最新临床检验基础实验指导.docx
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最新临床检验基础实验指导
临床检验基础学实验指导
血液常规检验
一、微量吸管的使用、毛细血管采血、计数板的鉴定与使用
【实验目的】:
掌握微量吸管的使用、毛细血管采血、计数板的鉴定、构造与使用。
【实验试剂】:
红细胞稀释液、75%乙醇、消毒药棉。
【实验器材】:
一次性采血针、计数板、盖玻片、微量吸管、2ml吸管、中号试管、显微镜、小玻璃棒。
【实验原理】:
一次性采血针刺破毛细血管后,用微量吸管吸取一定量的血液,稀释一定的倍数,冲入计数池计数一定体积内的细胞的数量。
【实验方法】:
一、微量吸管的使用:
用抗凝血训练微量吸管的使用。
二、毛细血管采血(以红细胞计数为例):
准备:
取清洁干燥试管一支,加2ml红细胞稀释液。
采血部位选择、按摩→75%乙醇棉球进行刺针部位皮肤消毒→待酒精挥发干(否则血流不成滴)→自指尖腹内侧迅速刺针→擦去第一滴血→准确吸取10ul血液→用无菌干棉球压住伤口止血→用无菌干棉球擦去管尖外围余血后→将血液释放到稀释液底部→回吸上清液2-3次→轻轻混匀。
三、计数板构造与应用
1.计数板构造
外观构造:
每块计数板由“H”型凹槽分上下两个计数室,在计数室两侧各有一条支柱,比计数室高出0.1mm,将一块平整光滑的血细胞计数专用盖玻片(24.0mm×20.0mm×0.6mm)覆盖其上时,盖玻片与计数室间形成0.1mm的缝隙。
格子构造:
计数池长、宽各3mm,平均分成9个大格,每个大方格的容积是0.1mm3四角的四个大方格分别用单线划分成16个中方格,是白细胞计数区域;中央的大方格用双线条划分成25个中方格,每个中方格又用单线划分成16个小方格,其中四角和正中的5个中方格是红细胞计数区域。
2.计数板的使用:
用清洁干燥柔软的纱布擦拭计数板及盖玻片→用推盖法从计数板下缘向前平推盖玻片将其盖在计数室上→充分混匀细胞悬液→充池→静置→观察细胞分布情况(若严重不匀,应重新充池。
)
【注意事项】:
1.采血部位应选择皮肤完整,不能有烧伤、冻疮、发绀、水肿或炎症。
2.针刺应迅速,深度适宜(约2-3mm)。
待血液自行流出,擦去第一滴血。
3.微量吸管取血时应将微量吸管管尖侧着插入血滴中央。
若血流不暢,可以左手自采血部位远端向指尖稍压力至血液流出为止。
切忌用力挤压,造成组织液混入,影响结果准确性。
4.计数板在使用中勿让手指接触计数池及盖玻片表面,以访油腻污染,致使充液时起泡。
二、血涂片的制作,瑞氏染色
【实验目的】:
掌握血片制作方法,瑞氏染色原理及方法。
【实验试剂】:
瑞-吉氏复合染液(Ⅰ液、Ⅱ液)
【实验器材】:
显微镜、载玻片、推玻片、一次性针头、消毒棉球、洗耳球
【实验原理】:
细胞的着色既有化学的亲和作用,又有物理的吸附作用,不同的细胞由于其所含化学成分不一样,化学性质各不相同,所以对染料的亲和力也不一样,因此将细胞染成不同的颜色。
【实验方法】:
一、瑞一吉氏复合染液配制
Ⅰ液:
取瑞特染粉1g,吉姆萨染粉0.3g,置洁净研钵中,加少量甲醇(分析纯),研磨片刻,吸出上层染液,再加少量甲醇,继续研磨,再吸出上层染液。
如此连续几次,共用甲醇500ml。
收集于棕色瓶中,每天早晚各振摇3′共5天,再存放一周,将染液过滤后即可使用。
Ⅱ液:
磷酸盐缓冲液(PH6.5—6.8),取磷酸二氧钾(无水)6.64g,磷酸氟二钠(无水)2.56g,加少量蒸馏水溶解,调整PH后,加水至1000ml。
二、血片制作、瑞氏染色方法
准备:
取清洁干燥载玻片,边缘光滑清洁推玻片各一张。
1、制备血涂片:
取载玻片→取血1滴于载玻片右端(边缘留1.5cm空隙)→左手持载玻片,右手持推玻片→将推玻片放至血滴前沿逐渐后移至血滴沿推片散开后,推玻片与载玻片成30°~35°的夹角以平稳的速度将血液向前推进→干燥(手持载玻片末端迅速在空气中挥动干燥)。
2、染色:
