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下面将介绍各种类型的探针及标记方法。
一、双链DNA探针及其标记方法
分子生物研究中,最常用的探针即为双链DNA探针,它广泛应用于基因的鉴定、临床诊断等方面。
双链DNA探针的合成方法主要有下列两种:
切口平移法和随机引物合成法。
1.切口平移法(nicktranslation)当双链DNA分子的一条链上产生切口时,DNA聚合酶Ⅰ就可将核苷酸连接到切口的3'
羟基末端。
同时该酶具有从5'
→3'
的核酸外切酶活性,能从切口的5'
端除去核苷酸。
由于在切去核苷酸的同时又在切口的3'
端补上核苷酸,从而使切口沿着DNA链移动,用放射性核苷酸代替原先无放射性的核苷酸,将放射性同位素掺入到合成新链中。
最合适的切口平移片段一般为50-500个核苷酸。
切口平移反应受几种因素的影响:
(a)产物的比活性取决于[α-32P]dNTP的比活性和模板中核苷酸被置换的程度。
(b)DNA酶Ⅰ的用量和DNA聚合酶的质量会影响产物片段的大小。
(c)DNA模板中的抑制物如琼脂糖会抑制酶的活性,故应使用仔细纯化后的DNA。
材料:
待标记的DNA。
设备:
高速台式离心机,恒温水浴锅等。
试剂:
(1)10×
切口平移缓冲液:
LTris·
Cl;
LMgSO4;
10mmol/LDTT;
100μg/mlBSA。
(2)未标记的dNTP原液:
除同位素标记的脱氧三磷酸核苷酸外,其余3种分别溶解于50mmol/LTris·
Cl溶液中,浓度为L。
(3)[α-32P]dCTP或[α-32P]dATP:
400Ci/mmol,10μCi/μl。
(4)DNA聚合酶Ⅰ(4单位/μl):
溶于50μg/mlBSA,1mmol/LDTT,50%甘油,50mmol/LTris·
Cl中。
(5)DNA酶Ⅰ:
1mg/ml。
(6)EDTA:
200mmol/L。
(7)10mol/LNH4Ac。
操作步骤:
(1)按下列配比混合:
未标记的dNTP10μl 10×
切口平移缓冲液5μl 待标记的DNA1μg
[α-32P]dCTP或dATP(70μCi)7μl
DNA聚合酶4单位
DAN酶I1μl
加水至终体积50μl
(2)置于15℃水浴60分钟。
(3)加入5μlEDTA终止反应。
(4)反应液中加入醋酸铵,使终浓度为L,加入两倍体积预冷无水乙醇沉淀回收DNA探针。
[注意]1、3H,32P及35S标记的dNTP都可使用于探针标记,但通常使用[α-32P]-dNTP。
2、DNA酶Ⅰ的活性不同,所得到的探针比活性也不同,DNA酶Ⅰ活性高,则所得探针比活性高,但长度比较短。
2.随机引物合成法随机引物合成双链探针是使寡核苷酸引物与DNA模板结合,在Klenow酶的作用下,合成DNA探针。
合成产物的大小、产量、比活性依赖于反应中模板、引物、dNTP和酶的量。
通常,产物平均长度为400-600个核苷酸。
利用随机引物进行反应的优点是:
(1)Klenow片段没有5'
外切酶活性,反应稳定,可以获得大量的有效探针。
(2)反应时对模板的要求不严格,用微量制备的质粒DNA模板也可进行反应。
(3)反应产物的比活性较高,可达4×
109cpm/μg探针。
(4)随机引物反应还可以在低熔点琼脂糖中直接进行。
待标记的DNA片段。
(1)随机引物(随机六聚体或断裂的鲑鱼精子DNA)。
(2)10×
随机标记缓冲液:
900mmol/LHEPES;
10mmol/LMgCl2。
(3)Klenow片段。
(4)20mmol/LDTT。
(5)未标记的dNTP溶液:
dGTP、dCTP和dTTP溶液,各5mmol/L。
(6)[α-32P]dATP:
比活性&
gt;
3000Ci/mmol,10μCi/μl。
(7)缓冲液A:
50mmol/LTris·
Cl();
50mmol/LNaCl;
5mmol/LEDTA();
%SDS。
操作步骤:
(1)200ng双链DNA(1μl)和随机引物(1μl)混合后置于eppendorf管内,水浴煮沸5分钟后,立即置于冰浴中1分钟。
(2)与此同时,尽快在一置于冰浴中的eppendorf管内混合下列化合物:
20mmol/LDTT1μl
未标记的dNTP溶液1μl
10×
随机标记缓冲液1μl
[α-32P]dATP(比活性&
3000Ci/mmol;
10μCi/μl)3μl
ddH2O1μl
(3)将步骤
(1)eppendorf管中的溶液移到步骤
(2)管中。
