超声微泡联合核定位信号促进SDF1α基因转染治疗兔心肌梗死文档格式.docx
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0.05),但入核率和SDF-1α蛋白表达显著增高(PSDF-1α蛋白显著增高、干细胞标志物阳性染色显著增强、毛细血管密度显著增加(PSDF-1α的胞膜核膜双靶向阳离子微泡载体系统能有效提高SDF-1α基因载体转染效率,表达足量的SDF-1α蛋白并发挥其干细胞诱导剂作用,从而促进内源性干细胞归巢并促进局部血管新生。
【关键词】超声微泡;
干细胞归巢;
阳离子微泡;
基因转染;
SDF-1α;
NF-κB干细胞疗法对心肌梗死的治疗价值已得到肯定,但在实际应用中存在干细胞定向分化率及存活率低等不足[1-3]。
内源性干细胞动员后靶向归巢至受损心肌局部成为未来治疗心肌梗死的新趋势。
已有研究证实,超声靶向微泡破坏介导的基因转染可在一定程度上提高干细胞归巢率,转染后靶向归巢心肌局部的干细胞数量虽有增加,但仍与预期的效果存在一定的差距。
本课题组前期已成功构建了一种能先后跨越细胞膜和核膜两道屏障的双靶向阳离子微泡系统,并有效提高目的基因的转染率,本实验拟在此基础上探讨超声辐照下携基质衍生因子1(Stromalcell-derivedfactor-1,SDF-1α)基因的胞膜核膜双靶向阳离子微泡载体系统促进内源性干细胞归巢的机制。
1材料及方法1.1实验试剂与仪器1.1.1试剂阳离子微泡(重庆医科大学超声影像科研究所友情提供),主要成分为二硬脂酰磷脂酰胆碱、聚乙二醇二硬脂酰乙胺和3β-[N’,N’-二甲基胺乙基)氨基甲酰胺]胆固醇(DC-Chol),其中DC-Chol是导致阳离子微泡表面带正电荷的主要成分。
人脐静脉血管内皮细胞(humanumbilicalveinendothelialcell,HUVEC)由重庆医科大学胡锦跃博士友情馈赠,SDF-1α质粒(上海凯恩生物公司),CD31一抗(北京博奥森公司),SDF-1αELISA试剂盒(美国R&
D公司)。
1.1.2仪器紫外分光光度计(美国BeckmanCoulter公司),微粒表面电位检测(英国Malven公司),流式细胞仪(美国BeckmanCoulter公司),凝胶电泳仪(美国PerkinElmer公司),倒置荧光显微镜(日本Olympus公司),PhilipsiE33彩色多普勒超声诊断仪,S5-1探头频率1.6-3.2MHz,机械指数1.3。
1.2实验步骤1.2.1双靶向阳离子微泡载体系统构建及超声辐照下携SDF-1α双靶向阳离子微泡载体系统体外转染实验1.2.1.1双靶向阳离子微泡载体系统的构建由Invitrogen公司合成人SDF-1α引物,用TRIzolReagent(Invitrogen)处理人成纤维细胞获取总mRNA,然后经RT-PCR合成hSDF-1αDNA。
用Nhel/EcoRI限制性内切酶切开质粒pcDNA3.1(-)(Invitrogen),在相同的酶切位点插入RT-PCR产物,并用DNA酶连接。
根据相关文献,设计5NF序列5’-CTGGGGACTTTCCAGCTGGGGACTTTCCAGCTGGGGACTTTCCAGCTGGGGACTTTCCAGCTGGGGACTTTCCAGCT-3'
(每个下划线部分为一个NFκB基序),将其插入SDF-1α引物前,先合成SDF-1α-NFκBDNA,再用限制性内切酶BamHI/HindIII切开质粒pcDNA3.1(-)后,将SDF-1α-NFκBDNA插入相应的酶切位点,T4-DNA连接酶进行连接。
