4120终稿更正抗金黄色葡萄球菌肠毒素B单克隆抗体的特性与中和保护作用.docx
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4120终稿更正抗金黄色葡萄球菌肠毒素B单克隆抗体的特性与中和保护作用
学校代码:
10610
学号:
S063678
四川大学
硕士学位论文
抗金黄色葡萄球菌肠毒素B单克隆抗体的特性与中和保护作用
CharacteristicsandNeutralizationEffectsofMonoclonalAntibodiesAgainstStaphylococcalEnterotoxinB
作者康延申
学科专业细胞生物学
指导教师郭亚军教授
魏于全教授
2009年04月15日
声明
本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。
据我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得四川大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。
与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。
本学位论文成果是本人在四川大学读书期间在导师指导下取得的,论文成果归四川大学所有,特此声明。
申请人:
指导教师:
目录
摘要
金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)属于热毒素超抗原家族(SAgs)。
SEB可通过激活T细胞,使T细胞过量增殖并释放大量炎症细胞因子,从而导致中毒性休克综合症及死亡。
寻找针对SEB引发疾病的治疗手段非常必要。
本研究中我们制备了10株小鼠抗SEB的单克隆抗体并鉴定了其理化性质,并对4株抗体进行了体内外中和保护实验。
表面等离子共振(SPR)结果显示4株抗体与SEB间有相似的亲和力。
体内外实验结果发现4A3,3C1和3E2抗体的中和效果强于1A5。
此外还通过噬菌体展示随机肽库技术鉴定了它们的抗原表位。
表位筛选分析结果提示4A3和3C1的识别表位定位与SEB与TCR的结合区域内;3E2抗体的识别表位定位于SEB与MHCⅡ分子的结合区域内;而1A5抗体的表位定位在MHCⅡ分子结合区域附近。
最后我们通过偶联单克隆抗体3C1和3E2,制备了同时识别SEB表面TCR和MHCⅡ的双功能抗体3C1-3E2,并观察3C1-3E2双功能抗体在体内外的协同作用。
实验结果显示3C1-3E2双功能抗体中和SEB的作用强于单独使用单克隆抗体。
因此,把两个识别不同功能表位的单克隆抗体,融和形成双功能抗体蛋白,能够同时阻断SEB与TCR和MHCⅡ的结合,具有更有效的中和保护活性,可能成为一种新的免疫治疗候选策略。
ABSTRACT
StaphylococcalenterotoxinB(SEB)belongstoafamilyofpyrogenictoxinsuperantigens(SAgs)whichactivateT-cellsproliferationandmassivereleaseofinflammatorycytokines,leadingtotoxicshocksyndromeanddeath.ItisanurgentneedforthedevelopmentofapassiveimmunotherapyagainstSEB.TenclonesofMAbsagainstSEBwerepreparedandcharacterizedinthisinvestigation.Fouramongthesetencloneswereevaluatedfortheirneutralizationeffectsinvitroandinvivo,andtheiraffinityforSEB.Surfaceplasmonresonance(SPR)indicatedthat4A3,3C1,3E2and1A5hadsimilaraffinitiesforSEB.Invitroandinvivoassaysshowedthattheneutralizationabilitiesof4A3,3C1and3E2weremoreeffectivethanthatof1A5.EpitopesofMAbswereidentifiedbyphagedisplaytechnology.Epitopemappingrevealedthattheepitopesof4A3and3C1localizedtoTCRbindingsitesofSEB,and3E2toMHCⅡbindingsites;whiletheepitopeof1A5wasnearMHCⅡbindingsites.Finally,wepreparedbispecific(3C1-3E2)antibodybyconjugating3C1and3E2,anddemonstrated3C1-3E2functionsynergisticallytoneutralizeSEBinvitroandinvivo.Theseresultssuggestthat3C1-3E2neutralizesSEBmoreeffectivelythaneachoftheMAbsalone.WepredictthatbispecificantibodyproducedbyfusingtwoMAbs,whichrecognizedifferentfunctionepitopesonSEB,couldhavebetterneutralizationpotentialagainstSEBandserveasanovelimmunotherapeuticcandidate.