(4)加入5单位(约1μl)Klenow片段,充分混合,在微型离心机中以12000g离心1-2秒,使所有溶液沉于试管底部,在室温下保温3-16小时。
(5)在反应液中加入10μl缓冲液A后,将放射性标记的探针保存在-20℃下备用。
同时计算放射比活性。
[注意]1、引物与模板的比例应仔细调整,当引物高于模板时,反应产物比较短,但产物的累积较多;
反之,则可获得较长片段的探针。
2、模板DNA应是线性的,如为超螺旋DNA,则标记效率不足50%。
二、单链DNA探针
用双链探针杂交检测另一个远缘DNA时,探针序列与被检测序列间有很多错配。
而两条探针互补链之间的配对却十分稳定,即形成自身的无效杂交,结果使检测效率下降。
采用单链探针则可解决这一问题。
单链DNA探针的合成方法主要有下列两种
1)以M13载体衍生序列为模板,用Klenow片段合成单链探针;
(2)以RNA为模板,用反转录酶合成单链cDNA探针。
1.从M13载体衍生序列合成单链DNA探针合成单链DNA探针可将模板序列克隆到噬粒或M13噬菌体载体中,以此为模板,以特定的通用引物或以人工合成的寡合苷酸为引物,在[a-32P]-dNTP的存在下,由Klenow片段作用合成放射标记探针,反应完毕后得到部分双链分子。
在克隆序列内或下游用限制性内切酶切割这些长短不一的产物,然后通过变性凝胶电泳(如变性聚丙烯酰胺凝胶电泳)将探针与模板分离开。
双链RF型M13DNA也可用于单链DNA的制备,选用适当的引物即可制备正链或负链单链探针。
材料:
已制备好的单链DNA模板(方法参见第十章中有关内容)。
Klenow缓冲液:
LNaCl,LTris·
Cl;
LMgCl2。
(2)LDTT溶液。
(3)[α-32P]dATP:
(4)40mmol/L和20mmol/L的未标记的dNTP溶液。
(5)dCTP,dTTP,dGTP各20mmol/L的溶液。
(6)Klenow片段(5单位/ml)。
(7)适宜的限制酶,如EcoRⅠ、HindⅢ等。
(8)LEDTA()。
操作步骤:
(1)在eppendorf管中混合如下溶液:
单链模板(约)1mg
适当引物5pmol
Klenow缓冲液3ml
加水至20ml
(2)将eppendorf管加热到85℃5分钟,在30分钟内,使小离心管降到37℃;
(3)依次加入:
DTT2ml
[a-32P]dATP5ml
未标记的dATP1ml
dGTP,dCTP,dTTP混合液1ml
混合均匀后,稍离心使之沉于试管底部。
(4)加1ml(5单位)Klenow酶室温下30分钟。
(5)加1ml20mmol/L未标记的dATP溶液20分钟。
(6)68℃加热10分钟,使Klenow片段失活。
调整NaCl浓度,使之适宜于酶切。
(7)加入20单位限制性内切酶(如EcoRⅠ,HindⅢ等)酶切1小时。
(8)酚/氯仿抽提DNA,乙醇沉淀以去除dNTP或加LEDTA至终浓度10mmol/L。
(9)用电泳方法分离放射性标记的探针。
2.从RNA合成单链cDNA探针cDNA单链探针主要用来分离cDNA文库中相应的基因。
用RNA为模板合成cDNA探针所用的引物有两种:
(1)用寡聚dT为引物合成cDNA探针。
本方法只能用于带Poly(A)的mRNA,并且产生的探针极大多数偏向于mRNA3'
末端序列。
(2)可用随机引物合成cDNA探针。
该法可避免上述缺点,产生比活性较高的探针。
但由于模板RNA中通常含有多种不同的RNA分子,所得探针的序列往往比以克隆DNA为模板所得的探针复杂得多,应预先尽量富集mRNA中的目的序列。
反转录得到的产物RNA/DNA杂交双链经碱变性后,RNA单链可被迅速地降解成小片段,经SephadexG-50柱层析即可得到单链探针。
材料:
已提纯的RNA或mRNA
(1)合适的引物:
随机引物或oligo(dT)15-18。
(2)5mmol/LdGTP,dATPdCTP,dTTP。
(3)[a-32P]dCTP(&
3000Ci/mmol,10mCi/ml)。
(4)反转录酶(200000单位/ml)。
(5)100mmol/LDTT。
(6)250mmol/LMgCl2。
(7)1mol/LKCl。
(8)LEDTA。
(9)10%SDS。
(10)RNasin(40单位/ml)。
(1)在已置于冰浴中的灭菌离心管中加入下列试剂:
RNA或mRNA
合适的产物(1mg/ml)
1mol/LTris·
Cl
1mol/LKCl
250mmol/LMgCl2
5mmol/LdNTP
[a-32P]dCTP
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