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6.禽痘病毒属(Avipoxvirus):
有鸡痘病毒(Fowlpoxvirus)、鸽痘病毒(Pigeonpoxvirus)、金丝雀痘病毒(Canarypoxvirus)、麻雀痘病毒(Sparrowpoxvirus)、火鸡痘病毒(Turkeypoxvirus)、燕八哥痘病毒(Starlingpoxvirus)、鹌鹑痘病毒(Quailpoxvirus)、雪鸡痘病毒(Juncopoxvirus)。
7.软疣痘病毒属(Molluscipoxvirus):
如人传染性软疣病毒(Molluscumcontagiosumvirus)。
8.亚塔痘病毒属(Yatapoxvirus):
如亚巴猴瘤痘病毒(Yabamonkeytumorpoxvirus)。
(二)昆虫痘病毒亚科
该亚科包含昆虫痘病毒A属(EntomopoxvirusA),有蛴螬(鞘翅目)昆虫痘病毒等9
个种;
昆虫痘病毒B属(EntomopoxvirusB),有摩氏蛾(鳞翅目)昆虫痘病毒等9个种;
昆虫痘病毒C属(EntomopoxvirusC),有淡黄摇蚊(又翅目)昆虫痘病毒等6个种。
以上痘病毒,在病毒颗粒形态、大小、化学组成,包括DNA含量及在宿主细胞浆内繁
殖的模式均相似。
某些痘病毒具有共同的属抗原(NP),并具有拯救其它加热灭活痘病毒的能力。
属内的痘病毒之间,在形态、抗原性及生物学性质方面一般是相似的。
二、病毒粒子的形态
所有痘病毒的毒粒呈砖形或大卵圆形。
痘苗病毒大小为270X218nm,正痘病毒属的
其它成员,兔痘病毒属和禽痘病毒属的成员,大小和外形均十分相似。
Orf病毒较窄小,
约252X158nm绵羊痘病毒较小,约194X115nm。
采用负染色或超薄切片电镜观察,毒
粒在形态上具有三个主要结构成分:
一个双凹面的核心体,两个侧体和包膜。
病毒基因组集中在核体内,有蛋白质外膜。
感染性痘苗病毒颗粒有两种形式:
一种是细胞内的,也是主要的,即具有脂蛋白外膜,双凹核体和侧体;
另一种存在于细胞外,一般仅占<
1%-20%
因不同毒株和宿主细胞而有所差异。
它具有额外的一层脂蛋白外膜,可能来自高尔基体膜。
三、理化性质
毒粒的沉降系率为5X103。
痘苗病毒毒粒的密度在稀释的缓冲液中为1.16g/cm3,在
53%勺蔗糖溶液中为1.25g/cm3,在酒石酸钾溶液中为1.20g/cm3。
毒粒的重量为4.5X10-15g。
痘苗病毒在生理pH值时带负电荷,兔痘病毒的等电点为2.3,天花病毒、类天花病毒和猴
痘病毒为3.4,牛痘病毒和痘苗病毒为4.0。
毒粒的主要成分为蛋白质,约占干重的90%DNA约占5%约含有3.2%的类脂,主要是胆固醇、磷脂和中性脂肪。
磷脂中主要是卵磷脂。
有报道说,鸡痘病毒中类脂含量极高,约占其重点的1/3。
此外,尚有微量的非DNA的碳水化合物,还可能含有极微量的铜、核黄素和生物素。
四、毒粒中含有的酶
已知痘病毒中至少含有转录系统的多种酶类。
I.依赖于DNA的RNA聚合酶,约500kd,含有147kd、132kd、34kd、22kd、21kd、20kd和17kd的亚单位。
在DNA病毒中,仅知痘病毒与非洲猪瘟病毒有它们自己的RNA聚合酶。
2.聚(A)聚合酶,80kd,含有55kd和33kd两个亚单位。
3.RNA鸟嘌呤基转移酶。
4.RNA鸟嘌呤7-甲基转移酶。
5.RNA(核苷-2)甲基转移酶,38kd。
6.GTP焦磷酸转换酶。
7•多核苷酸三磷酸酶。
&
依赖核酸的核苷三磷酸酶I、II,72kd、68kd。
9.蛋白激酶,62kd。
10.5-磷酸多核酸激酶,目前尚未纯化。
II.内核酸核酸酶,目前尚未纯化。
12.单链特异性去氧核糖核酸酶。
13.拓朴异构酶,在DNA病毒中,目前仅知痘病毒有自己的拓朴异构酶。
五、毒粒的多肽组成
痘病毒毒粒含有大量的蛋白,纯化的毒粒经SDS-PAGE至少可以分辨出30个条带。
共
12个区带,大部分区带中还包含着几个条带,有的条带可能是未加工的高分子前体,有的因为糖化或磷酸化使多肽形成多样性。
双向电泳表明,在毒粒内存在100种以上的多肽。
