中药分析技术.docx
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中药分析技术
中药分析技术
第一章MS–302生物信号记录分析系统的操作与应用…………………………2
第二章气相色谱仪原理和使用………………………………………………………4
第三章气-质联用仪…………………………………………………………………7
第四章核磁共振波谱仪简介及应用………………………………………………13
第五章超临界萃取技术的基本原理和应用………………………………………17
第六章HPLC使用原理及方法………………………………………………………21
第七章紫外-可见分光光度法原理及其应用简介………………………………27
第八章LC—MS联用技术简介……………………………………………………….30
第九章Nicolet380型傅立叶变换红外光谱仪操作规程……………………….34
第十章AAS法对几种调味品中微量元素的测定………………………………..36
第十一章药理实验数据处理方法…………………………………………………….39
第一章MS–302生物信号记录分析系统的操作与应用
1MS–302系统简介
MS–302系统,全称是多媒体化生物信号记录分析系统,该系统的硬件由显示器、主机、MS–302硬卡(已插到主机上)、传感器输入面板等组成;软件运行在DOS环境,目前已升级到MS–2000版本。
操作总体来说是较为简单的,用键盘或鼠标通过几次练习即可掌握。
但如要深入、熟练、掌握其全部功能,则需一段时间。
操作人员最好有一定的电脑基础。
一般使用键盘操作,但真正用到的键仅F1~F9、、、、、Enter、Esc、空格键等少数几个。
对于使用者来说,如果经过2~3小时实际操作,大部分可以掌握最基本的使用方法,要比二道仪、示波器的使用简单。
最大的优点是,MS–302系统完全使用软件控制,纵然有误操作也很难对仪器造成什么损害,因此,我们不必害怕因操作不当引起仪器损坏。
MS–302系统的功能是十分强大的,几乎包括了目前大中专学校开展的所有使用仪器的学生实验,实验过程和实验结束后均可进行数据处理。
总的说来,其功能超过了二道仪和示波器的总和,再配合强大的电脑功能,即可用于开展某些科研活动。
2记录分析系统的结构和特点
MS-302生物信号记录分析系统是配置在计算机中的3通道生理信号测量分析系统。
其硬件只有一块卡(集3通道前置放大器、导联转换、自动调零、12位A/D转换、最高采样速度15us、数字化刺激器于一体)将硬卡插入计算机内便可工作,无需任何外围设备、无连线、可靠性好、对计算机的其它功能无任何影响。
软件功能适用于生理、药理、毒理、病理生理等学科的有关实验。
如神经放电(监听、频率直方图、面积、计数等)、动作电位(传导速度、阈刺激)、诱发电位、脑电、心电、压力信号(血压)、呼吸和张力信号、计滴等。
可同时从生物体内或离体器官中获取3种电活动或压力、张力、位移等非电变量的模拟信号。
经过信号调节,采样保持,模数转换,显示或打印处理结果。
操作简单(只需3个键),全中文界面(提示性好)实验中记录信号、图形显示、结果分析、数据贮存、键盘操作均可同时进行,互不排斥,做到了全实时操作,真正仪器化。
3MS–302系统与传统二道仪、示波器的比较
与示波器、生物放大器相比,MS–302系统的优点十分明显,表现在:
2.1记录的生理信号可以重放可以固定,便于随时观察和分析。
2.2可同时在屏幕上显示3种生理信号,可视面积大,用于示教效果也不错。
2.3实验过程中多种参数可以实时自动测量、显示,二道仪或示波器相当,能直接显示的有收缩压、舒张压、平均动脉压、心率、频率等参数。
这是其它仪器所无法比拟的。
2.4实验结果存在硬盘里,随时可调用。
