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RNA干扰沉默STAT3基因表达对人大肠癌细胞生物学行为的阻碍
RNA干扰沉默STAT3基因表达对人大肠癌细胞生物学行为的阻碍
孙海波李静安鼎伟陈丽张照果
【摘要】目的探讨RNA干扰(RNAi)技术沉默STAT3基因表达对人大肠癌细胞生物学行为的阻碍。
方式采纳真核细胞转染技术将pSilencerH1siRNASTAT3重组质粒转染人结肠癌HCT116细胞,MTT法检测细胞增殖,RTPCR、Westernblot及免疫组化法别离观看STAT3基因和蛋白的转变,流式细胞仪及AO/EB染色观看细胞凋亡。
结果pSilencerH1siRNASTAT3重组质粒对大肠癌细胞的增殖有明显抑制作用,与空白组及阴性组相较不同有统计学意义(P<;在重组质粒组,STAT3基因mRNA及蛋白的表达与空白组及阴性组相较明显减低(P<;重组质粒可诱导HCT116细胞凋亡,细胞周期分期示细胞阻滞于G2期。
结论pSilencerH1siRNASTAT3重组质粒可抑制STAT3基因在人大肠癌细胞中的表达。
【关键词】STAT3;RNA干扰;大肠癌;基因医治
大肠癌发生进展进程受诸多因素的阻碍〔1〕。
传统的放疗、化疗及手术医治仍不能取得理想的成效,而基因医治慢慢成为大肠癌研究的热点。
转录信号传导子与激活子家族(signaltransducersandactivatorsoftranscription,STAT)的重要成员STAT3,其信号传导通路与细胞的增殖、分化及凋亡紧密相关,该通路持续激活可致使细胞异样增殖和恶性转化,目前将其概念为癌基因〔2〕。
本文通过RNA干扰(RNAi)技术抑制STAT3基因在人大肠癌细胞HCT116中的表达,观看其对大肠癌细胞生物学行为的阻碍,为大肠癌基因医治提供有效靶点及技术。
1材料与方式
材料AntipSTAT3(Y705)、βactin兔抗人多克隆抗体购自cst公司。
人结肠癌HCT116细胞株购自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心。
转染试剂siPORTNeoFX购于Ambion公司,IMDM、胎牛血清购自Gibco公司,常规试剂由辽宁医学院科学实验中心提供。
U6STAT3siRNAGFP重组质粒由本室保留,超纯质粒小样快速提取试剂盒(去内毒素)购于EZNA公司,质粒提取按说明书进行,经λDNA定量g/L者待用。
方式
MTT法取对数生长期细胞,转染前1h,%胰酶消化后,含10%胎牛血清的IMEM培育基终止消化,搜集备用。
实验分为空白组(M),pSH1SiScramble组(N),pSH1SiSTAT3组(T),T组再按质粒浓度分为T一、T二、T3。
每组分24h、48h、72h三个时刻段,每时刻段4复孔。
各组质粒别离取:
N组μg,T1组μg,T2组μg,T3组μg加染试剂μl,于24h、48h、72h相差显微镜下观看拍照后,各孔加入5g/L的MTT20μl,孵育4h,弃上清,每孔加入分析纯DMSO100μl,震荡10min,酶标仪检测各孔吸光度值(A570),计算细胞生长抑制率。
实验共重复3次。
细胞生长抑制率(%)=(1-实验组/对照组)×100%。
细胞转染转染前1h,按上述方式搜集细胞备用。
实验分为M、N、T共3组。
将转染试剂μl溶于终体积IMDMg/L)100μl,混匀后制成A液,室温孵化10min;各组质粒别离取μg溶于IMDMg/L)100μl,混匀后制成B液;将A液加入B液,混匀后制成C液,室温孵化10min。
