医疗机构医院医学实验室凝血因子活性测定技术要求Word格式.docx
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[WS/T359-2011,定义2.1]
3.2
活化部分凝血活酶时间activatedpartialthromboplastintime,APTT
血浆与适量的氯化钙(CaCl2)、部分凝血活酶试剂盒接触因子激活剂(如白陶土)反应后发生凝固所需要的时间。
[WS/T359-2011,定义2.2]
3.3
定标曲线calibrationcurve
校准曲线
参考曲线
定量反映凝血因子活性与纤维蛋白形成所需时间之间的相互关系的曲线。
3.4
参考血浆referenceplasma
校准血浆
定标血浆
已知凝血因子活性的枸橼酸钠抗凝的正常混合血浆。
该血浆可以自备,亦可从制造商处购买,用于制备参考曲线。
3.5
乏因子血浆factor-deficientplasma
缺乏待测凝血因子的血浆。
3.6
质控血浆controlplasma
源于人或动物血,或者人工制成的新鲜、冰冻或冻干的血浆,用于质量控制。
3.7
缓冲液bufferedsaline
具备缓冲pH能力的液体,如Owrens缓冲液、咪唑缓冲液等。
3.8
检测系统measurementsystem
用于检测或评估特定物质存在与否,或对血液、体液中的物质进行定性、定量分析的一组装置。
检测系统包括操作说明和所有的仪器、设备、试剂及(或)获得检测结果所需的物品。
4 检验前过程
4.1 标本采集
依照WS/T359-2011的要求进行标本采集。
静脉穿刺采血时,应规范采血流程,尽量避免引起凝血因子激活的操作。
若患者的血细胞比容异常升高(Hct≥55%),应按WS/T359-2011推荐的公式进行抗凝剂比例的调整。
标本采集前患者应处于平静和空腹状态,剧烈运动和应激反应可使因子Ⅷ活性增加(其作用可持续30min);
脂血可使因子Ⅶ活化,同时干扰以光学法为原理的凝血仪的检测结果,此时可改用手工或磁珠原理凝血仪进行测定。
4.2 标本运送、处理和保存
标本采集后应确认无血凝块存在,采集后1h内在规定的速度和时间条件下(室温、1500g、不少于15min)分离血浆,以获得乏血小板血浆(血小板计数<
10×
109/L),4h内完成血浆标本检测。
依照WS/T359-2011的要求在常温下进行标本运送,标本应在采集后尽快送检(若不能及时检测,应在分离血浆后置于4 ℃冰箱4h内完成检测)。
冰冻血浆在-20℃条件下最多可保存2周,在-70℃条件下最多可保存6个月。
若使用冷藏标本,检测前应将标本于室温放置15min~20min使其恢复至室温。
若使用冰冻血浆标本,应将其置于37℃水浴快速复融至少4min~5min,检测前标本应充分混匀。
4.3 标本拒收标准
实验室应制订不合格标本的拒收标准,可能包括(但不限于以下内容):
a)申请单和试管标签上的信息不一致、试管条码信息错误、试管标签或试管条码脱落。
b)从标本采集到实验室接收标本的时间不符合实验室的规定。
c)当标本存在凝块、溶血、抗凝剂使用错误或采血量不当(与标示量相差超过±
10%)时。
4.4 标本误差来源
可能的标本误差来源包括(但不限于以下内容):
d)标本采集采血量不当(与标示量相差超过±
10%);
e)使用非规定的抗凝剂(如EDTA盐或草酸盐)、抗凝剂的浓度、用量不准确;
f)标本有凝块、溶血、黄疸、脂血或混浊;
g)标本混匀不当,混匀不充分或剧烈混匀,产生气泡等;
h)采血器或贮血管不洁,或受到污染;
使用非规定、不适当的标本采集管;
i)血细胞比容高于或等于55%;
j)急性炎症反应、纤维蛋白原升高或纤维蛋白原异常可使采用PT测定的凝血因子活性不准确;
k)延迟检测或使用不标准的方法处理、运送及贮存测试标本。
5 检验过程
5.1 检测系统
检测方法原理
5.1.1.1 一期法检测onestageassay
检测原理:
基于检测待测样本对乏因子血浆凝固时间(PT或APTT)延长的纠正能力。
将稀释后的待测血浆与乏因子血浆混合后进行PT或APTT检测,检测结果与待测血浆中的凝血因子活性呈负相关。
通过使用凝血因子活性已知的标准血浆与乏因子血浆混合并进行系列稀释混合后进行PT或APTT检测建立的定标曲线,可以得出待测血浆中相应凝血因子的活性。
一期法检测是目前最常用的凝血因子活性测定方法。
基于PT检测的凝血因子:
因子Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ采用PT测定,其中因子Ⅴ和Ⅹ也可采用基于APTT检测的方法进行测定。
基于APTT检测的凝血因子:
因子Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ与Ⅻ
5.1.1.2 二期法检测twostageclottingassay
该方法适用于因子Ⅷ活性检测,其原理为:
基于检测因子Ⅷ作为辅因子与因子Ⅸa形成复合物活化因子Ⅹ的能力,通过检测生成的因子Ⅹa的量可计算因子Ⅷ的活性。
该实验分为两步进行,第一步:
待测样本与含有磷脂、钙离子、因子Ⅸa以及因子Ⅹ的试剂溶液进行孵育后生成因子Ⅹa;
第二步再加入过量的凝血酶原和纤维蛋白原,检测纤维蛋白凝块形成的时间。
测得的凝固时间可以通过查对已知凝血因子活性的参考曲线或代入回归方程,得到凝血因子活性。