2.5数据处理方式灵活多样,曲线可扩展和压缩,可进行微积分等多种处理,根据需要剪辑、打印,还可转化成BMP文件,使得在windows操作系统下也能使用实验结果。
2.6MS–302系统本身带有数字式刺激器,本身又是一部电脑,所以一套MS–302系统实际上相当于二道仪、示波器、生物放大器、刺激器再加上电脑的功能。
4MS–302系统的使用方法
4.1血压记录
1)将压力换能器插头连到相应通道的输入插座,压力腔内充满液体,排除气泡,与动脉导营相连;
2)开启主机与显示器电源开关,引导操作系统。
进入DOS提示符进入MS302子目录,键入MS302命令,启动MS302系统,进入监视状态,显示图形用户界面与主菜单;
3)选定该通道的“信号选择”为“压力”,井自动调零,调零时换能器的压力腔应与大气相通,使输入为零;
4)根据换能器的灵敏度设定该通道的“增益选择”,一般设在1/2或1mv/cm档;
5)若未曾压力定标,或虽经定标但相隔较久,或改换通道与换能器时,应重新进行“压力信号定标”;若已有准确定标,则继续进行下列步骤;
6)将充满肝素溶液导管插入预先分离好的颈总动脉或股动脉,结扎固定后打开夹子和动脉夹,压力信号传输入换能器;
7)选用“连续示波显示”或“平行移动显示”观察该通道显示的血压波形。
必要时通过“显速选择”调整扫描速度;也可采用“横向压缩”功能观察血压变化趁势,观察血压的二级波和三级波,不能用减慢“显示速度”;
8)必要时应用“参数设置”中的“基线位移”,将基线调到适当位置,使血压变化曲线更为清晰或使用“参数设置”下“显示方式”中的“扩展屏幕显示”将通道显示范围扩大。
9)若要观察血压波形的微分,可通过“参数设置”中的“信号处理”,选挥“微分处理”来获得,这样可得到收缩最大上升速率。
10)待血压稳定后即可开始正常记录,按Esc键选“记录状态”。
记录中可按F2键作必要的标记。
停止记录按Esc键,根据实验情况选“监视状态”或“结束实验”。
4.2心电记录
1)将全导联心电电缆插头插入、刺激输出面板的1A插座,也可将三芯导线插头插入该面板的插座2或3;
2)开启主机与显示器电源开关,引导操作系统。
进入DOS提示符进入MS302子目录,键入MS302命令,启动MS302系统,进入监视状态,显示图形用户界面与主菜单;
3)将主菜单移到“信号选挥”,便相应通道选择“心电”信号;
4)将主菜单移到“增益选挥”,设定该通道增益为“1mv/cm”或“1/2mv/cm”;
5)将主菜单移到“显速选择”,选挥50mm/s的扫描速度采用“连续示波显示”或“平行移动显示”;
6)观察该通道所显示的心电波形,待信号稳定后即可开始记录,按Esc健,选“记录状态”。
记录过程中对于所发生的事件可按F2键打上标记;
7)需要换导联时,重复4;
8)停止记录时按Esc键,选“监视状态”继续观察,或选“结束实验”退出本系统。
4.3呼吸的记录
方法一:
张力传感器法:
1)将张力传感器接在任一通道,“信号输入”选挥“呼吸”;
2)在动物的剑突处缝一根丝线,线与腹部垂直,连于张力传感器,并使张力合适;
3)如果动物已开腹,则将丝线缝至膈小肌上,线与腹部平行,连于张力传感器上;
4)将显速设成25mm/s,根据波形大小调节增益。
5)“平滑滤波”选10点,以使曲线光滑;
6)用“横向压缩”调整波形的疏密。
方法二:
压力传感器法:
1)将压力传感器接在l通道,“信号输入”选择“呼吸”;
2)将动物气管插管的一端接在压力传感器上,并将压力传感器的另一端用三通管关闭;
3)将显速设成25mm/s;
4)部分堵塞气管插管的进气口,根据波形大小调节增益;
5)“平滑滤波”选10点,以使曲线光滑;
6)用“横向压缩”调整波形的疏密。
5MS–302系统在药理实验中的应用
5.1传出神经对血压的影响这一实验,以前我们用双记纹鼓或二道仪,操作起来复杂,并且结果分析难以理解。