缩略词表
英文缩写
英文全称
中文名称
Amp
Ampicillin
氨卞青霉素
bp
BasePair
碱基对
BSA
BovineSerumAlbumin
牛血清白蛋白
DEPC
DiethylPyrocarbonate
焦磷酸二乙酯
dNTP
DeoxyribonucleosideRiphosphates
四种脱氧核苷酸
DTT
Dithiothreitol
二硫苏糖醇
EB
EthidiumBromide
溴化乙锭
E.Coli
Escherichiacoli
大肠杆菌
ELISA
EnzymeLlinkedImmunosorbentAssay
酶标记免疫吸附测定法
FBS
FetalBovineSerum
胎牛血清
HRP
HorseradishPeroxidase
辣根过氧化物酶
mRNA
MessengerRNA
信使RNA
NC
Nitrocellulose
硝酸纤维素膜
OD
OpticalDensity
光密度
PAGE
PolyacrylamideGelElectrophoresis
聚丙烯酰胺凝胶电泳
PBS
Phosphate-bufferedSaline
磷酸盐缓冲液
PCR
PolymeraseChainReaction
聚合酶链式反应
PEG
PolyethyleneGlycol
聚乙二醇
pfu
PlaqueFormingUnit
噬菌斑形成单位
rpm
Roundsperminute
每分钟转速
RT-PCR
ReverseTranscriptasePCR
逆转录PCR
SPDP
N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithiol)propionate
3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯
SEB
StaphylococcalEnterotoxinB
金黄色葡萄球菌肠毒素B
前言
革兰阳性(G)菌脓毒症的发病率逐年上升,其中金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)是烧伤创面感染和急性肝功能衰竭的重要病原菌。
由于其致病因素复杂、耐药性不断增强,特别是中间型抗万古霉素金黄色葡萄球菌的出现,金黄色葡萄球菌感染所致脓毒症的防治已成为现代创伤外科和危重病医学面临的棘手难题之一。
近年发现,造成医院感染的耐青霉素金黄色葡萄球菌,80%以上产生金黄色葡萄球菌肠毒素(StaphylococcalEnterotoxin)。
个别医院分离株几乎100%产肠毒素。
金黄色葡萄球菌肠毒素,尤其是肠毒素B(StaphylococcalEnterotoxinB,SEB)因其“超抗原”特性以及在中毒性休克综合征发病中的特殊意义而倍受关注。
SEB是一种细菌外毒素,为单一多肽链,耐酸,耐热。
在沸水中,几分钟不变性,在冰点能保存一年以上。
编码SEB的entB基因由1709个碱基对组成[1]。
起始密码子ATG位于244bp处,TAG终止密码在在1042bp处,开放阅读框架共798bp,编码266个氨基酸。
分子量约为28366道尔顿。
SEB的二级结构含29残基α螺旋,71-β折叠,88-β-转角,55不规则构象。
最稳定的结构是二硫桥连周围的β规折叠,有一半以上二硫桥与蛋白质三维结构和肽链B一构象有关。
经x线衍射分析SEB的晶体结构显示,SEB分子由两个结构域组成[2]。
结构域1(N末端)由氨基酸1-120组成,结构域2(C末端)由氨基酸127-239组成,两者之间有6个氨基酸组成的桥。
结构域1含有3个β折叠层,由β1、β4和β5组成,也含有螺旋α1、α2、α3和1个二硫键。
两个折叠层形成一个圆柱状管。
此外SEB氨基末端结构域内存在一个二硫环,二硫环内和附近的氨基酸残基与毒素的致吐效应有关,其确切机制尚不清楚。
结构域2由两部分组成:
第1部分由α4和α5螺旋及β8和β11两个短链组成,第2部分由β6、β7、β9、β10和β12链组成。
