SN出口食品中大肠菌群粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法.docx
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SN出口食品中大肠菌群粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法
出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法
SN0169-92代替ZBX09002—88
Methodforexaminationofcoliform,fecalcoliformandescherichiacoliinfoodforexport
1、主题内容与适用范围
本标准规定了出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌的检验方法。
本标准适用于出口食品的检验。
2、设备和材料
2.1吸管:
1mL具0.1mL刻度;5mL和10mL具1mL刻度。
2.2水浴箱:
44.5±0.5C。
2.3培养箱:
36±1C,44.5±0.5C。
2.4冰箱:
0〜5C和-15〜-20Co
2.5均质器。
2.6乳钵和研棒。
2.7平皿:
直径90mm
2.8天平:
感量0.1go
2.9显微镜。
2.10稀释瓶:
100mL200mL和500mL三角烧瓶及广口瓶。
2.11玻璃珠:
直径约5mm
2.12菌落计数器。
3、培养基及试剂
3.1月桂基硫酸盐胰蛋白(胨)(LST)肉汤。
3.2煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤。
3.3EC肉汤。
3.4伊红美蓝琼脂(EMB)。
3.5营养琼脂斜面
3.6色氨酸肉汤。
3.7MR-VP培养基。
3.8Korser氏枸椽酸盐肉汤。
3.9结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)。
3.10Butterfield氏磷酸盐缓冲稀释液。
3.11生理盐水。
3.12革兰氏染色液。
3.13Kovacs氏靛基质试剂。
3.14甲基红指示剂。
3.15Voges-proskauer(V-P)试剂。
4、样品制备
4.1以无菌操作取有代表性的样品。
如有包装则用75%乙醇在开口处擦拭后取样。
若不能及时检验,应将冷冻样品置于-15C保存;非冷冻而易腐的食品,应置于4C冰箱保存。
检验前冷冻样品可于2〜5C18h内解冻,或在45C以下15min内解冻。
4.2不同食品样品匀液的制备
4.2.1液体食品以灭菌吸管取样25mL放入装有225mL稀释剂的灭菌玻璃瓶(瓶内预置适当数量的玻璃珠),以30cm幅度、于7s内振摇25次(或以机械振荡器振摇),制成1:
10的样品匀液。
4.2.2固体和半固体食品
以无菌操作取25g样品,放入装有225mL稀释剂的灭菌均质杯内,于8000r/min均质1〜2min,制成1:
10样品匀液(也可用灭菌乳钵研磨的方法代替)。
4.3稀释样品匀液根据对样品污染情况的估计,用稀释剂将样品匀液制成一系列十倍递增的样品稀释液,如10-2、10-3、10-4……。
从制备样品匀液至稀释完毕,全过程不得超过15min。
5、大肠菌群的测定
5.1大肠菌群MPNS的测定
5.1.1对每个样品,选择适宜的三个连续稀释度的样品稀释液。
每个稀释度接种三管月桂基硫酸盐胰蛋白(月示)(LST)肉汤,每管接种1mL
5.1.2将接种管置于36±1C培养48土2h。
5.1.3观察试管的产气情况:
检查倒管内是否有气泡产生,记录在24h和48h内产气的
LST肉汤管数。
如所有LST肉汤管均未产气,则可报告为大肠菌群阴性;如有产气者,则进一步作证实试验。
5.2大肠菌群的证实试验
5.2.1将所有产气管用直径为3mm勺接种环移种到煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤管中。