更新实验设备后只需一台,MS–302系统就能完成此实验,并能观察到正常血压与各药应用后血压的一级波、二级波、收缩压、舒张压、平均动脉压、心率、频率等参数。
这是其它仪器所无法比拟的。
5.2强心甙的强心作用这一实验中,我们用MS–302系统替代记纹鼓,描记正常时心跳的曲线以及每加一药或换药后心脏收缩幅度、心率、房室收缩的协调性等方面的变化,并描记心收缩曲线,结果直观,分析起来学生易懂。
5.3尼可刹米对呼吸抑制的解救实验中,MS–302系统替代玛利气鼓以及记纹鼓描记正常的呼吸曲线以及用药后的呼吸频率及幅度。
5.4呋塞米的利尿作用中用,MS–302系统可以直接计算出正常以及用药后的每分钟尿滴数及半小时尿量,替代用肉眼观察的麻烦与不便,并且结果又准确。
6小结
总的说来,利用MS–302系统代替一般的二道生理记录仪和刺激器进行生理、药理、毒理、病理生理等学科的有关实验具有操作简单、直观可视、省时可靠、及提高实验精确度和效率等优点,是一种可以被用来进行广泛的药理药效实验研究的新型微机仪器。
第二章气相色谱仪原理和使用
一、气相色谱仪的工作原理
气相色谱法用于分离分析试样的基本过程如下图所示。
由高压钢瓶1供给的流动相载气,经减压阀2,净化器3,稳压阀4和转子流量计5后,以稳定的压力恒定的流速连续经过气化室6,色谱柱7,检测器8,最后通过皂膜流速计放空。
气化室与进样口相接。
它的作用是从进样口注入的液体试样瞬间气化为蒸气,以便载气带入色谱柱中进行分离。
分离后的试样随载气依次进入检测器。
检测器将组分的浓度(或质量)变化转变为电信号。
电信号经放大后,由记录器记录下来,即得到色谱图。
二、气相色谱仪组成
目前国内外气相色谱仪的型号和种类很多,但它们均由以下五大系统组成:
气路系统、进样系统、分离系统、温控系统以及检测和记录系统。
(一)气路系统
气相色谱仪上有一个让载气系统连续运行、管路密闭的气路系统。
它的气密性,载气流速和稳定性以及测量流量的准确性,对色谱结果均有很大的影响,因此必须注意控制。
(1)载气气相色谱中常用的载气有氢气、氮气、氦气和氩气。
它们一般都是由相应的高压钢瓶贮存的压缩气源供给。
(2)气路结构气相色谱仪主要有两种气路形式:
单柱气路和双柱双气路,前者适用于恒温分析,后者适用于程序升温,并能补偿固定液的流失并使基线稳定。
目前多数气相色谱仪属于这种类型。
(3)净化器净化器是用来提高载气纯度的装置。
净化剂主要有活性炭、硅胶和分子筛、105催化剂,它们分别用来除去烃类物质、水分、氧气。
(4)稳定恒流装置在恒温色谱中,操作条件一定时,整个系统阻力不变,因此用一个稳定阀,就可以使柱子的进口压力稳定,从而保持流速恒定。
但是在程序升温色谱中,柱内阻力不断增加,载气的流速逐渐变小,一簇必须在稳压阀后串联一个稳流阀。
(二)进样系统
进样系统包括进样装置和气化室。
其作用是将液体或固体试样,在进入色谱柱前瞬间气化,快速定量地转入到色谱柱中。
(1)进样器目前液体试样的进样,一般都用微量注射器,常用规格为1μL、5μL、10μL和50μL等。
气体试样的进样,常用色谱仪本身配置的推拉式六通阀或旋转式六通阀定量进样。
旋转式六通阀如图所示。
(2)气化室为了让试样在气化室中瞬间气化而不被分解,因此要求气化室热容量大,无催化效应。
为了尽量减少柱前谱峰变宽,气化室的死体积尽可能小。
(三)分离系统
气相色谱仪的分离系统是色谱柱,它由柱管和装填在其中的固定相等所组成。
由于混合物各组分的分离在这里完成,所以它是色谱仪中最重要的部件之一。
目前填充柱应用较为普遍。
材料可为金属或玻璃制成。
其内径一般为2-4mm,长度1-10m。
柱形多为螺旋形,为了减少跑到效应,其螺旋直径与柱内径之比一般为15:
1到25:
1。
(四)温控系统
温控系统是用来设定、控制、测量色谱柱炉、气化室、监测室三处的温度。