所有连接产物进行转化扩增、基因测序鉴定及提纯,提纯后的质粒用cy3核酸染料进行标记。
1.2.1.2携SDF-1α双靶向阳离子微泡载体和携SDF-1α阳离子微泡载体系统制备分别取1×
108/ml阳离子微泡与20ugph-SDF-1α-NFκB质粒、ph-SDF-1α质粒混合于1mlPBS溶液中,孵育,离心,取下层清液,制备携SDF-1α双靶向阳离子微泡载体系统和携SDF-1α阳离子微泡载体系统备用。
1.2.1.3超声辐照下携SDF-1α双靶向阳离子微泡载体系统体外转染实验用内皮细胞培养基(ECM,ScienCell)培养HUVEC(武汉大学人民医院中心实验室胡锦跃博士提供)至细胞长到(60-70)%融合时,在优化超声参数(微泡浓度=1×
107/ml;
声强=1.0W/cm2;
辐照时间=30s)条件下用UGT2007超声辐照仪(重庆医科大学声学研究所)照射三组混悬液进行转染。
三组混悬液分别为:
⑴双靶向阳离子微泡载体组(A组):
HUVEC+携SDF-1α双靶向阳离子微泡载体混悬液;
⑵阳离子微泡载体组(B组):
HUVEC+携SDF-1α阳离子微泡载体混悬液;
⑶对照组(C组):
HUVEC+pcDNA3.1质粒混悬液。
1.2.1.4检测指标⑴入胞率检测:
转染后4h用流式细胞仪(BeckmanCoulter)检测cy3阳性细胞率,从而测得质粒入胞效率;
⑵入核率检测:
用cy3标记过的质粒转染后再加入20ng/ml重组人IL-1β刺激,用DAPI进行核染色,用荧光显微镜观察cy3标记质粒的亚细胞定位情况;
用ImageJ1.46软件量化分析整个细胞内和核内的荧光强度(FLcell)和FLnucleus),质粒的入核效率=(FLnucleus/FLcell)x100%;
⑶hSDF-1α基因的表达检测:
用ELISA半定量检测hSDF-1蛋白表达。
1.2.2超声辐照下双靶向阳离子微泡载体系统体内转染促进内源性干细胞归巢1.2.2.1造模及分组日本大耳兔40只(购于武汉生物制品研究所实验动物中心),雌雄不限,体重2.0-2.5kg,实验动物清洁级达四级。
0.9%戊巴比妥钠以5ml/kg的用量经耳缘静脉注射麻醉,固定并连接心电图,开胸后结扎冠状动脉左旋支。
待左室前壁心肌颜色苍白,心电图胸前导联ST段呈弓背向上抬高,证实成功建立急性心梗模型,逐层关胸,术后肌注80万单位青霉素抗炎三天。
30只家兔建模成功。
造模成功后家兔随机分为三组:
⑴携SDF-1α双靶向阳离子微泡载体组(A组,10只):
心梗造模后1周经耳缘静脉团注携SDF-1α基因的双靶向阳离子微泡1ml;
⑵携SDF-1α阳离子微泡载体组(B组,10只):
心梗造模后1周经耳缘静脉团注携SDF-1α基因的阳离子微泡1ml;
⑶对照组(C组,10只),心梗造模后不进行任何处理。
1.2.2.2检测指标⑴SDF-1α基因表达检测:
基因转染后3天,分别从每组中抽取1只家兔处死。
取结扎线周围心肌组织,提取SDF-1α总蛋白,ELISA检测SDF-1α基因蛋白。
⑵干细胞标志物检测:
基因转染4周后处死实验动物,在结扎线以下短轴方向切取左室心肌,福尔马林固定,石蜡包埋、切片,行CD31和CD34免疫组织化学染色;
显微镜下观察视野中干细胞归巢效应。
⑶血管新生效应检测:
对心肌组织切面行VIII因子免疫组织化学染色后,呈现棕黄色的单个内皮细胞或数个内皮细胞群作为一个血管计数,在400倍视野下计数梗死区周围血管最多的5个区域,取其平均值[4]。