5.2.2置BGLB肉汤管于36±「C培养48±2h。
5.2.3记录所有BGLB肉汤管的产气管数。
5.2.4结果报告:
按BGLB肉汤产气管数,查MPN表[见附录B(补充件)]报告每克(毫升)样品中大肠菌群的MPN值。
6、粪大肠菌群测定
6.1用直径为3mm勺接种环将所有48土2h内产气的LST肉汤管培养物移种于EC肉汤管中。
6.2将所有接种的EC肉汤管在30min内放入带盖44.5±0.5C水浴箱内,培养24±2h。
水浴箱的水平面应高于肉汤培养基液面。
应以已知为44.5C产气阳性的大肠杆菌和44.5C
不产气的产气肠杆菌或其他大肠菌群细菌作阳性和阴性对照。
6.3记录EC肉汤管的产气情况。
产气管为粪大肠菌群试验阳性;不产气管为粪大肠菌群试验阴性。
6.4结果报告:
按产气管数,查MPN表报告每克(毫升)样品中粪大肠菌群的MPNB。
靛基质
MR
VP
枸椽酸盐
鉴定(型别)
+
+
一
一
典型大肠杆菌
一
+
一
一
非典型大肠杆菌
+
+
一
+
典型中间型
一
+
一
+
非典型中间型
一
一
+
+
典型产气肠杆菌
+
一
+
+
非典型产气肠杆菌
7、大肠杆菌测定
7.1将6.3条中的EC肉汤管继续培养24h,取其产气管的培养物划线接种于伊红美蓝(EMB)平板,36±1C培养24±2h。
7.2检查平板上有无具黑色中心有光泽或无光泽的典型菌落
7.3如有典型菌落,则从每个平板上至少挑取2个典型菌落;如无典型菌落,则从每个平板上至少挑取2个可疑菌落。
用接种针接触菌落中心部位,移种到营养琼脂斜面上,36±「C培养18〜24h。
7.4将斜面培养物移种到下列培养基中进行生化试验。
7.4.1色氨酸肉汤:
在36±1C培养24±2h后,加Kovacs氏试剂0.2〜0.3mL,上层出现红色为靛基质阳性反应。
7.4.2MR-VP培养基:
在36±1C培养48土2h。
以无菌操作移取培养物1mL至13mrtK100mm试管中,力卩5%a-萘酚乙醇溶液0.6mL,40%氢氧化钾溶液0.2mL和少许肌酸结晶,振摇试管后静置2h,如出现伊红色,为VP试验阳性。
将MR-VP培养物的剩余部分再培养48h滴加5滴甲基红溶液。
如培养物变红色,为甲基红试验阳性,若变黄色则为阴性反应。
7.4.3Koser氏枸椽酸盐肉汤:
于36±1C培养96h记录有无生长。
7.4.4LST肉汤:
于36±1C培养48土2h,观察试管中是否产气。
7.4.5革兰氏染色:
取18h营养琼脂斜面培养物作革兰氏染色。
大肠杆菌为革兰氏阴性。
7.4.6大肠杆菌与非大肠杆菌生化鉴别如下:
如出现上表以外的生化反应类型,表明培养物可能不纯,应重新划线分离,必要时做重复试验。
7.5结果报告:
大肠杆菌为革兰氏阴性无芽孢杆菌,发酵乳糖产酸产气,IMViC试验为+或—I,再根据LST肉汤阳性管数查MPN表,报告每克(毫升)样品中大肠杆菌MPN值。
8、大肠菌群固体培养基测定法
8.1样品制备同第4章。
8.2计数
8.2.1选取适宜的三个连续稀释度的样品液,每个稀释度接种两个灭菌平皿,每皿1mL。
另取1mL稀释剂加入一个灭菌平皿中,作空白对照。
8.2.2将冷至45±0.5C的结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)1(〜15mL倾注于每个平皿中。
小心旋转平皿,将培养基与样液充分混匀。
8.2.3待琼脂凝固后,再加3〜4mLVRB覆盖平板表层。
8.2.4翻转平板,置于36±1C培养18〜24h。
8.2.5选用有30〜150个菌落的平板,计数平板上出现的典型大肠菌群菌落。
典型菌落为
紫红色,菌落周围有红色的胆盐沉淀环。
菌落直径为0.5mm或更大。
8.2.6证实
826.1从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落,移种于BGLB肉汤管内,
36±「C培养24h和48h,观察产气情况。