气相色谱的流动相为气体,试样仅在气态时才能被载气携带通过色谱柱。
因此,从进样到检测完毕为止,都必须控温。
气化室的温度应使试样瞬时气化而又不分解。
一般情况下,气化室温度比柱温高10-50℃。
除氢火焰离子检测器外,所有检测器对温度的变化都很敏感,因此,检测室的控温精度要求优于±0.1℃。
(五)检测器
检测器是一种将载气中被分离组分的量转化为易于测量的信号的装置。
由于微分型检测器给出的响应是峰形色谱图,它反映了流过检测器的载气中所含试样量随时间变化的情况,并且峰的面积或峰高与组分的浓度或质量流速呈正比。
因此,在气相色谱仪中,常采用微分型检测器。
微分型检测器可分为浓度型和质量型。
1.热导池检测器热导池检测器(TCD)是一种结构简单、性能稳定、线性范围宽、对有机和无机物质都有响应、灵敏度适宜的检测器,因此在气相色谱中得到广泛的应用。
2.氢火焰离子检测器氢火焰离子检测器(FID)具有结构简单、灵敏度高、死体积小、响应快、线性范围宽、稳定性好的优点,是目前常用的检测器之一。
但它仅对含碳有机化合物有响应、对某些物质如永久性气体、水、一氧化碳、二氧化碳、氮的氧化物、硫化物等不产生信号或信号很弱。
3.离子捕获检测器离子捕获检测器(ECD)在应用上是仅次于热导池和氢火焰检测器。
它对具有电负性的物质,如含有卤素、硫、磷、氮的物质有响应,且电负性越强,检测灵敏度越高。
4.热离子化检测器热离子化检测器(TID)又称氮磷检测器,对含磷、氮的有机化合物有响应。
可检测痕量含氮和含磷有机化合物,是一种高灵敏度、高选择性、宽线性范围的新型检测器。
5.火焰光度检测器火焰光度检测器(FPD)又称硫磷检测器,是应用火焰光度法的原理,检测含硫、磷的有机化合物。
它具有高选择性和高灵敏度。
三、色谱操作规程
1.开载气(氮气)钢瓶气阀,观察减压阀压力是否在0.3-0.6Mpa之间;
2.依次打开氢气发生器电源开关及空气压缩机电源开关;
3.待载气、氢气、空气压力正常后打开色谱主机电源,依次按起始、加热按钮;氢气恒流阀压力达0.12Mpa左右时,打开空气放空阀点火,并确定有无点着,热机30分钟;
4.打开工作站开关及计算机,点击桌面通道工作站快捷键进入分析界面,进入实时采样界面,检查柱炉、汽化室、检测器当前温度是否为50℃、250℃、250℃,当各部分温度到达后程序升温准备灯亮时按实时采样按钮及开始按钮,并将电压调节至0-1000uv之间,待基线平稳后方可进行样品分析;
5.标准气体(液体)的分析基线平稳后,待柱炉温度降为50℃、程序升温准备灯亮时,以1ml(1ul)的微量进样器准确量取1ml(1ul)的标准气体(液体)由进样口迅速注入色谱柱,拔出进样器,同时按下实时采样按钮和开始按钮。
分析结束后自动回到工作站界面,载入相应的ID表,采用外标法对样品谱图进行分析得到相应的分析数据(萘标样结果误差在4±0.3mg/ml之间,方可对试样进行分析)。
保存谱图到相应的位置。
6.试样的分析试样的分析步骤同标准气体(液体)的分析步骤。
7.数据输出按打印按钮计算机直接将当前色谱谱图及数据打印出来。
8.关机
a)关闭加热按钮及主机电源;
b)关闭氢气发生器电源及空气压缩机电源;
c)最后关闭载气钢瓶气阀;
d)退出工作站界面,关闭工作站开关,关闭计算机。
注意事项:
1、开机应严格遵循先开气,后开电源加热的原则;
2、关机应先关电源加热,后关气。
3、空气压缩机要定时放水,氢气发生器注意蒸馏水位不能低于下限。
4、连续分析时必须等到峰出完以及准备灯亮后才能进行下一个试样的分析。
5、标样进样器与试样的进样器应单独使用不能混用。
6、禁止擅自更改操作条件及参数(如:
温度、流量、压力、时间等)。
7、注射样品是要迅速。
延时则会造成分析数据的偏差。
第三章气-质联用仪
气象色谱与有机质谱的联用系统(GC-MS)是最早得到实现(1957年)的联用仪。
