毛细管电泳中高盐样品在线富集的研究进展Word文件下载.docx
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[3][4]
用Z型或泡状毛细管可以延长有效光路长度,但会降低CE的分辨率。
上样量增加可使谱带展宽,
故有必要采取切实的方法来提高上样量和灵敏度,同时又不影响分离效率。
样品在线富集是CE最常
[5,6][7~10]
用的方法之一。
场放大进样富集法field2amplifiedsampleinjection,FASI可使灵敏度提高100
[5,11][12]
倍,甚至10,000倍以上。
然而FASI仅限于低盐或无盐样品的富集,而许多样品如血液、尿液、
[13]
海水及废水通常都含有大量的盐,因此,FASI在使用上有很大的局限性。
另外,常用的等速电泳和
[14,15]
电堆积等方法也不能直接富集这些高盐样品。
如采用上述方法,则样品必须脱盐。
而脱盐步骤繁
琐、费时。
针对高盐样品,已经发展出多种富集方法,以下分别予以阐述。
2瞬间等速电泳法tITP
tITPtransientisotachphoresis不仅为一种基本的电泳方法,也是一种有效的在线富集方法;
tITP不
[16,17]
仅可用于低盐或无盐样品的富集,还可用于高盐样品的富集。
当特定待测物的迁移率介于前导离
子和尾随离子的迁移率之间时,样品发生富集。
tITP富集的机制为移动界面系统movingboundarysys2
[18]
tem,MBS的机理。
为了获得好的富集效果,需要在样品中加入一些背景离子作为富集子stacker。
[19]
Andersson等在实验中加入膦甲酸钠作为第一种富集子使样品获得一定程度的富集,为了使一些具
有更低迁移率的样品也得到富集,又加入了第二种富集子?
?
?
谷氨酸,谷氨酸一部分作为样品的背景离
[20]
子,一部分单独注射,使检测灵敏度下限降至0.003%W/W。
Shim等将tITP与pH联接pHjunc2
tion相结合,使富集效果在原有基础上又提高了86%。
tITP在生物化学和生物医药等诸多领域得到了
广泛应用。
3乙腈法
[21~25]
乙腈法首先由Shihabi等建立。
该方法在样品中加入乙腈,这样可以使样品富集,特别是在有
盐存在的情况下更是如此。
虽然样品中存在盐,但是加入的乙腈可以抵消掉盐对ITP和FASI富集作用
[23]
的不良影响,从而使富集作用能够顺利进行。
Shihabi等只用3个步骤缓冲液稀释、盐和乙腈加入
就在CE中完成样品中人胰岛素的浓缩。
缓冲液稀释可以使样品产生一定的富集,高盐和乙腈处理则
可以使样品产生近20倍的富集。
Shihabi在实验中通过HPLC和免疫活性分析发现,加入66%的乙腈
不会使人胰岛素变性或沉淀,但可使上样量达到毛细管体积的10%~20%的样品仍能很好的压缩。
2003210224收稿;
2004210208接受
本文系国家自然科学基金资助课题No.29775014、20245004和204750236分析化学第33卷
268
[24]
Shihabi等指出,阴离子化合物最好在高离子强度的无机缓冲液如硼酸盐和磷酸盐中富集,而对阳离
子化合物则最好是在氨和两性离子缓冲液中富集。
[22][23][24]
该方法首先被用于高盐多肽富集分离,后又用于盐样胰岛素、弱阳离子化合物和黄嘌
[25][26][27]
呤富集;
最近,又用于血管紧张素转换酶和血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂富集。
此方法还用于短链
[28][29]
有机酸和增长因子富集,提高荧光检测和灵敏度。
4pH修饰法pHmediatedsample
[30][31,32]
这种方法最早由Lunte等提出并用于阳离子酸富集,现在也用于阴离子碱富集。
pH修
饰富集的基本电解质设计有2种。
对于阳离子,样品
一般溶于弱碱缓冲液中,而BGE一般为弱酸性电解
质,富集时要用一段强酸。
对于阴离子,样品则溶于弱
酸性缓冲液中,BGE则为弱碱性电解质,富集时则用
强碱。
在酸富集中图1,由于BGE为弱酸性缓冲
液,因此样品在进样后,与随后注入的强酸在毛细管中
-
发生阴离子如Cl替代。
这种替代的结果导致中和
反应,从而在原样品区逐步形成低电导区,这导致FASI
修饰酸富集示意图
富集。
Fig.1DiagramofacidicstackingofpHmediated
类似的方法为阴离子的碱富集。
碱富集的模式
+和-分别为正负极+and-meantheanodeandcathode
与酸富集不同,在酸富集中,由于电渗流EOF的存
respectively。
碱性样品alkalinesample,□缓冲液