分派C液200μl到6孔板各孔中,调细胞浓度为2×105/孔。
转染后72h,相差显微镜观看细胞生长情形后进行后续实验。
RT-PCR收成的细胞按说明书完成RNA提取,取总RNA10μg逆转录为cDNA,PCR条件:
94℃,5min;94℃,30s;56℃,30s;72℃,45s;72℃,7min,30循环,25μl体系,以βactin为内参。
PCR产物以20g/L琼脂糖凝胶电泳,Genegenius凝胶成像系统分析后,以STAT3/βactin产物量的比值为最终结果。
实验重复3次。
引物序列:
STAT3:
正向5′TTGCCAGTTGTGGTGATC3′,反向5′AGACCCAGAAGGAGAAGC3′;βactin:
正向5′AAGTACTCCGTGTGGATCGG3′,反向5′ATGCTATCACCTCCCCTGTG3′。
Western印迹法收成的细胞,加入裂解液,超声裂解20s,冰上静置30min,12000r/min4℃离心25min,上清为总蛋白粗提液。
BCA法蛋白定量,取总蛋白40μg/20μl,煮沸变性5min,SDSPAGE电泳后半干法转膜至PVDF膜,AntiPSTAT3及βactin兔抗人多克隆抗体浓度为1∶1000,碱性磷酸酶标记的羊抗兔二抗浓度为1∶1000,NBT/BCIP显色。
Genegenius凝胶成像系统分析后,以STAT3/βactin蛋白量的比值为最终结果。
实验共重复3次。
细胞免疫组化法按上述转染步骤将细胞分M、N、T共3组转染于6孔板内,72h后掏出盖玻片,荧光显微镜下观看拍照后用40g/L多聚甲醛固定30min,PBS洗3次,蒸馏水洗3次,TritonX100%)洗10min,PBS洗5min×3次,其余步骤按免疫组织化学染色说明书操作。
阳性结果为细胞质或胞核棕黄着色,随机选取5个高倍镜视野,计数阳性细胞占所研究细胞的15%以上即为阳性。
流式细胞术(FCM)取转染48h后的细胞1×106个,离心后用冷PBS悬浮,1000r/min离心10min,清洗2遍,弃上清,将细胞用1ml注射器快速推入700ml/L冷乙醇中,4℃固定12h以上。
PBS洗2次,调细胞密度为1×109/L,RNase消化后,加入50mg/LmlPI染液。
混匀后上流式细胞仪做单参数分析,计算各期细胞所占比例,实验共重复3次。
AO/EB双染色取转染72h后的细胞,制成悬液并调细胞密度为1×1010/L,取20μl加100mgAO染液2μl及100mgEB染液2μl,滴于载玻片,盖片封片后荧光显微镜直接观看,于20min内计数500个细胞。
统计学处置应用软件行相关数据分析,计量资料采纳x±s表示;两组均数的比较用t查验。
2结果
细胞增殖活性判定参照转染试剂说明书推荐的质粒最正确转染浓度,设计3种不同浓度g/L、g/L、g/L)的pSH1SiSTAT3,结果显示细胞增殖活性随质粒浓度增高而下降,但在g/L和g/L浓度之间转变不大,应选择g/L作为最正确质粒浓度进行以后的实验。
MTT结果显示,N组细胞生长速度略慢于M组,T组细胞生长明显慢于M组及N组,生长抑制率24、4八、72h别离为%、%、%,48h及72h组与M组细胞相较均有统计学意义(P<。
见表1。
HCT116细胞STAT3表达RTPCR结果显示,T组STAT3基因的mRNA表达明显降低,STAT3产物量/βactin的比值别离为±、±、±,T组与M组、N组相较均有统计学意义(P<,见图1。
Western印迹结果显示,重组质粒医治组PSTAT3蛋白表达亦明显减弱,STAT3蛋白量/βactin别离为±、±、±,有统计学意义(P<,见图2。
