学年浙科版生物选修一新素养同步学案实验2 分离以尿素为氮源的微生物 Word版含答案.docx
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学年浙科版生物选修一新素养同步学案实验2分离以尿素为氮源的微生物Word版含答案
实验2 分离以尿素为氮源的微生物
[学考报告]
知识内容
考试属性
考情解读
分离以尿素为氮源的微生物
加试
1.进行微生物分离。
使用含有尿素的培养基,采用涂布分离法,分离有脲酶的细菌。
2.使用酚红指示剂检测以尿素为氮源的细菌的存在。
3.说明分离以尿素为氮源的细菌的实验原理。
4.举例说明本实验分离出来的细菌不一定都是以尿素为氮源的细菌
一、以尿素为氮源的微生物
尿素
又称脲,是蛋白质降解的产物。
在人和其他哺乳动物如家畜的尿中都含有尿素,植物不能直接吸收尿素,因此大量尿素的存在将对环境造成污染。
以尿素为氮源的微生物
这些细菌可以尿素为氮源,是因为其含有脲酶,通过降解尿素作为其生长的氮源。
其利用尿素的反应式为:
(NH2)2C=O+H2O
2NH3+CO2。
分离以尿素为氮源的微生物所依据的原理
在氮源只有尿素时,这些微生物能利用尿素获得氮源而存活;而其他微生物却不能利用尿素,最终因为缺乏氮源而死亡。
二、从土壤中分离出以尿素为氮源的微生物实验
实验目的
(1)使用以尿素为唯一氮源的培养基分离含有脲酶的细菌。
(2)通过指示剂颜色的变化检知酶(脲酶)所催化的化学反应(培养基pH的变化)。
(3)统计被检测的土壤中含有的以尿素为氮源的微生物的数量。
实验原理
(1)用选择培养基(培养基类型)可分离出以尿素为氮源的微生物。
(2)在细菌分解尿素的化学反应中,细菌产生的脲酶将培养基中的尿素分解成氨,使培养基变碱,pH升高,酚红指示剂变红。
(3)根据培养基中的菌落数,可统计土壤样品中含有的这种微生物的数量。
实验步骤
(1)倒平板:
在60℃左右时,将两只三角瓶中已灭菌的LB固体培养基和尿素固体培养基,在酒精灯旁分别倒入两个培养皿中,在水平的超净台上摇匀,平放至凝固。
(2)制备细菌悬浮液
将土样1g,在无菌条件下加到有99mL无菌水的三角瓶中,振荡10min,制成10-2稀释液;从该稀释液中取0.5mL悬液加到4.5mL无菌水的三角瓶中,经振荡就制成10-3稀释液;再从10-3稀释液中取0.5mL悬液加到4.5mL无菌水的三角瓶中,经振荡就制成10-4稀释液;依此法可依次制备出10-5、10-6……土壤稀释液。
(3)用稀释涂布分离法分离细菌
取10-4和10-5的土壤稀释液各0.1mL,分别加到有LB培养基和尿素培养基的培养皿中,再将保存在70%酒精中的玻璃刮刀放在酒精灯火焰上灼烧,待刮刀上火焰熄灭后,在酒精灯火焰旁打开培养皿,将菌液涂布到整个平面上。
(4)培养:
将培养皿倒置,在37℃恒温箱中培养24~48h。
(5)观察、计数菌落:
比较LB培养基与尿素培养基上的菌落数。
培养基
细菌悬浮液稀释度
10-4
10-5
对照组
LB全营养固体培养基
实验组
尿素固体培养基
1.为什么要用琼脂糖代替琼脂配制固体培养基?
提示:
琼脂是未被纯化的混合物,内含一定的含氮化合物,用琼脂糖替代琼脂后,微生物只能以尿素为唯一氮源,利于对细菌的筛选。
2.有脲酶的细菌在生态稳态上起什么作用?
提示:
如果土壤中有许多尿素,在自然界较高温度下会被水解,水解后的氨使土壤变成碱性,与其他阴离子形成化合物则会使土壤板结。
有脲酶的细菌使植物废弃物和动物尸体降解,并利用所形成的氨,有利于自然界的氮循环。
3.有脲酶的细菌菌落周围为什么有着色的环带出现?
