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DNA的杂交即复性(Renaturation)是变性的单链DNA在一定的条件下(低于Tm的温度下)与其互补序列退火形成双链的过程,因此杂交与Tm值相关。
影响杂交的主要因素:
温度:
一般在低于Tm约15至25度的温度下杂交速率最快。
盐浓度:
钠离子增加杂交分子的稳定性,降低钠离子浓度强烈地影响Tm值和复性速率。
但当钠离子浓度超过0.4M时,对复性速度和Tm值影响不大。
甲酰胺:
有机溶剂如甲酰胺能减少双链核酸的稳定性。
每增加1%的甲酰胺,DNA/DNA或DNA/RNA双链的Tm值减少0.72℃。
常用50%甲酰胺
硫酸葡聚糖:
使杂交速率增加,但有时可能增加杂交本底。
二、核酸探针的选择和标记
核酸探针是指能与待检测的靶核酸序列互补杂交的某种已知核酸片段,它必须具有高度的特异性,并且带有某种适当的标记以便被检测。
(一)核酸探针的类型
1、克隆的DNA片段,常用cDNA探针。
2、RNA探针(Riboprobe)
RNA探针的优点是特异性高;
杂交效率(灵敏度)更高。
适合于Northen杂交、原位杂交等。
主要缺点是不稳定,易被降解,另外其制备较困难。
3、寡核苷酸探针可用化学方法人工合成,制备较方便,但灵敏度稍差。
4、聚合酶链反应扩增产物是很好的探针来源,其优点是制备和标记相对容易。
(二)核酸标记的类型
ﻩ放射性同位素目前应用最广,优点是灵敏度高,特别适用于单拷贝基因或低丰度mRNA检测,缺点是易造成放射性污染以及半衰期短,使用不便。
核酸探针标记常用的同位素有以下几种:
1、32P:
其放射性强,自显影时间短,灵敏度较高,缺点是半衰期短(14.3天),放射线散射较严重,因此对分辩率有影响。
2、35S
:
放射性较低,半衰期长(87.1天),灵敏度较高;
低散射,因此在用X-光片自显影时分辩率高,特别适用于核酸序列分析和原位杂交等实验。
3、33P
:
是一种较理想的同位素,它的放射性较低,灵敏度高,分辩率好,半衰期也较长(25.4天),适用范围较广。
但价格偏高。
非同位素标记:
常用地高辛或生物素系统。
优点:
无放射性污染,较稳定;
缺点:
灵敏度、特异性稍差。
(三)核酸探针的标记
1、随机引物法(Randompriming)
随机引物是人工合成的含有各种可能的排列顺序的六核苷酸片段的混合物,因此可以与任何核酸片段杂交,并作为聚合酶反应的引物。
标记酶:
大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的大片段-klenow片段。
特点:
所得探针的放射性比活较高,适用于大多数杂交。
2、缺刻平移法(Nick translation0
标记酶:
大肠杆菌DNaseⅠ(极微量)和DNA聚合酶Ⅰ。
用缺刻平移法制备的探针较短,较适合于原位杂交。
3、RNA探针的制备和标记
ﻩRNA探针可用RNA聚合酶体外转录法制备。
该方法的合成效率高,所得产物大小均一,有较高的比活,特异适合于Northern杂交和原位杂交。
4、聚合酶链反应标记DNA探针
利用TaqDNA聚合酶和标记的dNTP,sk以少量的起始模板合成高比活的c双链或单链DNA探针。
5、寡核苷酸探针的标记
5’-端标记:
T4多核苷酸激酶标记法,一般用于制备DNA序列分析时用的5’-标记的寡苷酸引物。
3’-端标记:
末端转移酶法,32P-dNTP或ddNTP。
6、非同位素核酸探针标记:
地高辛或生物素标记的核酸探针的制备方法和同位素探针相似。
但是不能用多核苷酸激酶标记法直接对5’-端进行非同位素标记。
三、常用核酸杂交技术
滤膜杂交
固相杂交
核酸杂交 原位杂交
液相杂交
滤膜杂交是指先将待检测的核酸序列结合到适当的固相支持物如尼龙膜上,然后与存在于溶液中的已标记探针进行杂交的过程。
滤膜杂交的基本过程为:
1、核酸探针的制备和标记;
2、核酸片段的凝胶电泳分离;
3、将凝胶中的核酸片段通过印迹(blot)转移到某种固相支持物上;
4、用标记的探针与被固定的靶核酸序列杂交(通过还包括预杂交);
5、洗膜(除去未杂交的游离探针等);
6、检测带标记的杂交分子(放射自显影或酶联反应)。
(一)斑点/狭缝印迹(Dot/slotblot)杂交:
DNA或RNA样品经变性后直接点样于尼龙膜上,然后进行杂交和检测。
其优点是简单、迅速,可同时做多个样品;
缺点是特异性不好,有一定比例的假阳性,此外,靶核酸的分子大小难于判断。
(二)Southern印迹:
指将经过电泳分离的DNA片断转移到一定的固相支持物的过程。
Southern印迹杂交的步骤如下:
1、用限制性内切酶消化大分子DNA;
2、用琼脂糖凝胶电泳对DNAa片段按分子量大小分离;
3、将DNA片段在琼脂糖凝胶电泳中变性成单链后,再转移到适当的固相支持物上并与之结合;
4、探针与膜上的DNA杂交;
5、检测。
Southern印迹杂交主要用于基因组结构分析、基因组DNA的定性和定量分析以及利用限制性片段长度多态性进行基因突变分析等。
(三)Northern印迹:
是指RNA经变性凝胶电泳后,将其转移到固相支持物上,以便用杂交反应检测特定的mRNA分子的含量与大小。
是基因表达研究分析的标准方法。
