被破坏,醛基流失到水解液中;反之,不能出现潜在的醛基,都不能呈现颜色反应。
3、染色吸净水分,加入Schiff试剂避光染色40mi
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