SEB属于超抗原,不需要APC的加工处理,以完整的蛋白质分子直接与在MHCⅡ类分子的α分结构域和TCR的β链V区结合,从而刺激T细胞活化增殖,同时释放大量细胞因子。
SEB通过与MHCⅡ类分子和TCR形成一个三元复合物激活T细胞,对T细胞的激活效率比普通抗原高103-105倍,因此,微量的SEB就能诱导机体产生免疫应答。
SEB引起T细胞早期的活化过程,类似普通抗原与TCR的结合,包括磷脂酶C的活化,PKC的激活,从而使细胞内Ca2+浓度增高。
这些早期活化的过程诱导淋巴因子的产生或淋巴因子受体表达,释放大量细胞因子。
SEB是NF-高。
的强激活剂。
NF-活剂的拮抗剂可以减弱金葡菌SEB诱导的T细胞激活。
SEB对不同的白细胞抗原分子有不同的亲和力,亲和力强弱依次为HLA-DR-DP。
SEB与MHCⅡ类分子的α1结构域和SEB分子的N末端结构域之间,以低亲和力结合。
SEB和HLA-DR1间的主要作用是SEB的谷氨酸(Glu)67,酪氨酸(Tyr)89和赖氨酸(Lys)39HLA-DR1的间形成的盐桥作用和SEB疏水端的侧链与HLA-DR1的α1螺旋和β片层间区域相互作用。
SEB与MHCⅡ作用位点还涉及到疏水区域的亮氨酸(Leu)45和急性区域谷氨酸(Glu)67,酪氨酸(Tyr)89和酪氨酸(Tyr)115。
SEB与TCRVβ相互作用的氨基酸残基是:
结构域1的天冬氨酸(Asn)60,酪氨酸(Tyr)90和酪氨酸(Tyr)91。
结构域2的苏氨酸(Thr)18,甘氨酸(Gly)19,亮氨酸(Leu)20,谷氨酸(Glu)22,天冬氨酸(Asn)23,酪氨酸(Tyr)26,天冬酰胺(Asn)60,酪氨酸(Tyr)90,酪氨酸(Tyr)91苯丙氨酸(Phe)176和谷氨酸(Glu)210。
点突变这些氨基酸中任何关键区域,都破坏SEB与MHCⅡ和TCR的结合。
目前针对SEB诱导的中毒性休克尚无有效的方法在人体中应用。
静脉输注混合人体血清在一定程度上能缓解症状,但由于其来源的有限性和效果的多变性,它的应用受到的很大限制[3,4]。
有多个研究组也获得了一些小鼠抗SEB的中和性单克隆抗体[5,6],但只能达到部分的中和保护效果(63%)[6]。
在SEB诱导的小鼠中毒性休克综合症模型中,SEB的中和性肽段[7]和T细胞受体拮抗剂展示了较好的中和保护效果[8]。
此外,有MHCⅡDR1区域和TCRVβ区域通过连接子构成的双特异性嵌合型抑制体,能有效阻止SEB与抗原递呈细胞上的MHCⅡ分子和T细胞上的TCR的结合[9]。
但是,由于其无法清除人体内的SEB,因而有一定的局限性。
本课题应用杂交瘤技术制备了10株抗SEB单克隆抗体,其中4株单克隆抗体与SEB有较高的亲和力。
我们对这4株单克隆抗体做了进一步的研究,应用噬菌体展示随机肽库技术筛选并鉴定4个单克隆抗体的抗原表位。
在体外T细胞增殖实验,细胞因子分泌实验和体内小鼠生存率实验,及细胞因子分泌实验中,发现4株抗体均有中和保护作用,其中4A3,3C1和3E2中和效果强于1A5抗体。
由于3C1和3E2抗体识别不同的抗原表位,我们利用化学偶联SPDP法,将3C1和3E2偶联构成同时识别TCR和MHCⅡ结合域的双功能性抗体。
针对SEB表面不同功能表位的双功能抗体或单抗联合使用在体内外对SEB的中和活性具有显著的协同作用,提示抗体的偶联对抗体各自功能的发挥没有影响。
抗SEB双功能抗体有潜力成为一种新的免疫治疗候选策略。
第一部分小鼠抗SEB单克隆抗体的制备
一、材料与方法
主要试剂和仪器
细胞株
●小鼠骨髓瘤细胞株NS1:
本室保存
●
实验动物
●Balb/c小鼠:
6-8周龄,购自中国科学院上海动物中心,饲养于第二军医大学动物中心
●
载体
●pGEM-Teasy:
Promega公司
●
●pPICZαA:
本所保存
●
菌种
●大肠杆菌TG1:
AmershamPharmacia公司
●
工具酶
●限制性内切酶:
NewEnglandBiolabs
●
●T4DNA连接酶:
NewEnglandBiolabs
●
●高保真Taq聚合酶:
Roche公司
●
试剂盒
●小量质粒抽提纯化试剂盒:
上海华舜生物工程公司
●
●胶回收试剂盒:
上海华舜生物工程公司
●