提示:
此细菌能分解尿素产生氨,氨为碱性,酚红指示剂在碱性下为红色,标志着存在脲酶水解尿素的作用,红色区域大小代表脲酶活性强弱和含量的多少。
4.与全营养培养基上的菌落数比较,为什么尿素培养基上只有少数菌落?
提示:
说明能利用尿素的细菌只占少数。
常用的微生物分离纯化方法
稀释涂布平板法
(1)液体稀释法:
将待分离的样品经过大量稀释后,取稀释液均匀地涂布在培养皿中的培养基表面,培养后就可能得到单个菌落。
该法是将已熔化并冷却至约60℃(减少冷凝水)的琼脂培养基,先倒入无菌培养皿中,制成无菌平板。
待充分冷却凝固后,将一定量(约0.1mL)的某一稀释度的样品悬液滴加在平板表面,再用玻璃三角刮刀涂布,使菌液均匀分散在整个平板表面,倒置恒温箱中培养。
(2)涂布平板法:
可省去含菌样品悬液的稀释,直接吸取经振荡分散的样品悬浮液1滴加入1号琼脂平板上,用一支玻璃刮刀均匀涂布,用此涂棒再连续涂布2号、3号、4号平板(连续涂布起逐渐稀释作用,涂布平板数视样品浓度而定),翻转此刮刀再涂布5号、6号平板,经适温倒置培养后挑取单个菌落。
平板划线分离法
将已经熔化的培养基倒入培养皿中制成平板,用接种环蘸取少量待分离的菌液,在培养基表面平行或分区划线如下图,然后将培养皿放入恒温箱里培养。
在线的开始部分,微生物往往连在一起生长,随着线的延伸,菌数逐渐减少,最后可能形成纯种的单个菌落。
几种划线方法如图:
(1)倒平板时,按稀释涂布平板法倒平板,并用记号笔标明培养基名称、编号和实验日期。
(2)划线时在近火焰处,左手拿皿底,右手拿接种环,挑取上述的土壤悬液一环在平板上划线。
划线的方法很多,但无论采用哪种方法,其目的都是通过划线将样品在平板上进行稀释,使之形成单个菌落。
利用选择培养基进行分离
不同的微生物对不同的试剂、染料、抗生素等具有不同的抵抗能力,利用这些特点可配制出适合某种微生物生长而限制其他微生物生长的选择培养基。
用这种培养基来培养微生物就可以达到纯种分离的目的。
此实验用到的选择培养基必须含有碳源、尿素、无机盐、水、酚红。
(1)判断培养基制备是否合格的方法是将接种的培养基和未接种的培养基同时放入37℃恒温箱中培养24~48h,观察未接种的培养基上是否有菌落生长。
如果未接种的培养基上无菌落生长,说明培养基的制备是成功的,否则需要重新制备。
(2)判断选择培养基是否起选择作用,可将LB全营养培养基和选择培养基分别接种,同时放入37℃恒温箱中培养24~48h,观察两种培养基上菌落数目的多少。
如果选择培养基上的菌落数远少于LB全营养培养基上的菌落数,则证明选择培养基确实起到了选择作用。
菌丝尖端切割
菌丝尖端切割适于丝状真菌。
用无菌的解剖刀切取位于菌落边缘的菌丝的尖端,将它们移到合适的培养基上培养后,就能得到新菌落。
1.苯酚是工业生产排放的有毒污染物质,自然界中存在着降解苯酚的微生物。
某工厂产生的废水中含有苯酚,为了降解废水中的苯酚,研究人员从土壤中筛选获得了只能降解利用苯酚的细菌菌株,筛选的主要步骤如图所示,①为土壤样品。
下列相关叙述错误的是( )
A.图中②培养目的菌株的选择培养基中应加入苯酚作为碳源
B.如果要测定②中活细菌数量,常采用稀释涂布平板法
C.若图中④为对照实验,则其中应以苯酚作为唯一碳源
D.使用平板划线法可以在⑥上获得单菌落
答案:
C
2.微生物与人类关系密切。
虽然有些微生物能使动植物患病,但多数微生物对人类是有益的。
请回答有关微生物及其应用的问题:
(1)培养微生物的培养基配方中一般含有水、碳源、氮源和无机盐。
从土壤中分离分解尿素的细菌时,培养基中加的唯一氮源为________,这种培养基称为________培养基。
(2)在制备固体培养基的倒平板操作时,平板冷凝后,为什么要将平板倒置?