Nothern印迹的基本过程包括:
1、RNA的提取;
2、RNA变性电泳;
3、RNA转移和固定;
4、杂交;
5、检测。
除RNA的提取和变性胶电泳与DNA不同外,其余基本与Southern印迹相同,关键是减少实验中的RNA酶污染。
(四)核酸杂交在基因诊断中的应用
通过核酸杂交技术,可以利用带有某种标记的已知核酸片段作为探针,去检测未知核酸序列。
因此,核酸杂交可用于基因鉴定和基因突变分析等领域。
1、限制性片段长度多态性(RFLP)分析
多态性(polymorphism)指基因组中特定基因座位(DNA序列)存在两种或两种以上状态(等位基因),并且其中任何一个等位基因在人群中的频率不低于1%。
限制性片段长度多态性(RFLP)是由于DNA变异(产生新的酶切位点或消除原有的酶切位点)导致在限制性核酸内切酶酶切时产生不同长度的片段。
可借助southernblotting或PCR的方法进行检测
RFLP分析与遗传病基因诊断。
人类染色体VNTR序列的RFLP分析图谱:
DNA fingerprinting。
2、等位基因特异性寡核苷酸(ASO)探针杂交
寡核苷酸中的碱基错配会大大影响杂交分子的稳定性,因此可用人工合成的针对正常和突变等位基因的特异性寡核苷酸探针进行杂交,检测点突变。
3、基因表达分析
常用Northern blotting或原位杂交分析。
第二节聚合酶链反应(PCR)技术
一、PCR的基本原理
(一)PCR的基本过程
ﻩPCR是一种体外扩增特异DNA片段的技术。
它包括下列三个基本步骤:
1、变性(Denaturation):
待扩增的DNA模板加热变性成单链;
2、退火(Annealing):
降低温度,使单链靶序列与寡核苷酸引物退火;
3、延伸(Extension):
在适当条件下,利用DNA聚合酶使引物延伸,产生新的双链。
上述变性、退火、延伸步骤的重复循环,导致特异的靶序列的指数扩增。
PCR产物是介于引物的5’端之间的双链DNA片段。
(二)PCR体系中的主要成份
1、TaqDNA聚合酶是一种耐热的DNA聚合酶,具有5’-3’DNA聚合酶活性,一般有5’-3外切酶活性,有或无3’-5’外切酶活性(校对活性),无校对活性的酶在PCR中错掺率较高。
PCR中
Taq酶的用量一般为0.5-2.5U,过多易造成非特异性扩增,过少可能灵敏度不够。
2、寡核苷酸引物是决定PCR扩增特异性的关键。
设计PCR引物时的几条原则:
1引物长度一般15-30碱基,过短则特异性低;
2避免内部二级结构;
3G/C和A/T碱基均匀分布,G/C含量在45%-55%之间;
4两个引物(特别是3’端)间不能发生互补,以免形成引物引物二聚体;
5引物的3’-端碱基一般应与模板严格配对,并且3’端为G、C或T时引发效率较高;
6引物的5’-端可添加与模板无关的序列(如限制性内切酶的识别位点、ATG起始密码子或启动子序列等)
PCR中所用引物浓度一般在0.1-0.5uM太高的引物浓度易造成非特异性扩增,太低会降低合成效率。
3、MgCl2 Mg2+浓度除影响Taq酶活性外,还影响双链DNA的Tm值,因而影响PCR的特异性和扩增效率。
ﻩPCR中的最适MgCl2浓度一般为1.5-2.5mM(注意游离Mg2+浓度还与能结合Mg2+的化合物如dNTP、EDTA等的浓度有关。
4、脱氧核苷三磷酸(dNTP)一般采用均衡的dNTP浓度,4种dNTP各为200umol/L,dNTP可减少游离Mg2+,因此影响聚合酶活性和引物退火。
5、模板 单、双链DNA,以及RNA经逆转录合成的cDNA。
ﻩPCR样品可以是粗制品,但不应含有核酸酶和蛋白酶及其它干扰Taq酶活性的抑制剂 。
ﻩ引物/模板的比率影响PCR的特异性。
(三)PCR循环参数
1、预变性(Initialdenaturation).
模板DNA完全变性对PCR能否成功至关重要,一般95℃加热3-5分钟。
2、引物退火(Primerannealing)
退火温度一般需要凭实验(经验)决定。
退火温度对PCR的特异性有较大影响。
3、引物延伸
引物延伸一般在72℃进行(Taq酶最适温度)。
延伸时间随扩增片段长短而定。
4、循环中的变性步骤
循环中一般95℃,30秒足以使各种靶DNA序列完全变性:
变性时间过长损害酶活性,过短靶序列变性不彻底,易造成扩增失败。
5、循环数
大多数PCR含25-35循环,过多易产生非特异扩增。
6、最后延伸
在最后一个循环后,反应在72℃维持5-15分钟.使引物延伸完全,并使单链产物退火成双链。
(四)PCR中的污染和假阳性
PCR中污染主要来自
1、样品间交叉污染;
2、先前PCR产物遗留(carry-over)
二、几种常用特殊PCR技术
(一)逆转录PCR(Reversetranscription-PCR,RT-PCR)
RNA经逆转录后可作为PCR的模板.逆转录PCR(RT-PCR)常用于基因表达研究(定量PCR)和逆病毒检测.
设计RT-PCR引物时,应使引物分别位于不同的外显子中,以便区别cDNA和gDNA扩增产物。
(二)多重PCR(MultiplePCR)
在同一PCR反应体系中用多
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