1.3统计学分析应用SPSS19.0统计学软件,计量资料用表示,多组间比较采用ANOVA检验,进一步两两比较用StudentNewmanKeulsq检验。
以P2结果2.1超声辐照下携SDF-1α双靶向阳离子微泡载体系统体外转染实验2.1.1SDF-1α质粒入胞率检测超声辐照下,A组与B组组间荧光阳性细胞比例无显著差异(P>
0.05),见表1。
2.1.2SDF-1α质粒入核率检测超声辐照下,A组胞核中相对荧光强度明显高于B组(P2.1.3体外转染实验SDF-1α基因表达的检测ELISA结果显示,A组的SDF-1α蛋白表达明显高于B组和C组,见表1。
表1体外实验不同组别SDF-1α质粒入胞率、入核率及基因表达效率检测±
s)Table1DetectionofSDF-1αplasmidcellularimportrate,nuclearimportrateandgeneexpressionofSDF-1αproteininvitro组别入胞率(×
10-2)入核率(×
10-2)体外SDF-1α蛋白表达量(ng/mg)A组81±
772±
12①63±
10①②B组80±
514±
515±
10②C组--5±
2注:
与B组比较,①PP2.2超声辐照下双靶向阳离子微泡载体系统体内转染促内源性干细胞归巢效应的检测2.2.1SDF-1α蛋白检测ELISA结果显示,与B组及C组比较,A组家兔心肌组织中SDF-1α蛋白表达量显著增高(P表2体内实验不同组别SDF-1α基因表达效率及新生血管效率检测±
s)Table2DetectionofgeneexpressionofSDF-1αproteinandangiogenesisinvivo组别体内SDF-1α蛋白表达(pg/mg)毛细血管密度检测(个/高倍镜视野)A组233±
64①②46.4±
6.8①②B组125±
55②21.7±
5.4②C组57±
484.1±
1.8注:
与B组比较,①PP2.2.2干细胞标志物检测干细胞标志物CD31及CD34免疫组化结果显示,与B组及C组比较,A组家兔心肌组织中干细胞标志物阳性染色显著增强,见图1。
图1心肌干细胞标志物检测Figure1Thedetectionofstemcellmarkers注:
上图为CD31分子检测,下图为CD34分子检测;
A组CD31、CD34阳性染色明显强于B组和C组2.2.3血管新生效应检测VIII因子免疫组化染色显示:
与B组及C组比较,A组家兔心肌组织中毛细血管密度显著增加,见表2、图2。
图2心肌新生血管检测Figure2Thedetectionofangiogenesis注:
VIII因子(血管内皮标志物)免疫组化示:
A组新生血管明显多于B组和C组。
3讨论干细胞归巢是指在多种因素作用下,自体或外源性干细胞定向趋向性迁移越过血管内皮细胞至靶向组织并定植存活的过程。
干细胞疗法的关键在于如何使干细胞高效地到达靶组织,其中干细胞归巢信号在心肌修复过程中起到重要作用,目前最有效的是SDF-1α/CXCR4轴[5-7]。
现时治疗心肌梗死较为关注的为干细胞移植,然而由于外源性移植的干细胞归巢能力普遍较低,从而阻碍了干细胞治疗的发展。
其主要原因可能为:
随着传代次数以及体外培养时间的延长,干细胞胞膜上的CXCR4受体下降,以及在移植过程中干细胞的流失,导致归巢至靶组织的干细胞数量不足;