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)分离微生物的方法很多,最常用的是平板划线法和________法。
解析:
分离微生物的培养基称为选择培养基,在培养基中添加尿素为唯一氮源可分离分解尿素的细菌;制作固体培养基的倒平板操作时,平板冷凝后,皿盖上会凝结水珠,凝固后的培养基表面的湿度也比较高,将平板倒置,既可以使培养基表面的水分更好地挥发,又可以防止皿盖上的水珠落入培养基,造成污染;分离微生物最常用的方法是平板划线法和稀释涂布平板法。
为保证无菌操作,整个操作过程要在酒精灯的火焰旁进行。
答案:
(1)尿素 选择
(2)皿盖上会凝有水珠,防止水珠落入培养皿造成污染,还可使培养基表面的水分更好挥发
(3)稀释涂布平板
从土壤中分离出以尿素为氮源的微生物实验的相关分析
从合适的土壤中采集微生物
(1)没硬化,腐殖质丰富的土壤含有较多的以尿素为氮源的微生物。
(2)采土样最好的土层是5~25cm。
(3)采土样地点选好后,用小铲子去除5cm表土,取离地面5~15cm处的土样10~25克,盛于预先灭菌的牛皮纸袋中扎紧,并标明时间、地点和环境等情况,以备查看。
实验原理
尿素
NH3
中性 碱性
酚红颜色:
黄色 红色
酚红在酸性环境中呈黄色,在碱性环境中为红色,变色范围是pH为6.4~8.2。
酚红指示剂鉴定尿素分解菌的原理
尿素分解菌向胞外分泌脲酶,产生的脲酶向周围扩散,使培养基中的尿素水解,尿素分解后产生氨,氨为碱性,使培养基变碱,酚红在酸性环境中为黄色,在碱性环境里变为红色,于是酚红由黄变红。
培养基中的酸碱指示剂产生颜色变化,标志着存在脲酶水解尿素的作用,从而证明这一菌株可以以尿素为氮源。
随着培养时间的延长,红色区域的面积越来越大。
红色环状区域的大小代表脲酶活性的强弱和含量的多少。
红色区域越大,表明菌株利用尿素的能力越强。
由此,根据培养基红色的深浅,可判断不同土壤中选择出的微生物对尿素分解能力的高低。
所用培养基的特点
(1)琼脂在制作固体培养基时起凝固剂的作用,但它却是一种未被纯化的混合物,里面有一定量的含氮化合物。
在本实验中所使用的尿素培养基要求提供氮元素的物质只有尿素,用这种培养基才能分离得到含脲酶的细菌。
所以要将琼脂纯化,去除那些含氮化合物,这样经纯化得到的琼脂糖就可以代替琼脂做凝固剂且不会带来含氮化合物对本实验的干扰。
(2)本实验的微生物分离与大肠杆菌的分离的区别
实验名称
分离方法
分离的内容
分离结果
大肠杆菌培养和分离
划线分
离法
从同种菌种中分离得到同种菌的单菌落
在划线的末端出现大肠杆菌单菌落
分离以尿素为氮源的微生物
涂布分
离法
从土壤浸出液里所存在的各种细菌中只将含有脲酶的细菌分离出来
只出现含有脲酶的细菌菌落
(3)全营养培养基与尿素培养基上的菌落在数量和类型上的区别
全营养培养基属于基础培养基,而尿素培养基属于选择培养基。
全营养培养基上的菌落数量和种类都明显多于尿素培养基上的。
因为全营养培养基中的氮源是蛋白胨,很多细菌都能利用它,而尿素培养基中的氮源只有尿素,只有含脲酶的细菌才能利用它。
统计微生物数量的方法
测定微生物细胞数量的方法很多,主要有稀释涂布平板法(又称平板菌落计数法)、显微镜直接计数法、光电比浊法、最大可能数(MPN)法、膜过滤法等。
常规的计数方法是稀释涂布平板法和显微镜直接计数法。
(1)稀释涂布平板法
①过程:
将待测含菌样品经适当稀释,使其中的微生物充分分散成单个细胞,然后取一定量的稀释样品液,接种到平板上。
②计数:
经过一定时间培养后,由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的单菌落,即一个单菌落应代表原样品中的一个活菌,最后统计菌落数,根据其稀释倍数和取样量,换算出单位样品中所含的活菌数。