将干透的血涂片放在水平位置→加瑞吉氏复合染液Ⅰ液数滴,以染液覆盖整个血膜为度→静置染0.5~1min→滴加约2倍于Ⅰ液量的Ⅱ液→用洗耳球吹气混匀→染色5-10min→平持玻片用流线型水洗→干燥→镜检
【注意事项】:
1.严格皮肤消毒。
2.血滴大、血黏度高、推片角度大、速度快则血膜厚,反之则血膜薄。
3.染料放置时间越长,美兰逐渐氧化为天青,染色效果越好。
4.染液淡,室温低,细胞多则染色时间长,反之减少染色时间。
5.水洗方法为平持血涂片流线型水缓缓冲洗干净,不要先倒掉染液。
三、白细胞计数(WBC)
【实验目的】:
掌握白细胞计数的原理、操作方法与结果报告。
【实验原理】:
用白细胞稀释液将全血稀释一定的倍数并破坏红细胞,充入血细胞计数池,显微镜下计数一定体积的白细胞数,经换算求出每升血液中的白细胞数量。
【实验试剂】:
白细胞稀释液
【实验器材】:
显微镜、改良Neubauer计数板、试管、微量吸管、玻璃棒
【实验方法】:
准备:
取清洁干燥试管一支,加0.38ml白细胞稀释液。
采血部位按摩→75%乙醇棉球进行刺针部位皮肤消毒→待酒精挥发干(否则血流不成滴)→自指尖腹内侧迅速刺针→擦去第一滴血→准确吸取20ul血液→用无菌干棉球压住伤口止血→用无菌干棉球擦去管尖外围余血后→将血液轻轻释放到稀释液底部→回吸上清液2-3次→混匀→室温静置至液体变为棕褐色即红细胞破坏完全→清洁计数板、盖玻片→充池→静置2-3min待细胞下沉→低倍镜下计数四角大方格内的白细胞总数→计算→报告。
计算:
WBC=四个大方格内的白细胞数(N)/4×10×20×106=N/20×109/L
【注意事项】:
1.采血部位应选择皮肤完整,不能有烧伤、冻疮、发绀、水肿或炎症。
2.针刺应迅速,深度适宜(约2-3mm)。
待血液自行流出,擦去第一滴血。
3.稀释液要过滤使用,试管、计数板均须清洁,以免混入杂质被误认为白细胞。
4.加稀释液、血液量应精确,以保证稀释倍数。
5.计数池内细胞分布要均匀,每个大方格间白细胞数差异不得超过均值的±10%,否则要重新充液计数。
6.严格掌握计数原则,以免人为扩大或缩小计数区域。
7.白细胞数量过高时,可加大稀释倍数,反之白细胞过低时可计数8个大方格内白细胞数或加大取血量。
四、白细胞分类计数(DC)
【实验目的】:
掌握显微镜法外周血分类计数的方法、各种白细胞的镜下形态。
【实验原理】:
将血液制备成涂片,经瑞-吉氏染色后显微镜下根据白细胞的形态特征进行分类计数。
通常分类100个白细胞,计算得出各种白细胞所占百分比。
【实验试剂】:
瑞-吉氏复合染液
【实验器材】:
显微镜、外周血标本片、香柏油、擦镜纸、清洁剂
【实验方法】:
准备:
血涂片制备及瑞-吉氏染色待干
低倍镜下选择细胞分布均匀、着色良好的区域→转油镜按一定的规律移动视野,依次进行分类计够100个白细胞→算出各种白细胞的百分比→报告
【注意事项】:
1.涂片制备要厚薄适中、均匀、头体尾分明。
2.分类时要有程序地连续进行,避免主观选择视野。
3.分类中如见幼红细胞,不计入100个白细胞内,以分类100个白细胞过程中见到幼红细胞多少个来报告,并应注明其所属阶段,
4.分类中应注意观察成熟红细胞、血小板的形态染色及其分布情况,注意有无寄生虫(如疟原虫)及其他异常所见。
五、白细胞计数(WBC)及分类计数(DC)
【实验目的】:
掌握白细胞计数及分类计数原理、方法与结果报告
【实验原理】:
白细胞计数原理:
用白细胞稀释液将全血稀释一定的倍数并破坏红细胞,充入血细胞计数池,显微镜下计数一定体积的白细胞数,经换算求出每升血液中的白细胞数量。
白细胞分类计数原理:
将血液制备成涂片,经瑞-吉氏染色后显微镜下根据白细胞的形态特征进行分类计数。
通常分类100个白细胞,计算得出各种白细胞所占百分比。
【实验试剂】:
白细胞稀释液、瑞-吉氏复合染液
【实验器材】:
显微镜、改良Neubauer计数板、试管、微量吸管、玻璃棒、载玻片、推玻片、香柏油、擦镜纸、清洁剂