另外,SDF-1α分泌高峰在心梗后的四天左右,而干细胞移植的最佳时间在心梗后1周,从而错过了有效的SDF-1α浓度,导致归巢信号不能充分诱导干细胞归巢至靶区域[8-9]。
并且移植的干细胞存在一定的免疫原性,且可能存在潜在的致恶性心率失常,致癌性等风险[10-11]。
内源性干细胞诱导剂动员干细胞靶向归巢至受损心肌局部成为未来干细胞治疗心肌梗死的新趋势。
心肌梗死后,在基质衍生因子1(SDF-1α)、血管内皮生长因子(VEGF)、促红细胞生成素(EPO)、粒细胞集落刺激因子(G-CPS)、粒-单核细胞集落刺激因子(GM-CSG)、干细胞因子(SCF)等相关因子作用下,内源性干细胞可穿过梗死区高通透性的新生血管到达靶组织。
上述因子主要是SDF-1α发挥了内源性干细胞动员剂作用[12-14]。
其促进内源性干细胞归巢的机制可能为:
①激活SDF-1α/CXCR4信号轴使Rac蛋白与GTP活化,活化的Rac蛋白使细胞发生极化,出现头端和尾端并向目标方向迁移[15];
②通过上调干细胞表面CXCR4受体的表达水平,在SDF-1α对CXCR4的募集作用下,干细胞可迁移到SDF-1α高表达的区域。
另外SDF-1α可通过旁分泌作用,促进新生血管的生成。
然而由于心肌梗死时所导致的归巢于心肌梗死区的内源性干细胞数量极少,故自我修复的作用也极为有限。
近年来,超声靶向破坏微泡(UTMD)因其靶向性、无毒、非侵入性及无免疫反应等优点,已成为一种可用于体内基因转染的新技术[16-18]。
UTMD可提高缺血心肌区域SDF-1α的表达,以及上调干细胞表面CXCR4的表达,为UTMD通过SDF-1α/CXCR4轴增加干细胞的归巢提供了分子机制。
其机制可能为:
①超声辐照下,使大量的CXCR4从细胞内转移到细胞膜并定位于细胞膜表面;
②UTMD冲击波和微射流产生的空化效应,使细胞膜的通透性增加,可能为跨膜蛋白CXCR4提供了一个物理传送通道;
③UTMD通过上调CXCR4基因和蛋白的表达,增加细胞内CXCR4的储备以及帮助CXCR4定位于细胞表面[19-20]。
通过CXCR4/SDF-1α轴,促进大量的干细胞归巢于靶向组织,从而修复受损心肌,改善心功能。
本研究体外实验结果亦进一步证实,本课题组前期成功构建的一种能先后跨越细胞膜及核膜两道屏障的双靶向阳离子微泡基因载体系统,能通过增加SDF-1α质粒入胞率和入核率有效增加SDF-1α基因的体外转染效率,为超声辐照下携SDF-1α的双靶向超声微泡系统表达足够SDF-1α蛋白促内源性干细胞归巢提供前提条件。
体内实验中,超声辐照+双靶向阳离子微泡基因载体系统介导基因转染3天后心肌梗死区域SDF-1α蛋白表达即显著增加,形成了趋化因子浓度梯度;
免疫组化结果证实心肌梗死后4周该区域干细胞标志物CD31及CD34等阳性染色显著增强,提示心肌梗死局部高表达的SDF-1α已充分发挥干细胞趋化因子的作用,诱导大量内源性干细胞向心肌梗死局部聚集;
VIII因子染色显示,心肌梗死局部心肌组织中毛细血管密度显著增加,表明心肌梗死局部大量聚集的内源性干细胞已经开始发挥其多向分化潜能,即分化为血管细胞,改善心肌微循环,促进组织的修复。
4结论超声辐照下携SDF-1α的胞膜核膜双靶向阳离子微泡载体系统能有效促进内源性干细胞归巢,其可能机制是该载体系统有效提高SDF-1α基因载体转染效率,表达足量的SDF-1α蛋白并发挥其干细胞诱导剂作用,从而促进内源性干细胞归巢并促进局部血管新生。
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