细胞免疫组化结果显示,M组及N组胞浆和/或胞核中可见大量棕黄着色细胞,而T组仅见部份细胞核中含有棕黄色颗粒。
表1不同处置组HCT116细胞吸光度A值比较图1不同处置组HCT116细胞STAT3基因mRNA表达
大肠癌HCT116细胞凋亡FCM结果示T组细胞显现明显的细胞凋亡峰,凋亡率达%,与M组及N组相较有统计学意义(P<。
细胞周期分析示T组细胞显现G2期阻滞,T组S期与G2期细胞数与M组及N组相较有统计学意义(P<,见表2。
AO/EB双染色结果M组及N组细胞呈绿色或黄绿色荧光,T组细胞可见较多黄色荧光,偶见红色荧光,提示实验组细胞较多呈早中期凋亡。
见图3。
图2不同处置组HCT116STAT3蛋白Western印迹表2不同处置组HCT116细胞凋亡率及细胞周期散布图3不同处置组HCT116细胞AO/EB双染色(荧光显微镜,×400)
3讨论
STAT3是作为白细胞介素6(IL6)信号传递中的急性反映因子最先被发觉并被纯化的〔3〕,其所参与的JAK/STAT信号传导通路与细胞的增殖、分化及凋亡紧密相关,该通路持续激活可致使细胞异样增殖和恶性转化,为肿瘤形成进程中的重要环节〔2,4,5〕。
Joshua等〔6〕研究说明,STATs所介导的JAK/STAT信号转导通路在大肠癌的发生、进展中起重要作用。
咱们的前期研究亦证明在42例人大肠癌组织及癌旁组织中均有STAT3mRNA及蛋白的高表达,同时检测的下游基因cmyc、survivin及VEGF基因在大肠癌及癌旁组织中的表达亦增高,p53基因降低,提示STAT3的异样激活在大肠癌的发生和进展进程中起重要的增进作用并阻断了某些重要抑癌基因的活性〔7〕,因此STAT3基因可望成为大肠癌医治的新靶点。
RNAi是最近几年发觉的一种重要的转录后水平的基因沉默方式〔8〕。
并以其高效性、高特异性等优势而作为研究基因功能的一种重要和经常使用的技术,已普遍用于基因研究和临床疾病尤其是肿瘤的医治研究,有广漠的前景和应用潜力。
Zheng等用RNAi技术在人胰腺癌SW1990细胞中成功的抑制了STAT3的表达,为避免胰腺癌的侵袭和转移提供了新的策略〔9〕。
本研究应用针对人的STAT3基因的siRNA构建表达载体U6STAT3siRNAGFP,转染过度表达STAT3基因的人大肠癌细胞株HCT116,结果说明重组质粒在mRNA及蛋白水平都可抑制STAT3基因表达,MTT结果亦说明T组HCT116细胞的增殖活性明显减低,可见RNAi可使大肠癌HCT116细胞的生物学行为明显受抑,为大肠癌的基因医治提供了靠得住的依据。
另外,应用RNAi沉默STAT3基因后,S期细胞所占比例明显减少而阻滞于G2期的细胞增加,凋亡细胞所占百分率明显增加,这与Kunigal等〔5〕在乳腺癌中的研究相似。
说明RNAi抑制STAT3基因可增进HCT116细胞凋亡,有助于抑制大肠癌的侵袭和转移并指导诊疗。
咱们在本研究中还发觉N组的细胞在转染后显现部份细胞形态改变,mRNA及蛋白表达也有转变,尽管与M组相较无显著性不同,但提示转染试剂及携有无关序列的表达载体对细胞仍是存在必然的毒性作用及脱靶效应,如能有效克服,将使以siRNA为主的基因重组药物发挥更理想的医治作用。
因此,应用RNAi技术可抑制STAT3基因在大肠癌细胞中的表达,人工合成的STAT3siRNAGFP可通过抑制大肠癌细胞的增殖、增进大肠癌细胞的凋亡而发挥抗肿瘤作用,STAT3基因可成为大肠癌医治中重要的靶点。
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