蛋白质结构与功能的NMR研究(1)PPT文件格式下载.ppt
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可用以获得人和动物体中各种器官以及骨骼的断面图像,现今已发展成为医学上重要的诊断工具。
三类核磁共振基于同一物理原理,但是实验技术各不相同,对实验样品制备也有各不相同的要求。
在溶液高分辨核磁共振研究中,八十年代以来,由于遗传工程和基因工程技术的迅速发展,使得蛋白质分子得以在体外大量表达,解决了蛋白质大分子样品的制备问题,促使溶液高分辨核磁共振实验方法朝多维核磁共振方向发展。
因而,目前已可用来确定分子量大到4万的蛋白质分子的溶液三维空间结构。
为我们在接近生理条件下,在溶液三维结构的基础上研究蛋白质结构与功能的关系提供了重要的研究手段。
NMR方法的研究特点,在运用核磁共振方法分析物质时,物质分子中的原子核尤如一个精细的探针,允许核磁共振方法在分子、原子水平上探测物质,使我们得以深入了解物质的微观特性变化。
NMR是在分子、原子水平上检测物质特性。
原子核作为NMR的一个精细的探针探测物质的微观特性变化。
NMR研究不损伤蛋白质样品。
NMR可以检测包括化学反应,构象变化等动力学过程。
NMR实验样品,溶液样品(500l,浓度0.5-2.0mM)要求:
高纯度,稳定性好,不聚合,溶解度高固体粉末样品液晶状态样品样品配制:
取用适当的样品量(10mg)选择合适的D-solvent取用合适的NMRsampletube(5mm)配制适当的量:
0.5mL,3cm,二、二维NMR基本原理,NMR波谱,1DNMR:
F(t)F(f)2DNMR:
F(t1,t2)F(f1,f2)3DNMR:
F(t1,t2,t3)F(f1,f2,f3)4DNMR:
F(t1,t2,t3,t4)F(f1,f2,f3,f4),一维1HNMR波谱,二维1HNMR波谱,三维NMR波谱,三维NMR波谱的某一截面三维NMR波谱,三维NMR波谱的不同截面三维NMR波谱,核磁化强度的转移机制,在射频脉冲作用下,互相耦合的核自旋之间发生核磁化强度的转移(magnetizationtransfer)。
转移机制分为:
磁化强度相干转移(coherenttransfer)是通过核之间的标量耦合(J-coupling)相互作用磁化强度非相干转移(incoherenttransfer)是通过核之间的dipole-dipole耦合或者chemicalexchange,3JHNH10HZ,建立,3JHNH10HZ,建立antiphase时间(t1/2J):
50ms3JNHN92HZ,5.5ms3JHC145HZ,3.4ms蛋白质分子量较大时,1H共振线宽20HZ,磁化矢量寿命时间25ms,多维NMR实验的灵敏度,Sensitivitye3/2(1-e-/T1),三、多维核磁共振实验检测核的化学位移范围,RangeofChemicalShiftsof1H,13C,15NResonances,1HChemicalShifts:
1HN:
6.011.0ppm1H:
2.56.0ppm1H:
2.04.5ppm1H,:
1.03.0ppmCH3:
0.01.5ppm1H(aromaticring):
6.57.8ppm,13CChemicalShifts:
13C:
4368ppm13C,:
2545ppm13C(Serine):
5666ppm13C(Threonine):
5872ppm13CH3:
1027ppm13C(aromatic):
108158ppm13C:
171177ppm,15NChemicalShifts:
15N(amide):
101139ppm40ppm15N(Histidinesidechain):
165222ppm15N(othersidechain):
110115ppm,&
108ppm,四、二维核磁共振波谱实验与分析,基本的多维NMR实验,多维NMR实验脉冲序列设计,
(1)在准备期生成所需的自旋磁化矢量;
(2)在其后的演化期,该磁化矢量发生随时间的演化,从频域看相当于进行特征共振频率的标记;
(3)在混合期发生相干传递,这是建立不同磁化矢量间联系的关键;
(4)在采样期,采样获得的FID信号经多维Fourier变换及相关的处理就得到多维谱图。
其中每一个时期都可以包括一个或多个脉冲和延时。
二维同核NMR实验,二维1H-1H核磁共振基本实验:
COSY:
建立a.a.残基内标量耦合1H核自旋间的化学位移关联1H之间通过二键或者三键形成交叉峰TOCSY:
建立a.a.残基内1H核自旋间的化学位移全关联1H之间通过接力传递跨键产生交叉峰NOESY:
建立a.a.残基内或者残基之间,偶極耦合1H之间的NOE相关两个1H之间空间距离小于或者等于5时,产生NOE交叉峰,20种氨基酸残基的结构示意图,除了脯氨酸(Pro)和甘氨酸(Gly),每个氨基酸残基都各包含一个1HN和1H,20种氨基酸残基自旋系统的NMR分布示意图,20种氨基酸残基1H共振峰分布范围示意图,20种氨基酸残基1H交叉峰分布示意图,二维同核NMR实验脉冲程序,实现磁化矢量之间进行同核标量耦合传递的核磁共振实验脉冲程序如下:
