OsASP2在UVB信号转导中的功能研究 毕业设计论文开题报告.docx
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OsASP2在UVB信号转导中的功能研究毕业设计论文开题报告
华南农业大学
硕士研究生中期考核与学位论文开题报告
OsASP2在UVB信号转导中的功能研究
论文题目
OsASP2在UVB信号转导中的功能研究
选题来源
国家自然科学基金项目
论文类型
基础研究
开题日期
涉密
否
一、立题依据(包括研究目的、意义、国内外研究现状和发展趋势,需结合科学研究发展趋势来论述科学意义;或结合国民经济和社会发展中迫切需要解决的关键科技问题来论述其应用前景。
附主要参考文献目录)
紫外线(UV,200-400nm),位于日光高能区的不可见光线。
UV按波长的不同可分为UV-C(200-280nm)、UV-B(280-320nm)、UV-A(320-400nm)。
UV-B是根据生物效应的不同,将紫外线波长划分出来的一个波段。
尽管只占太阳总能量的约1.5%,但是对地球上的生物来说却代表着一种重要的环境影响。
UVB能对许多生物分子,包括氨基酸、核酸、脂类、蛋白质等产生不利作用,以及引起分子水平,细胞水平,甚至整个生物体层次的应激反应(Brownetal2005)。
根据辐照强度水平的不同,UVB可以对植物造成伤害,也可以是对植物有益的(UlmandNagy,2005)。
尽管高辐照强度的UVB能使细胞受损和引起应激反应,低辐照强度的UVB却可以作为一种信号去调控植物的生长和发育(Frohnmeyeretal,1999)。
低剂量的UV-B对植物的影响主要是通过信号传导来实现的,目前对低剂量的UV-B研究比较深入的是拟南芥。
在拟南芥、水稻、苔藓等中存在一个叫做RUS的基因家族,以及rootUVBsensitive1突变体的发现和研究(Tongetal2008)。
天冬氨酸转氨酶(AAT)是氨基酸的合成关键酶。
氮的运输形式主要是有机物一氨基酸(主要是天冬氨酸,还有少量丙氨酸、蛋氨酸、撷氨酸)和酞胺(主要是天冬酞胺和谷氨酞胺),还有少量以硝酸形式向上运输(潘瑞炽和董愚得,1995)。
AAT是转氨酶家族中最先被提纯出来,用于研究在氮代谢过程中VB6的作用(Rosselletal,1987)。
它广泛存在于动物、植物和微生物体内,对于氨基酸的生物合成和降解起着重要的作用,它的功能包括氮的集聚、转运和贮存,氨基酸的合成和分解代谢。
AAT存在于所有生物体中,在植物氮代谢中具有重要作用。
在拟南芥中发现,细胞质天冬氨酸氨基转移酶AtAAT2在特定位点的突变可以抑制拟南芥rus表型(在极低强度UV-B下植物根发育严重受阻),其机理可能是通过AtAAT2调控PLP在细胞内的稳态而实现的(Colinetal2011)。
水稻是单子叶模式植物,也是我国主要的粮食作物,研究清楚UV-B、OsRUS、OsAAT2及PLP之间是如何相互作用的,不仅具有重要的理论意义,也具有实用价值。
参考文献目录:
周莹.水稻中天冬氨酸转氨酶的分子生物学研究和转基因应用,华中农业大学博士论文2009.
潘瑞炽,董愚得.植物生理学.北京:
高等教育出版社,1995
BrownBAetal.(2005)AUV-B-specificsignalingcomponentorchestratesplantUVprotection.ProcNatlAcadSciUSA102:
18225–18230.
UlmRNagyF(2005)Signallingandgeneregulationinresponsetoultravioletlight.CurrOpinPlantBiol8:
477–482.
FrohnmeyerHLoyallLBlattMRGrabovA(1999)MillisecondUVBirradiationevokesprolongedelevationofcytosolic-freeCa2_andstimulatesgeneexpressionintransgenicparsleycellcultures.PlantJ20:
109–117.
TongHLeasureCDHouXWetal.RoleofrootUV-BsensinginArabidopsisearlyseedlingdevelopment.ProcNatlAcadSciUSA2008105(52):
21039-21044.