8.2.6.2将出现产气的肉汤管判为大肠菌群阳性。
对形成菌膜的阳性管,应进行革兰氏染色,以便排除革兰氏阳性杆菌。
8.2.7结果报告
经最后证实为阳性(产气,革兰氏阴性杆菌)的试管百分比乘以于8.2.5条中计数的平板菌落数,再乘以稀释倍数,即为每克(毫升)样品中大肠菌群数。
例:
10-4样品稀释液1mL,在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落,挑取其中10个接种BGLB肉汤管,证实有6个阳性管,则该样品的大肠菌群数为:
100X6/10X10-4/g(mL)=6.0X105/g(mL)
附录A培养基和试剂(补充件)
A1月桂基硫酸盐胰蛋白(胨)(LST)肉汤
胰蛋白(胨)或胰酪胨(Trypticase)20g
氯化钠5.0g
乳糖5.0g
磷酸氢二钾2.75g
磷酸二氢钾2.75g
月桂基硫酸钠0.1g
蒸馏水1000.0mL
将各成分溶解于蒸馏水中。
分装到有倒立发酵管的20mnX150mn试管中,每管10mL
121C高压灭菌15min。
最终pH6.8±0.2。
A2煌绿乳糖胆盐(BGAB)肉汤
蛋白胨10.0g
乳糖10.0g
牛胆粉(oxgall或oxbile)溶液200.0mL
5.0g
4.0g
1.5g
5.0g
1000.0mL
蒸馏水
将蛋白胨乳糖溶于约500mL蒸馏水中,加入牛胆粉溶液200mL将20.0g脱水牛胆粉溶于200mL蒸馏水中,pH7.0〜7.5),用蒸馏水稀释到975mL调pH7.4。
再加入0.1%煌绿水溶液13.3mL,用蒸馏水补足到1000mL用棉花过滤后,分装到20mrtK150mn试管(管内有倒立的小发酵管)中,每管10mL121C高压灭菌15min。
最终pH7.2±0.1。
A3EC肉汤
胰蛋白(胨)或胰酪(胨)20.0g
3号胆盐或混合胆盐1.5g
乳糖
磷酸氢二钾磷酸二氢钾氯化钠蒸馏水
将以上成分溶解于蒸馏水中,分装16mm<150mn试管(管内有倒立的小发酵管),每管8mL121C高压灭菌15min,最终pH6.9±0.1。
在1000mL蒸馏水中煮沸溶解蛋白胨、磷酸盐和琼脂,加水补足至原量。
分装于三角烧瓶中。
每瓶100mL或200mL高压灭菌15min。
最终pH7.1±0.2。
使用前将琼脂融化,于每100mL琼脂中加5mL灭菌的20%乳糖水溶液、2mL的2%伊红丫水溶液和1.3mL0.5%的美蓝水溶液,摇匀,冷至45〜50C倾注平皿。
A5营养琼脂斜面
蛋白胨5.0g
琼脂15.0g
蒸馏水1000.0mL
将各成分加于蒸馏水中,煮沸溶解。
分装合适的试管。
121C高压灭菌15min。
最终pH7.3±0.1。
灭菌后摆成斜面备用。
A6色氨酸肉汤
胰胨或胰酪胨10.0g
蒸馏水1000.0mL
加热搅拌溶解胰胨或胰酪胨于蒸馏水中。
分装试管,每管5mL121C高压灭菌15min
最终pH6.9±0.2。
A7MR-V培养基
(胨)胨7.0g
葡萄糖
磷酸氢二钾(K2HPO4)
蒸馏水1000.0mL将各成分溶于蒸馏水中,分装试管,
A8Koser氏枸椽酸盐肉汤
磷酸氢铵钠(NaNHHPO・4H2O)
磷酸氢二钾(K2HPO4)1.0g
硫酸镁(MgSO•7H2O)
枸椽酸钠(含2H2O)
蒸馏水1000.0mL
5.0g
5.0g
121C高压灭菌15min,最终pH6.9±0.2。
1.5g
0.2g
3.0g
A9结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)
琼脂15〜18g
蒸馏水
1000.0mL
将上述成分溶于蒸馏水中,静置几分钟,充分搅拌,调至pH7.4土0.1。
煮沸2min,将
培养基冷至45〜50C倾注平板。
临用时制备,不得超过3h。
A10Butterfield氏磷酸盐缓冲稀释液
贮存液磷酸二氢钾(KH2PO4)34.0g
蒸馏水500m
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