2D1H-1HCOSY,DQF-COSY,TOCSY,E.COSY实现通过空间偶極耦合相互作用传递磁化矢量的核磁共振实验脉冲程序如下:
2D1H-1HNOESY,ROESY,2D1H-1HCOSY实验原理,2D1H-1HCOSY波谱(指纹区,约612ppm36ppm),2D1H-1HCOSY波谱(脂肪链区,约0ppm6ppm),2D1H-1HNOESY实验原理,2D1H-1HNOESY波谱(指纹区,约612ppm36ppm),2D1H-1HTOCSY波谱(H2O),二维1H-1HNMR波谱的基本分析方法,自旋系统指认(Spinsystemassignment)识别波谱中出现的交叉峰属于哪一类氨基酸残基COSY+TOCSY的综合分析氨基酸序列指认(Sequentialassignment)识别正确的氨基酸残基的序列COSY+NOESY波谱的综合分析确定二级结构(Determinationsecondarystructure)-helix;
-sheet;
reverseturn;
NOEconnectivitypatternchemicalshiftindex(1H,13C),二维同核波谱的谱峰指认步骤,首先指认各共振峰所属的氨基酸类型,二维COSY和TOCSY谱(在H2O&
D2O中)然后指认各共振峰所属的氨基酸序列位,二维NOESY和COSY谱(在H2O中)指认产生NOE的两个1H所属的氨基酸残基二维COSY和TOCSY谱(在D2O中),核自旋系统的指认(Spinsystemassignment),比较二维COSY和TOCSY谱(在D2O或H2O中),辨别TOCSY交叉峰确定交叉峰图形所给出的氨基酸类型指认该氨基酸残基中各1H共振的频率,即化学位移比较二维COSY和TOCSY(在H2O中),辨别从1HN到1H形成的交叉峰的TOCSY交叉峰,二维同核波谱中氨基酸残基自旋系统指认举例,氨基酸序列指认(Sequentialassignment),在指纹区(fingerprintregion)作序列识别(sequentialassignment)是有方向性的,即由横向路径到纵向路径(1Hi1HNi+1)基本规则为:
(1)由COSY交叉峰横向引直线,找出在此线上的某一NOESY交叉峰。
该NOESY交叉峰是由前一位氨基酸残基的1H与后一位氨基酸残基的1HN之间建立的。
是表示氨基酸残基内的NOE相关。
(2)再由该NOESY交叉峰竖向引直线,找出在此线上的某一COSY交叉峰。
(3)由后一个COSY交叉峰重复上述步骤。
在1HN1HN区域作序列识别。
氨基酸序列指认示意图,氨基酸序列指认举例说明,二维同核波谱螺旋氨基酸残基主链谱峰指认举例,Chemicalshiftindex(1H)示意图,二维异核NMR实验,HSQC:
建立a.a.残基内1H-15N或1H-13C之间的化学位移相关.1H与异核(15N或13C)之间通过单键1JNH或1JCH形成交叉峰.HSQC-TOCSY:
建立a.a.残基内1H之间的化学位移全相关.1H之间通过1H-13C之间的化学位移相关的介导而产生接力交叉峰.HSQC-NOE:
建立a.a.残基内或者残基之间,1H之间的NOE相关.1H之间空间距离小于或者等于5时,通过1H-15N或1H-13C单键1JNH相关的介导而产生NOE交叉峰.,二维异核NMR实验脉冲程序,I通道第一个90度脉冲激发Iz成为Ix;
随后磁化矢量从Ix传到异核单量子相干2SyIz两个t1/2时间内S核发生随时间的演化,带上化学位移的频率标记;
(I通道180度脉冲回聚了I和S之间的标量耦合,相当于消除了标量耦合JIS的影响)然后再把磁化矢量传回I核;
在最后采样期被检测。
2D1H-15N&
1H-13CHSQC:
1H-13CHSQC-NOE:
二维1H-15N&
1H-13CHSQC实验原理,2D1H-15NHSQC波谱,2D1H-15NHSQC-NOE波谱,2D1H-15NHSQC-NOE波谱,2D1H-13CHSQC波谱,2D1H-13CHSQC-NOE波谱,2D1H-13CHSQC波谱,二维异核波谱谱峰指认基本方法,自旋系统指认(Spinsystemassignment)识别波谱中出现的交叉峰属于哪一类氨基酸残基HSQC+HSQC-TOCSY的综合分析氨基酸序列指认(Sequentialassignment)识别正确的氨基酸残基的序列HSQC+HSQC-NOE波谱的综合分析确定二级结构(Determinationsecondarystructure)-helix;
NOEconnectivitypatternchemicalshiftindex(13C),二维异核波谱自旋系统指认举例,自旋系统指认,1H-13CHSQC1H-13CHSQC-TOCSY,二维异核波谱氨基酸残基侧链谱峰指认举例,
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- 关 键 词:
- 蛋白质 结构 功能 NMR 研究