RossellJD.Immobilizedaminotransferaseforaminoacidproduction[J].MethodsinEnzymology1987136:
481~497
ColinD.LeasureHong-YunTongXue-WenHouetal.Rootuv-bsensitiveMutantsAreSuppressedbySpecificMutationsinASPARTATEAMINOTRANSFERASE2andbyExogenousVitaminB6.Mol.Plant-2011-Leasure-mp_ssr033.
二、研究内容和目标(说明课题的具体研究内容,研究目标和效果,以及拟解决的关键科学问题。
此部分为重点阐述内容)
1.研究内容
1)OsAAT2的OsASP2基因超表达,干涉和OsASP2的启动子融合GUS以及OsASP2融合GFP
载体的构建与遗传转化及其水稻转基因植株的获得,收获T1代转基因种子,筛选T2代
单拷贝的纯合株系。
2)构建了OsASP2片段的原核表达载体,在IPTG诱导下获得大量目标蛋白表达,OsASP2片
段的原核表达抗体的制备及表达分析;构建了OsASP2全长及特定点突变原核表达载体
在IPTG诱导下目标蛋白表达,AAT2酶活性测定。
3)根据拟南芥天冬氨酸氨基转移酶不同功能的突变位点,构建了不同位点突变的OsAAT2
的载体,遗传转化及其水稻转基因植株的获得;
4)在大肠杆菌、烟草和水稻AAT活性染色,现它们的AAT分子量大小不同,说明可以在大
肠杆菌或烟草中表达水稻突变或非突变OsAAT2的活性。
5)转基因植株筛选,分子检测与生理生化指标分析;
2.研究目标和效果
水稻是单子叶模式植物,也是我国主要的粮食作物,研究清楚UV-B、OsRUS、OsAAT2
及PLP之间是如何相互作用的,不仅具重要的理论意义,也具有实用价值。
3.重点解决的问题
1)UV-B、OsRUS、OsAAT2及PLP之间是如何相互作用,及OsAAT2在调控细胞内VB6稳态
作用机理。
2)研究转基因水稻ASP2在UV-B信号转导中的响应情况。
4.预期的研究成果
初步阐明OsASP2在UV-B信号传导途径中的可能功能
三、研究方案设计及可行性分析(包括:
研究方法,技术路线,理论分析、计算、实验方法和步骤及其可行性)
1.研究方法
(1)利用生物信息学进行序列检索和同源性分析以及性质与功能预测等,并设计引物;
(2)利用分子生物学技术进行分子克隆、载体构建;
(3)利用农杆菌介导法进行水稻基因遗传转化;
(4)利用E.coli原核表达系统,进行外源基因诱导表达及Western免疫印迹检测。
2.技术路线:
OsASP2载体构建
遗传转化原核表达
OsASP2融合GFPOsASP2定点突变OsASP2片段蛋白表达
OsASP2启动子OsASP2全长
OsASP2干涉OsASP2片段抗体制备
OsASP2超表达酶活性测定
OsASP2定点突变
转基因植株筛选分子检测与生理生化指标分析
3.实验方法和步骤
1)成功构建以调控水稻细胞质天冬氨酸转移酶(OsASP2)的超表达及干涉载体,通过农杆菌介导法分别已获得15株独立的水稻转基因株系,收获T1代转基因种子,T2代筛选纯合子。
2)构建了OsASP2片段的的原核表达载体,在IPTG诱导下已获得大量目标蛋白表达,并制备多克隆抗体。
3)根据拟南芥天冬氨酸氨基转移酶不同功能的突变位点,构建了不同位点突变的OsAAT2的载体,将它们分别侵染水稻中花11。
4)对水稻、烟草和大肠杆菌TOP10菌种中天冬氨酸转氨酶(AAT)进行活性染色,发现它们的AAT分子量大小不同,说明可以在大肠杆菌或烟草中表达水稻突变或非突变OsAAT2的活性。
4.可行性分析:
我已经完成相关专业课程的学习,掌握了相应的实验技术。
而且论文订题比较早,已经开始了相关的实验。
且在这一年半的学习中,已经阅读了大量相关的文献,对研究课题比较了解。