【实验方法】:
准备:
1.取清洁干燥试管一支,加0.38ml白细胞稀释液。
2.取清洁干燥载玻片,边缘光滑清洁推玻片各一张。
采血部位按摩→75%乙醇棉球进行刺针部位皮肤消毒→待酒精挥发干(否则血流不成滴)→自指尖腹内侧迅速刺针→擦去第一滴血→准确吸取20ul血液→用无菌干棉球擦去管尖外围余血后→将血液轻轻释放到稀释液底部→回吸上清液2-3次→混匀→另取血一滴于载玻片的右端→立即推制血膜→用无菌干棉球压住伤口止血→清洁计数板、盖玻片→充池(静置2-3min待细胞下沉)→低倍镜下计数四角大方格内的白细胞总数→将干透的血膜进行瑞-吉氏染色→油镜下分类计数→计算→报告。
六、红细胞计数(RBC)、Hb测定
【实验目的】:
掌握红细胞计数,Hb测定原理、操作方法,规范的报告结果
【实验原理】:
红细胞计数原理:
用等滲稀释液将血液稀释一滴倍数,充入计数池,在显微镜下计数一定体积内的红细胞数,经换算求得内升血液中的红细胞数。
Hb测定(HiCN法)原理:
血红蛋白被高铁氰化钾氧化为高铁血红蛋白,后者再与氰离子结合形成稳定地氰化搞铁血红蛋白(HiCN),HiCN在规定波长(540nm)和液层厚度(1cm)的条件下具有一定的毫摩尔消光系数。
可用标准的高精度分光光度计进行直接定量测定,或用HiCN标准液进行比色法测定,根据标本的吸光度即可求出血红蛋白浓度。
【实验试剂】:
红细胞稀释液(甲醛枸木缘酸盐稀释液),HiCN转化液
【实验器材】:
改良Neubauer计数板、显微镜、分光光度计、玻璃试管、微量吸管、玻璃棒、
【实验方法】:
RBC:
取清洁干燥试管一支→加红细胞稀释液1.99ml→加未梢血10ul于稀释液底部→吸取上清液嗽洗3—4次→颠倒混匀→清洁计数板,盖玻片→充液→静置2′—3′→计数(中央大格中四角及正中5个方各细胞数)→计算
RBC=5个中方格细胞数×5×10×200×106=5个中方格细胞数×1012/L。
Hb测定:
1.直接定量测定法:
取中号试管一支→加HiCN转化液5ml→加未梢血20ul→混匀静置5′→721比色,波长540nm,以转化液为空白对照管→测其吸光度“A”→计算(“A”×367.7)→报告
2.标准曲线法:
将血红蛋白标准液稀释成不同的三种浓度(150g/L、100g/L、50g/L)分别测其吸光度“A”,以“A”为纵坐标,血红蛋白标准液参考值(g/L)为横坐标,绘制标准曲线。
通过标准曲线查出待测样本的血红蛋白浓度。
【注意事项】:
1.取血应顺利、准确,采血部位不得有烧伤、冻疮、发绀、水肿或炎症,不得过渡挤压,红细胞数量明显增高者可适当加大稀释倍数。
2.HiCN转化液应置棕色瓶于4℃冰箱中,不能储存于白色瓶、塑料瓶及强光下,否则会使CN-丢失,结果偏低。
3.HiCN转化液中有氧化钾剧毒,防止污染。
测定后的比色液不能与酸性溶液混合,否则可产生剧毒的氢氰酸气体。
4.所用分光光度计的波长、吸光度需要校正,带宽应小于1nm,比色杯光径1.000cm时,测定温度为20℃~25℃。
七、血液常规检验
【实验目的】:
掌握血常规的连续操作规程并规范的报告结果。
【实验原理】:
见实验二、三、四、六
【实验试剂】:
红细胞稀释液、白细胞稀释液、瑞-吉氏复合染液、HiCN转化液
【实验器材】:
改良Neubauer计数板、分光光度计、玻璃试管、微量吸管、显微镜、玻棒。
【实验方法】:
取大、中、小号试管各一支→分别加HiCN转化液5ml、红细胞稀释液2ml、白细胞稀释液0.38ml→手指消毒针刺→分别取未梢血10ul于红细胞稀释液中、20ul于白细胞稀释液中、20ul于HiCN转化液中→并及时混匀→取清洁干燥玻片粘取1滴血液于玻片一端→推制血片→待干→721比色→瑞氏染色→白细胞及红细胞计数→DC→计算→报告(血常规结果报告)
正常值:
成人儿童新生儿
1.WBC:
(4-10)
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