③优缺点:
优点是可以获得活菌数的信息。
缺点是该计数法操作过程较繁,需要培养一定时间才有结果,且测定结果易受多种因素的影响。
④注意事项:
a.用此法计数时,一般选择菌落数在30~300的平板计数,同时做一系列浓度梯度实验,探究合适的稀释度。
对分解尿素的微生物计数时,一般制备成10-2、10-3、10-4、10-5土壤稀释液。
b.实际上,由于待测样品不易完全分散成单个细胞,故所形成的菌落并非都是单菌落,有一部分是由2个以上的细胞长成的,因此平板菌落计数的结果会比实际值偏低。
现在已采用菌落形成单位(cfu)来表示样品的活菌含量。
(2)显微镜直接计数法
①方法:
测定酵母细胞数或霉菌孢子数常采用在显微镜下直接进行计数的方法,该计数方法被广泛应用于酒精、啤酒和白酒等的工业化生产中。
该法是将酵母菌或霉菌孢子悬液,放在血球计数器载玻片与盖玻片之间的计数室中,在显微镜下直接进行计数,是一种常用的微生物计数方法。
②缺点:
a.不能区分死菌与活菌;b.不适于对运动的细菌计数;c.需要相对高的细菌浓度;d.个体小的细菌在显微镜下难以观察。
(3)光电比浊计数法
光电比浊计数法是采用光电比色计或分光光度计,测定菌悬液的光密度或透光度,其优点是简便迅速,可以连续测定,适合于自动控制。
但该法除了受菌体浓度影响外,还受细胞形态、大小、培养液成分及所采用光波长等因素的影响。
快速检测微生物的方法
(1)原理:
根据微生物特殊的生理特性或利用某些代谢产物的生化反应来设计特殊的分离培养基,通过观察微生物在选择性培养基上的生长状况或生化反应如透明圈、变色圈、抑菌圈等进行分离。
(2)变色圈法:
在平板中加入指示剂或显色剂,使所需微生物能被快速鉴别出来。
产生有机酸或胺等碱性物质的微生物,通常采用pH值指示剂可检测出来。
1.下面是分离分解尿素的细菌所用的培养基配方:
KH2PO4
1.4g
Na2HPO4
2.1g
MgSO4·7H2O
0.2g
葡萄糖
10.0g
尿素
1.0g
琼脂糖
15.0g
自来水
定容至1000mL
请根据以上配方,回答下列问题:
(1)该培养基含有微生物所需要的________类营养物质。
其中最主要的碳源是________,氮源是________。
(2)该培养基按物理性质划分是________培养基;按培养基的作用划分是选择培养基,该培养基具有选择作用的原因是_______________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)在该培养基中,可通过检测pH的变化来判断尿素是否被分解,依据的原理________________________________________________________________________。
(4)若用该培养基来鉴定某种细菌是否能够分解尿素,可在培养基中加入________指示剂,尿素被分解后指示剂变红色。
解析:
该培养基含有碳源(葡萄糖)、氮源(尿素)、水、无机盐4类营养物质;该培养基以尿素为唯一氮源,属于选择培养基,选择培养分解尿素的菌;由于培养基中含有琼脂糖,又属于固体培养基;在细菌分解尿素的过程中,细菌合成的脲酶将尿素分解成氨,氨会使培养基的碱性增强,pH升高,培养基中加入的酚红指示剂在碱性环境中变红。
答案:
(1)4 葡萄糖 尿素
(2)固体 该培养基中,唯一的氮源是尿素,只有能分解尿素的微生物才能在该培养基上生长和繁殖
(3)在细菌分解尿素的过程中,细菌合成的脲酶将尿素分解成氨,氨会使培养基的碱性增强,pH升高
(4)酚红
2.现从土壤中分离以尿素为氮源的细菌,实验过程如下图所示:
→
→
→
→
请回答下列问题:
(1)欲从土壤中分离出能分解尿素的细菌,将土壤用________进行一系列的梯度稀释,同一浓度的土壤稀释液应至少涂布________个平板,通常以每个培养皿中有________个以内的单菌落的那一组稀释倍数为最合适。