目前该技术是联用技术中十分活跃的技术,它的成功应用能使样品的分离、鉴定和定量一次完成,对于药物分析的发展起到了很大的促进作用。
例如:
GC-MS在合成产物的确证,有机合成反应中副产物的鉴定,中药未知成分的鉴定,药物代谢物的研究等方面均是最重要的工具之一。
目前多用毛细管色谱与质谱联用,70年代,GC-MS已开始作为商品出售:
80年代,已开始普及应用。
气相色谱仪可以看作是质谱仪的进样系统,相反也可以把质谱仪看作是色谱仪的检测器。
因质谱仪灵敏度高、特征性强、要求分析试样必须是高度纯净物(除MS-MS联用技术外),色谱技术为质谱分析提供了色谱纯化的试样,质谱仪则提供准确的结构信息。
GC/MS被广泛应用于复杂组分的分离与鉴定,其具有GC的高分辨率和质谱的高灵敏度,是生物样品中药物与代谢物定性定量的有效工具。
一、仪器组成及原理
(一)、真空系统:
2级真空:
机械泵和涡轮分子泵
机械泵一般时前级真空,也就是在机械泵把真空降到一定水平后才启动涡轮分子泵,以保护分子泵。
所以仪器从大气压到真空合适的状态一般要经过一段时间的。
(二)、进样系统:
从分离装置来的组分(气体或者液体)或者从直接进样杆进液体或者固体样品。
(三)、离子源
离子源:
主要作用是使欲分析的样品实现离子化,尤其是中性物质带上电荷。
样品本身性质的差异,决定了离子化的方式不能有万能的离子源,离子源的类型也是多种多样。
(四)、质量分析器
质量分析器是质谱仪的核心部件,因此常以质量分析器的类型来命名一台质谱仪。
(五)、检测器:
目前是光电倍增器应用较广。
(六)、采集数据和控制仪器的工作站
工作原理见图1
图1GC-MS工作原理示意图
GC-MS联用技术是利用供试物经GC分离为单一组分,按其不同的保留时间,与载气同时流出色谱住,经过分子分离器接口,除去载气,保留组分进入MS仪离子源。
由于此时载气和组分的量甚微,不至于严重破坏MS仪的真空度,各组分分子进入离子源后被离子化,使样品分子转化为离子。
对于有机化合物,在多数情况下,由于在离子化过程中接受了过多的能量,新生的分子离子会进一步裂解,生成各种碎片离子。
经分析检测。
记录为MS图。
经计算机自动检索核对,即可迅速鉴识样品。
通常,在规定条件下所得的MS碎片图及其相应强度,犹如指纹图,易于辨,方法专述灵敏。
因此,GC-MS联用主要包括色谱柱、接口和质谱仪的选择。
接口的选择尤为重要。
二、气相色谱部分(色谱柱)
1.载气钢瓶;2.减压阀;3.净化器;4.稳压阀;
5.转子流速计;6.气化室;7.色谱柱;8.检测器9.放大器;10.记录仪
图2气相色谱过程示意图
气相色谱过程见图2,包括气路系统、进样系统、分离系统和温控系统。
其主要部分为色谱柱的选择。
色谱柱由柱管和装填在其中的固定相等组成。
它是色谱仪中最重要的部件之一,混合物中各组分的分离在这里完成。
色谱柱分为填充柱和毛细管柱。
填充柱应用普遍,柱材可由金属或玻璃管制成,内径一般为2~4mm,长度1~10m,呈U形或螺旋形。
空心毛细管柱材质为玻璃或石英,内径一般为0.2~0.5mm,长度30~300m,呈螺旋形。
与填充柱相比,毛细管柱的特点为:
1.分离效能高2.分析速度快3.样品用量少
其独特的特点在于:
渗透性大,分析速度快传质阻力小,可用长柱,并得高的总柱效。
毛细管柱每米塔片数通常在2000-5000之间,长20米的毛细管柱总柱效为4万至10万。
填充柱每米塔片数在1000-1500之间,长2米的填充柱的柱效为2000-3000,所以毛细管柱的总柱效可以比填充柱高10-100倍。
对色谱柱管材质,应按如下要求选择:
1、应与固定相、试样、载气不起化学反应。
2、要易于加工成型。
3、管内壁应光滑,横截面应均匀呈圆形。
一般色谱柱管形状呈U型或螺旋形,大多由铜、不锈钢,玻璃等材质制成。