●RT-PCR反转录试剂盒:
Takara宝生物公司
●
引物
●引物序列由上海生工公司予以合成
●
主要试剂
●TrizolReagent:
Invitrogen公司
●
●FBS:
GIBCO公司
●
●辣根过氧化酶标记的羊抗鼠抗体(Goatanti-mouse-HRP):
Santa
●
●细胞冻存液:
30%胎牛血清+10%DMSO+60%无血清培养基,过滤除菌
●
主要仪器设备
●PCR仪:
MJResearch公司
●
●复日FR-980生物电泳图像分析系统:
上海复日生物实验技术公司
●
●UV-2401PC紫外分光光度计:
Shimadzu
●
●5810R台式低温离心机:
Eppendorf
●
●电热恒温水槽:
上海精宏实验设备有限公司
●
●Spectra型酶标仪:
Tecan
●
●96孔酶标板:
Greiner
●
方法
1.SEB基因的构建、蛋白的表达纯化
1.1构建SEB原核表达质粒
为克隆表达SEB基因,我们参照GENEBANK的SEB序列(序列号:
NC-002951),全基因合成了SEB原核基因片段。
ATTGTCGACTGACGACGACGACAAGatgtataagcgtctgtttatttcccatgtaattctgatcttcgcactgatcctggttatttctaccccgaacgttctggcagagtcccagccggatccgaaaccggatgagctgcacaaatcctccaaattcactggtctgatggaaaacatgaaagttctgtacgatgataaccacgtatccgctatcaacgttaaatccatcgaccagttcctgtacttcgacctgatctactccatcaaagacactaaactgggtaactacgataacgttcgtgttgaatttaaaaacaaagatctggctgacaaatacaaagacaaatacgttgacgttttcggtgctaactactactaccagtgctacttctccaaaaaaaccaacgacatcaactcccaccagaccgacaaacgtaaaacctgcatgtacggtggtgttaccgaacacaacggtaaccagctggacaaataccgttccatcaccgttcgtgttttcgaagacggtaaaaacctgctgtccttcgacgttcagaccaacaaaaaaaaagttaccgctcaggaactggactacctgacccgtcactacctggttaaaaacaaaaaactgtacgaattcaacaactccccttacgaaaccggttacatcaaattcatcgaaaacgaaaactccttctggtacgacatgatgccggctccgggtgacaaattcgaccagtccaaatacctgatgatgtacaacgacaacaaaatggttgactccaaagacgttaaaatcgaagtttacctgaccaccaaGaaaaaGTAAGCGGCCGCAAT
其中方框部分为酶切位点:
GTCGAC为SalI酶切位点,GCGGCCGC为NotI酶切位点,GACGACGACGACAAG为EK酶切位点。
斜体字母为根据密码子使用频率进行的突变,氨基酸序列不变。
并设计了pGEX-4T-2载体引物,通过PCR扩增SEB基因4Tsense-1:
5'-ATTGTCGACTGACGACGACGACAAGatgtataagcgtctgttt-3';4Tantisene:
5'-ATTGCGGCCGCTTACTTTTTCTTGGTGGTCAG-3'。
按照以下配制PCR反应液:
DNA片段
2A:
配制
10A:
配制缓冲液(含Mg2+)
5液:
配制
Forward引物(10pmol/GACAA110p
Reverse引物(10pmol/μl)
1l
dNTP混合物(2.5mMeach)
4ach)
高保真Taq聚合酶
0.75)
灭菌双蒸水
36.25l
总体积
5025
↓94℃,2min
↓94℃,15sec;55℃,30sec;72℃,45sec(×5secles)