5.1.1.3 发色底物法检测chromogenicassay
该方法是二期法检测的改进方法,第一步:
第二步加入发色底物进行检测,因子Ⅹa可作用在发色底物S2765,使其释放对硝基苯胺(paranitroaniline,pNA),后者可在405nm波长条件下通过读取吸光度值计算该物质的生成量,进一步通过计算转换为凝血因子活性。
检测系统选择
实验室宜选用仪器与试剂配套的检测系统。
使用非配套检测系统时应对其性能进行充分验证(validation)。
实验室在选择检测系统时,还应考虑的因素(但不限于以下内容)包括:
l)临床标本性状:
黄疸、脂浊等影响光散射强度的标本适宜选择采用物理学检测原理的检测系统(如磁珠法)进行测定。
m)标本数量与检测速度:
检测系统能够在规定时间内完成常规标本和急诊标本的测定。
5.2 试剂和耗材
APTT试剂
不同APTT试剂由于激活剂的不同而对凝血因子活性检测的敏感性存在差异。
检测凝血因子缺乏时,宜选用对凝血因子缺乏有高敏感性的APTT试剂(可检出凝血因子活性<
30%的样本,包括凝血因子Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ等)。
针对怀疑存在狼疮抗凝物的标本,宜使用对磷脂不敏感的APTT试剂盒。
实验室在更换APTT试剂时,应进行新旧试剂间检测结果的比对:
不同批号的APTT试剂分别至少检测20份样本,取其均值进行比对。
PT试剂
不同凝血活酶因其来源不同(可来自人、兔、牛、猴等脑或其他组织)而具有不同的敏感度。
应选择敏感度高(ISI≤1)的凝血活酶试剂,实验室在更换凝血活酶试剂时,应对其ISI值进行评估。
乏因子血浆
乏因子血浆应符合以下要求:
相应凝血因子活性低于0.01IU/mL(1%),其他凝血因子活性高于0.5IU/mL(50%),纤维蛋白原含量高于1.0g/L。
实验室应对每个批次的乏因子血浆进行检测,以确保所用的乏因子血浆质量符合上述要求。
乏因子血浆应在冷藏(冻干形式)或冰冻(贮存-70℃冰箱)条件下妥善保存。
参考血浆
通常使用商品化的标准血浆或校准血浆,其标示值需溯源至国际标准物质(如世界卫生组织发布的国际标准品)。
若实验室自行制备参考血浆,应至少使用20例以上健康志愿者(男女各半,年龄18岁~55岁,六个月内未服用任何药物,女性未处于妊娠期或月经期)的混合血浆。
血浆制备时需进行两次离心以确保充分去除血小板,以国际标准物质作为溯源标准确定其凝血因子活性水平,并保证凝血因子的活性在(1±
0.2)IU/mL。
试剂误差来源
可能的试剂误差来源包括(但不限于以下内容):
a)试剂已被污染;
n)配制的试剂未采用I级试剂级水或厂家指定用水、复溶时使用非规定的稀释液、复溶时稀释液加量不准;
o)在运输或贮存过程中,因处置不当(如温度等因素)而导致试剂变质;
p)所用试剂超过了有效期或复溶后的稳定期。
5.3 定标曲线
正常值定标曲线
采用全自动血液凝固分析仪进行凝血因子活性检测时,可按照仪器生产厂商的要求预先设定参考血浆的稀释比例并使用配套参考血浆制作定标曲线。
参考血浆的稀释比例应至少包括1/10、1/20、1/40和1/80四个水平。
采用手工法或半自动血液凝固分析仪进行检测时,需根据不同比例稀释样本的PT或APTT检测结果与对应的稀释比例在对数-线性(外源性凝血因子活性检测)或双对数(内源性凝血因子活性检测)坐标纸上手工绘制定标曲线。
(示例见附录A)
定标曲线的线性范围内的r值应≥0.99、斜率应在0.9~1.1范围内。
频率:
对于采用手工法或半自动方法进行凝血因子活性检测时每批次均需建立本次的定标曲线;
全自动检测方法在试剂批号更换、仪器设备调整、室内质控失控等情况下需重新建立定标曲线。
低值定标曲线
针对低值标本(凝血因子活性水平<
5%,以凝血因子Ⅷ、Ⅸ最为常见)应建立低值定标曲线,参考血浆按照1/5、1/10、1/20……的比例进行稀释,其余要求同正常定标曲线的制备。
5.4 性能验证
性能验证一般要求
新的检测系统用于临床检测前,依据厂家说明书的要求进行校准和性能验证,至少应包括批内精密度、批间精密度、正确度和可报告范围等。
验证周期:
在更换设备、组件以及试剂时需要进行性能验证。
重复精密度
重复精密度又称批内精密度,是以连续检测结果的变异系数(CV)为评价指标。
重复精密度的验证方法:
至少使用两个浓度水平(包含正常和异常水平)的质控物或临床样本进行检测,每个样本按常规方法重复检测11次,剔除第1次检测结果,计算后10次检测结果的变异系数。
CV应达到表1的要求。
表1凝血因子活性检测重复精密度检测要求
检测项目
内源凝血因子(APTT途径)
外源凝血因子(PT途径)
变异系数
正常样本
5%
异常样本
10%
批间精密度
批间精密度以室内质控检测结果的变异系数为评价指标。
批间精密度的验证方法:
至少使用两个浓度水平(包含正常和异常水平)的质控物或临床样本,在样本检测当天至少进行1次室内质控,剔除失控数据后按批号或按月份,计算累计在控数据20次结果的变异系数,CV值应达到表2的要求。
表2凝血因子活性检测批间精密度检测要求
变异系数(CV)
15%
正确度
正确度以国际标准物质或商业校准物实际检测结果与理论值
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