色谱柱的分离效果除与柱长、柱径和柱形有关,还与所选的固定相和填料的制备技术以及操作条件等许多因素有关。
三、接口技术
GC-MS仪的接口组件是解决气相色谱和质谱联用的关键组件,它起传输试样,匹配两者工作流量(也就是工作气压)的作用。
理想的接口应能去除全部载气而使试样毫无损失地从气相色谱仪传输给质谱仪。
要求试样传输产率离,浓缩系数太,延时短,色谱的峰展宽少。
(一)接口作用:
压力匹配——质谱离子源的真空度在10-3Pa,而GC色谱柱出口压力高达105Pa,接口的作用就是要使两者压力匹配。
组分浓缩——从GC色谱柱流出的气体中有大量载气,接口的作用是排除载气,使被测物浓缩后进入离子源。
(二)常见接口技术有:
1、分子分离器连接(主要用于填充柱)
2、扩散型——扩散速率与物质分子量的平方成反比,与其分压成正比。
当色谱流出物经过分离器时,小分子的载气易从微孔中扩散出去,被真空泵抽除,而被测物分子量大,不易扩散则得到浓缩。
3、直接连接法(主要用于毛细管柱)
在色谱柱和离子源之间用长约50cm,内径0.5mm的不锈钢毛细管连接,色谱流出物经过毛细管全部进入离子源,这种接口技术样品利用率高。
4、开口分流连接
该接口是放空一部分色谱流出物,让另一部分进入质谱仪,通过不断流入清洗氦气,将多余流出物带走。
此法样品利用率低。
其中最简单的、也是目前最常用的⋯种接口是毛细管柱直接导人型接口(图3)。
这种接口是将毛细管色谱柱的末端直接插人质谱仪离子源内,柱的流出物直接进入电离盒区,然后被离子源高真空泵组排入大气。
接口只起保护插入段毛细管住和控制温度的作用。
这种接口的优点是构造简单和产率高(100%),缺点是无浓缩作用,不适合流量大于1ml﹒atm/min的大口径的毛细管柱和填充柱。
四、质谱仪
(一)离子源
离子源的作用是接受样品产生离子,常用的离子化方式有:
1、电子轰击离子化(electronimpactionization,EI)
EI是最常用的一种离子源,有机分子被一束电子流(能量一般为70eV)轰击,失去一个外层电子,形成带正电荷的分子离子(M+),M+进一步碎裂成各种碎片离子、中性离子或游离基,在电场作用下,正离子被加速、聚焦、进入质量分析器分析。
EI特点:
a电离效率高,能量分散小,结构简单,操作方便。
b图谱具有特征性,化合物分子碎裂大,能提供较多信息,对化合物的鉴别和结构解析十分有利。
c所得分子离子峰不强,有时不能识别。
d本法不适合于高分子量和热不稳定的化合物。
2、化学离子化(chemicalionization,CI)
将反应气(甲烷、异丁烷、氨气等)与样品按一定比例混合,然后进行电子轰击,甲烷分子先被电离,形成一次、二次离子,这些离子再与样品分子发生反应,形成比样品分子大一个质量数的(M+1)离子,或称为准分子离子。
准分子离子也可能失去一个H2,形成(M-1)离子。
CI特点:
a不会发生象EI中那么强的能量交换,较少发生化学键断裂,谱形简单。
b分子离子峰弱,但(M+1)峰强,这提供了分子量信息。
3、场致离子化(fieldionization,FI)
适用于易变分子的离子化,如碳水化合物、氨基酸、多肽、抗生素、苯丙胺类等。
能产生较强的分子离子峰和准分子离子峰。
4、场解吸离子化(fielddesorptionionization,FD)
用于极性大、难气化、对热不稳定的化合物。
5、负离子化学离子化(negativeionchemicalionization,NICI)
是在正离子MS的基础上发展起来的一种离子化方法,其给出特征的负离子峰,具有很高的灵敏度(10-15g)。
(二)质量分析器
其作用是将电离室中生成的离子按质荷比(m/z)大小分开,进行质谱检测。
常见质量分析器有
1、四极质量分析器(quad
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