↓72℃,7min
↓10℃,hold
配制1%琼脂糖,凝胶电泳分离鉴定目的片段。
胶回收试剂盒回收目的片段。
将目的片段与pGEXP-4T-2载体连接,转化DH5L感受态细胞,铺LB-Amp平板。
从平板上挑取单克隆进行SalI和NotI双酶切鉴定,阳性克隆做SEB诱导表达。
1.2SEB蛋白的原核表达
SEB诱导菌的准备
取鉴定的SEB阳性克隆甘油菌,接种于5mlLB培养基,培养基中Amp浓度100μg/ml。
37℃,250rpm恒温摇床培养细胞,到细菌OD600到1.2。
取出1ml菌液,室温,全速,5min离心,倒掉上清液,加入Tris(200(清20mM/ml,pH8.0)裂解液超声裂解细菌,直到细菌液体呈透明澄清,离心收集上清液,即为诱导前的SEB蛋白。
IPTG诱导表达
剩余菌液中加入IPTG,IPTG的浓度分别是0.2mM,0.4mM,0.6mM,0.8mM,1.0mM,20℃诱导2h,室温,全速,5min离心,倒掉上清液,加入Tris(200μl20mM/ml,pH8.0)裂解液超声裂解细菌,直到细菌液体呈透明澄清,离心收集上清液,即为诱导后的SEB蛋白。
10%SDS-PAGE电泳通过考马斯亮蓝染色鉴定表达的SEB蛋白。
1.3SEB蛋白大量的制备、纯化
选取最佳的表达诱导条件,20℃,IPTG浓度0.5nM,进行大量诱导表达。
收集好的细菌,用Tris(200μl20mM/ml,pH8.0,按照1:
20的比例加裂解液),通过超声裂解细菌,到菌液不黏稠,4℃,6000rpm,15min高速离心收集上清。
通过ProteinGST亲和层析柱纯化SEB-GST蛋白。
将SEB-GST蛋白经EK酶酶切后,再次过GST亲和层析柱,收集流穿液,浓缩后即获得纯的SEB蛋白。
2.鼠抗SEB单克隆抗体的制备
免疫Balb/c小鼠
Balb/c小鼠,6-8周龄,雌性较好。
每三只为一组。
初次免疫:
福氏完全佐剂和溶于PBS的抗原(纯的SEB蛋白)以1:
1充分混合,达到“油包水”的状态为最佳。
抗原剂量为100最佳每只鼠。
腹腔注射每只小鼠0.2ml。
二次免疫:
在初次免疫2周后进行。
福氏不完全佐剂和溶于PBS的抗原以1:
1充分混合。
剂量与初次免疫相同。
每只腹腔注射0.2ml。
第三次免疫:
在二次免疫的三周后进行。
福氏不完全佐剂和溶于PBS的抗原以l:
1充分混合。
剂量与前两次相同。
腹腔注射0.2ml。
并在5-7天后取眼眶血分离血清,纯化的SEB包被酶标板,以ELISA检测小鼠血清中SEB抗体的滴度。
加强免疫:
第三次免疫后3周,可以进行加强免疫。
不需要加佐剂,剂量可以加倍,0.2ml腹腔注射。
三天后可以进行融合实验。
NS1骨髓瘤细胞实验前两周左右开始复苏。
融合前准备4-6瓶状态好的细胞备用。
用RPMI1640培养。
胎牛血清10%,最大密度<106/ml,37℃,5%CO2培养。
2-3天传代一次。
一瓶分三瓶。
融合前要求保证其处于对数生长期。
冻存液为60%1640不完全培养基,30%胎牛血清,10%DMSO。
融合实验前后需制备饲养细胞。
其主要作用是可以提供细胞密度,吞噬死细胞和分泌细胞生长因子等。
饲养细胞
饲养细胞的制备具体步骤:
↓采用与免疫小鼠相同的品系的小鼠。
↓引颈处死,浸泡于70%酒精中5-10min。
↓无菌操作,剪开皮肤,充分暴露腹膜。
↓用0℃预冷的注射器(大号针头)注入5m1的0℃预冷不完全培养基。
↓挤压腹膜,吸出培养基。
注意针孔朝上,缓慢吸抽,并配合挤压腹膜,使液体汇聚。
可以吸出4-5ml。
↓用0℃预冷的20%FBS培养基补足用量。
(一只鼠可以制备2-3板,无需计数)加HAT(或HT)培养基和双抗。
↓细胞培养板每孔加100μl。
↓37℃,5%CO2培养。
融合实验
融合实验具体步骤:
↓免疫小鼠脾细胞的分离
弯头镊子取眼血,离心,取血清保存。
引颈处死免疫鼠,于70%酒精中消毒10min。
颈椎脱臼法处死小鼠;取
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