在,样品从阳极加样。
在碱富集中,若仍从阳极加样,
buffer,□低电导lowconductivity,□强酸strong
acid;
□富集成分stackedanalyte。
OH将从样品区中跑出,富集无法进行。
所以碱富集
[31]
中通常会调换电极方向,从阴极方向加样。
这必须
改变电渗流的方向,电渗流方向的改变可以通过加入
[31][32]
PDMApolydimethylarylamide或TTABtetradecyltrimethyammoniumbromide来实现。
碱富集的关
键在于加入的碱量是否合适。
若加入的碱量相对不足,则仅有一部分样品富集;
相反,则会使毛细管的大
部分用于富集,用于分离的减少。
同时,大部分电场也集中于中和反应区,使分离电场强度降低,在长度缩
短和场强降低作用下,该方法的局限性是毛细管中相当一部分长度用于样品的富集过程,仅一小部分长度
[32]
用于分离。
针对这种情况,Zhao等用双毛细管法2一根毛细管用于样品富集,另一根用于分离。
其优点
为分离部分的长度增加,另外去除了中和区带,使电场都用于分离,提高分离效率。
[30]
Hadwiger等将这种方法用于异丙肾上腺素手性体的富集,利用此方法和电化学检测器,将检出
μμ
限从3g/L降到0.6g/L,并成功地用到异丙肾上腺素
的药代动力学研究。
随后发展的碱富集已用于DNA富集,
并成功地用于序列测定。
Zhao等用碱富集法在线浓缩
生物样品中4种弱酸性物质。
而后,Lunte对pH修饰法的
[33]
机理做了进一步的研究。
5动态pH联接法
[34]
这一方法最初由Chen等建立。
在此方法中,样品
图2动态pH联接富集法示意图
和BGE的pH值通常都大于7,但二者pH值不相等。
如用
Fig.2DiagramofstackingofdynamicpH
此法富集核酸样品时,样品和BGE都溶于硼酸盐溶液中,
junction
样品的pH值在整个实验中固定在8,而BGE的pH值则从
箭头指示移动方向thearrowsindicatethedirectionof
[17]
8至9.7变化,这种电解质的安排会导致待测物质迁移
movement。
速度的变化,进而引起富集效应。
富集原理详见图2。
第2期张薇等:
毛细管电泳中高盐样品在线富集的研究进展
269
在大体积的样品上样后,用BGE管替代样品,施加电场,高pHBGE中的OH进入样品区,使样品
基质中前端的中性待检测物带负电荷,向前移动速度减缓;
而样品区后端的组分随电渗流一起以大于前
端分子的速度向前移动,直到OH到达样品区后端;
之后,如进行CZE分离。
在动态pH联接系统中,
待检测物迁移速度的不同导致富集,主要由pH和待测物与背景离子如硼酸离子间复合物决定了待
检测物迁移速度。
样品中杂质的速度则不受pH变化影响,也不与背景离子形成复合物,而未富集。
盐
的存在一般不影响富集。
相反,适当浓度的盐对保证样品具有同BGE相似的电场强度相当必要。
[17][34][35]
Britz2McKbbin等已将这种方法应用于核酸、肾上腺素富集。
Aebersold等则用于提高多肽
[36]
离子的灵敏度。
Joselito等对该法作了详细的论述。
文献[37]用此法对细菌提取液的嘧啶和腺嘌呤
[38]
核苷进行分析。
Wang等则用此法在酸性条件下分析痕量蛋白质。
Britz等将此方法与sweeping技术
[39][40]
结合分析FAD和FMN、嘌呤等。
6胶束反应法Inter2actionbetweenanalytesandmicellar,INAM
针对胶束毛细管电动色谱micellarelectro2kineticcapillarychromatography,MEKC样品的富集,
[41~43]
Palmer等建立了一种对高盐样品中的中性物质富集的新方法,即INAM法。
这种方法要求样品基
质中盐的含量要大于BGE中的盐分,也就是样品基质中的电导率要高于BGE。
INAM模式最初用于中
性物质的富集。
参见图3,将含有荷负电胶束的缓冲液按通常方式从
阳极端上样,则胶束在电场作用下向阳极迁移,毛细管中其
它组分都随电渗流一起向阴极方向运动。
由于疏水性强的
待测物与假静相中胶束之间的反应,因而运动速度低于电
渗流;
疏水性弱的物质与胶束作用弱,其运动速度更依赖于
电渗流的速度。
大多数样品的运动速度根据它们与胶束间
疏水作用的强弱而介于胶束速度和电渗流速度这两个极限
图3胶束反应富集原理示意图
速度之间。
这样依据INAM的反应程度,可选择性的富集
Fig.3
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