加之导师参与过相关课题的直接研究,这些对我的实验都有很重要的指导意义,为课题的顺利完成打下了坚实的基础。
本实验室具备基础生理生化实验及分子生物学研究的常规仪器设备,为本研究提供了硬件支持。
本实验室长期进行载体构建及水稻转化实验,积累了大量经验,为本实验的构建各种载体、农杆菌侵染和基因遗传转化等各种工作提供了理论基础。
四、本研究课题的特色与新颖之处
天冬氨酸转氨酶(AAT)是氨基酸的合成一个关键酶。
AAT存在于所有生物体中,在植物氮代谢中具有重要作用。
在拟南芥中发现,细胞质天冬氨酸氨基转移酶AtAAT2在特定位点的突变可以抑制拟南芥rus表型(在极低强度UV-B下植物根发育严重受阻),其机理可能是通过AtAAT2调控PLP在细胞内的稳态而实现的。
水稻是单子叶模式植物,也是我国主要的粮食作物,研究清楚UV-B、OsRUS、OsAAT2及PLP之间是如何相互作用的,不仅具有重要的理论意义,也具有实用价值。
五、研究基础与工作条件(1.与本项目相关的研究工作积累基础2.包括已具备的实验条件,尚缺少的实验条件和拟解决途径)
1.前期工作基础
a.利用生物信息学检索到一些关于OsASP2的功能预测,进行了序列比对和同源性分析,并设计了引物。
b.PCR扩增得到OsASP2基因,OsASP2启动子基因,测序之后构建了OsASP2过表达载体、OsASP2过表达融合GFP载体、OsASP2干涉载体、OsASP2启动子融合GUS基因载体,同时进行了水稻愈伤组织的诱导与培养。
c.农杆菌介导转化法进行水稻OsASP2过表达、OsASP2过表达融合GFP、OsASP2干涉基因OsASP2启动子融合GUS基因转化。
d.目前已获得OsASP2启动子融合GUS基因、过表达、干涉、以及OsASP2过表达融合GFP转化植株T1代种子,准备种T1代种子筛选纯合子。
f.利用E.coli原核表达系统,OsASP2片段及其诱导表达并制备抗体及Western免疫印迹检测;OsASP2全长基因及其定点突变基因诱导表达,进行酶活性测定。
2.本实验室可供使用的仪器设备和实验条件
本实验室具备基础生理生化实验及分子生物学研究的常规仪器备,比如冷冻高速离心机,分光光度计,超净工作台,移液枪,PCR仪等等。
为本研究提供了硬件支持。
我从开始到学校就确定了这个研究课题,使我有充足的时间去做这个课题:
再加上我的导师原来就参加过相关课题的直接研究(RUS基因在拟南芥中的研究),这些都给我研究打下了坚实的基础。
3.已经获得的经费
本项研究获得国家自然基金资助。
学位论文工作计划
时间
研究内容
预期效果
2012.03~2012.05
载体的构建与水稻的遗传转化
完成
2012.05~2012.07
愈伤筛选、分化成苗、阳性检测,OsASP2片段原核诱导表达及定点突变载体的构建
完成
2012.07~2013.02
酶活性测定及活性染色、定点突变基因水稻遗传转化、免疫兔多克隆抗体的制备及鉴定
完成
2013.02~2013.06
转基因植株纯合子筛选酶活性测定;定点突变愈伤筛选、分化成苗
待完成
2013.06~2014.02
分子检测与生理生化指标分析
待完成
导师意见:
(根据该生的政治表现、思想道德、学习成绩、学习态度、科研能力、遵纪守法和执行学校规章制度等提出是否同意继续攻读硕士学位)
导师(签名):
日期:
年月日
中期考核意见:
(优秀、良好、及格、不及格)
开题报告选题的新颖性与可行性作出简要评价:
小组成员(签名):
日期:
年月日
学科意见:
1.选题与导师研究方向符合度符合()一般()不符合()
2.选题与专业(领域)符合度符合()一般()不符合()
3.选题的新颖性强()一般()不明显()
4.研究的可行性可行()一般()不可行()
5.研究的工作量充足()一般()不足()
6.总体评价优()良()中()差()
学科带头人签名:
学院(盖章):
日期:
年月日
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