(2)接种后的培养皿________于37℃的恒温箱中培养。
若培养基中存在含脲酶的细菌,其菌落周围会出现________,这是由于尿素被分解产生氨气,与该培养基中的________________________产生的颜色变化,从而证明这一菌株能以尿素为氮源。
(3)分离能利用尿素的细菌时所用的培养基成分上最主要的特点是_________________
________________________________________________________________________。
(4)下列操作需要在酒精灯火焰旁进行的是(多选)( )
A.称取葡萄糖、琼脂糖等培养基成分
B.倒平板
C.涂布平板
D.微生物的培养
(5)与LB全营养培养基上的菌落数相比,尿素培养基上只有少数菌落的原因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
解析:
(1)涂布分离法必须先用无菌水对土样进行一系列的梯度稀释,通常以每个培养皿中有20个以内的单菌落的那一组稀释倍数为最合适。
(2)接种后需倒置培养皿恒温培养。
含有脲酶的细菌能够将尿素分解,产生的氨气使培养基呈碱性,导致培养基中的酚红指示剂呈红色。
(3)分离能利用尿素的细菌时所用的培养基应以尿素为唯一氮源的固体培养基。
(4)进行微生物培养和分离时,倒平板、涂布平板均需要在酒精灯火焰旁进行,以防杂菌污染。
(5)尿素培养基只以尿素为氮源,在尿素培养基上生长繁殖的只能是少数能够合成脲酶可利用尿素的细菌。
答案:
(1)无菌水 3 20
(2)倒置 红色环带 酚红指示剂
(3)以尿素作为唯一氮源的(固体)培养基 (4)BC
(5)土壤中能利用尿素的细菌在土壤菌群中只占极少数量
一、选择题
土壤中有些微生物能利用尿素是因为( )
A.其体内含有脲酶
B.其体内含有氨(NH3)酶
C.它能将CO2合成为有机物
D.它们不需要氮源
解析:
选A。
能利用尿素的微生物就是因为体内含有脲酶,可降解尿素为其生长繁殖提供氮源。
从土壤中分离以尿素为氮源的微生物时,所用的LB培养基由以下哪一组成分构成( )
A.蛋白胨、NaCl、水、酵母提取物、琼脂
B.蛋白胨、NaCl、水、琼脂糖
C.蛋白胨、NaCl、水、酵母提取物、琼脂糖
D.葡萄糖、NaCl、水、酵母提取物、琼脂
解析:
选C。
LB培养基必须含五大营养元素:
碳源、氮源、水、无机盐、生长因子。
由于是固体培养基还必须有凝固剂,为与尿素培养基作对比,所用凝固剂不能带来氮源干扰,因此只能选择相对更为纯净的琼脂糖了。
用10-4稀释度的细菌悬液分别涂布于LB、尿素培养基上,培养后的结果,以下叙述正确的是( )
A.LB培养基上未出现任何菌落
B.尿素培养基上出现的菌落数量和种类都多于LB培养基上的
C.尿素培养基上出现的菌落数量和种类都少于LB培养基上的
D.尿素培养基上是不可能出现菌落的
解析:
选C。
LB培养基为完全培养基,会出现大量菌落。
尿素培养基上只有能以尿素做氮源的微生物能存活,因此其上的菌落数量和种类都将会减少。
尿素培养基上出现的菌落就是能利用尿素的那些微生物菌落。
在做分离分解尿素的细菌实验时,A同学从对应稀释倍数为106的培养基上筛选出大约150个菌落,而其他同学只选择出大约50个菌落。
A同学的结果产生原因可能有( )
①由于土样不同 ②由于培养基污染 ③由于操作失误 ④没有设置对照
A.①②③ B.②③④
C.①③④D.①②④
解析:
选A。
该同学可能取的土样不同,可取其他同学的土样进行培养,同时将未接种的培养基同时培养,如果结果不是大约50个菌落,可能是培养基污染或操作有误;如果结果和其他同学数据相同,且未接种的培养基没有菌落生成,说明是土样不同。
能合成脲酶的微生物所需的碳源和氮源分别是( )
A.二氧化碳和氮气B.葡萄糖和氨
C.二氧化碳和尿素D.葡萄糖和尿素
解析:
选D。
能合成脲酶的微生物主要是分解尿素的细菌,其碳源为葡萄糖,氮源为尿素。
某同学在稀释倍数为106的培养基中测得平板上菌落数的平均值为234,那么每克样品中的菌落数是(涂布平板时所用稀释液的体积为0.1mL)( )
A.2.34×108B.2.34×109
C.234D.23.4
解析:
选B。
每克样品中的菌落数=(C÷V)×M=(234÷0.1)×106=2.34×109。
可以鉴定出分解尿素的细菌的方法是( )
A.以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂
B.以尿素为唯一氮源的培养基中加入二苯胺试剂
C.以尿素为唯一氮源的培养基中加入苏丹Ⅲ试剂
D.以尿素为唯一氮源的培养基中加入双缩脲试剂
解析:
选A。
酚红指示剂是灵敏性高的碱性指示剂,分解尿素的细菌合成的脲酶将尿素分解成氨,使pH升高,使酚红指示剂变红。
进行系列稀释时,按怎样的顺序进行( )
A.稀释倍数递增B.稀释倍数递减
C.不论稀释度大小D.A、B两者都可
解析:
选A。
将菌液进行系列梯度稀释,在稀释倍数足够高的菌液里,聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞,从而能在培养基表面形成单个菌落。
有关倒平板的操作错误的是( )
A.将灭过菌的培养皿放在火焰旁的桌面上
B.使打开的锥形瓶瓶口迅速通过火焰
C.将培养皿打开,培养皿盖倒放在桌子上
D.等待平板冷却凝固后需要倒过来放置
解析:
选C。
在倒平板时,左手将皿盖打开一条缝隙,不能将培养皿完全打开,以免杂菌污染。
将接种后的培养基和一个未接种的培养基都放入37℃恒温箱的目的是( )
A.对比观察培养基有没有被微生物利用
B.对比分析培养基上是否生有杂菌
C.没必要放入未接种的培养基
D.为了下次接种时再使用
解析:
选B。
将接种后的培养基和一个未接种的培养基都放入37℃恒温箱的目的是检测培养基是否被杂菌污染,即制备是否合格。
如图为“土壤中分解尿素的细菌的分离和计数”实验中样品稀释示意图。
据图分析正确的是( )
A.3号试管的稀释倍数为103倍
B.4号试管中稀释液进行平板培养得到的菌落平均数恰好为5号试管的10倍
C.5号试管的结果表明每克土壤中的菌株数为1.7×109个
D.该实验方法统计得到的结果往往会比实际活菌数目要高
答案:
C
统计菌落数目的方法是( )
①涂布平板法 ②重量法 ③直接计数法 ④比浊法 ⑤生理指标法 ⑥膜过滤法
A.①②③⑥B.③④⑤⑥
C.②③④⑥D.①③④⑥
解析:
选D。
微生物计数法主要有显微镜直接计数法、平板菌落计数法、光电比浊法、最大可能数(MPN)法、膜过滤法等。
分离以尿素为氮源的细菌和分离大肠杆菌都使用了LB培养基,其成分( )
A.前者含琼脂,后者不含琼脂和琼脂糖
B.两者都含有琼脂
C.前者含有琼脂糖,后者不含琼脂糖但含琼脂
D.两者都不含琼脂和琼脂糖
解析:
选C。
琼脂和琼脂糖都起凝固剂的作用,用于制备固体培养基。
但琼脂为混合物,含少量含氮化合物,琼脂加以纯化,去除含氮化合物就成为琼脂糖。
分离大肠杆菌和含脲酶的细菌用的都是固体培养基,因此都必须含有凝固剂:
琼脂或琼脂糖。
但是,由于琼脂为混合物,其中含一定量的含氮化合物,因此不能用于分离以尿素为氮源的细菌。
琼脂糖为琼脂的纯化物,不含含氮化合物,可用于分离以尿素为氮源的细菌。
下列说法不正确的是( )
A.科学家从70~80℃热泉中分离得到耐高温的TaqDNA聚合酶
B.统计某一稀释度的5个平板的菌落数
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