胞外病毒毒粒的外膜至少有8个多肽:
210kd、110kd、89kd、42kd、37kd、21.5
kd和20kd,其中7个是糖蛋白,37kd是主要蛋白,不糖基化;
89kd蛋白是血凝素。
胞内病毒毒粒的外膜蛋白中,54〜58kd蛋白形成表面的微管结构,它可引起中和抗
体和抑制细胞-细胞融合,另一种14kd蛋白也可引起中和反应。
在毒粒核心中有4种蛋白,74kd、62kd、25kd和11kd,占核心重量的70%其中11kd和25kd蛋白对DNA有很强的亲和性。
第二节痘病毒基因组的结构
痘病毒基因组的长度差异较大,副痘病毒约130kb,而禽痘病毒约300kb。
采用温和
的DNA提取办法可以获得完整的无缺口的病毒DNA分子,其长度的变化也较大,从兔痘病
毒的120Md至牛痘病毒的145Md,就痘苗病毒本身的DNA长度也有变异,不同毒株为120〜130Md,即180〜200kb,其DNA无感染性。
正痘病毒属各成员的基因组有70%〜90%勺同
源性,其基因组结构的特点如下:
DNA末端的发夹结构
痘病毒DNA链的末端有单链的发夹结构,即末端交叉连结。
由于这结构,原始基因组和末端的酶切片段在碱或加热变性后很快可以复性。
存在这一发夹结构的证据是,如果不用单链特异性核酸酶处理,毒粒DNA对外切酶III、末端转移酶、多核苷酸激酶、蛇毒磷
酸二脂酶和脾磷酸二脂酶的活性是有抵抗。
就痘苗病毒DNA末端进行克隆和序列分析的结果表明,每一末端有104核苷酸并不完
全配对,存在两种形式,呈倒置互补,称为“反转”发夹结构,即使在合适的构形中,还有10个核苷酸不能配对。
至于在DNA复制过程中,这一单链复制区的命运尚不清楚。
Pogo(1977)报道,在接
种痘苗病毒后,这一交叉连结的发夹结构在90min内消失。
母株DNA发夹结构消失的时间
相当于DNA合成开始的阶段,在DNA合成停止时,发夹结构才重新出现。
发夹结构的消失是在末端发夹单链区产生缺口还是在DNA的主体部分发生缺口,也尚未阐明。
Esteban等
(1977)在电镜下研究痘苗病毒DNA复制中间体,发现逐渐增大的末端双链复制的泡状结构,提示在DNA复制早期,末端发夹结构并未解开。
目前,关于带有末端发夹结构的线状DNA的复制机理有3种模式,即Bateman模式、Esteban模式、McFadden和Morgan模式。
二、DNA末端的倒置重复序列
正痘病毒基因组具有较长的末端倒置重复序列(ITRs)。
不同成员的ITRs的长度也不
一样,痘苗病毒、牛痘病毒和猴痘病毒的ITRs约有10kb长,而兔痘和鼠痘病毒则仅为其
一半,天花病毒则十分短,小于2kb。
这种结构与腺病毒、疱疹病毒的ITRs相似,但后
者短得多。
病毒的ITRs结构可能与繁殖方式有关。
在ITRs的远侧端尚有串联的重复序列区。
紧接着“反转”发夹结构有-86核苷酸的区段NR1,依次跟随着:
(1)第一套串联重复序列(Set1),它由串联的重复序列单位所组成,在痘苗病毒则为AB两个单位,长约70bp,有13次重复;
(2)NR2独特区,牛痘与痘苗病毒有77%的同源,其中有DdeI和AluI切点;
(3)第二套串联重复序列(Set2),AB两个单位重复18次;
(4)NR3独特区,在痘苗病毒Set2后1800bp处有SalI切点;
在牛痘病毒Set2后269bp处有SalI切点。
这两种病毒的重复单位十分相似,但其排列不同。
倒置末端重复区内的串联重复区的生理作用,可能是加速单链DNA的自我退火而形
成环状结构。
另外,在倒置末端重复区内还编码早期蛋白。
这种不转录的、周期性的、或长或短的高度重复序列是DNA基因的共同特征。
它可能
无特异性功能,有人建议称为“自私DNA。
其所以能保持其恒定结构,可能是由于不等重
组的结果。
痘苗病毒DNA的末端的这种13〜18串联重复序列也属于此类。
这种转座子样的排列可
以促进重组的发生,导致DNA末端序列的不均一性,这可以解释DNA末端的酶切片段在凝
胶电泳中为什么呈散状。
在痘苗病毒的传代过程中,其DNA分子有两种形式,一种称为稳
定形成,即每端有一套13〜18的70bp的串联重复序列,13次与18次之间有435bp的间隔;
另一种称为不稳定形式,即有多套重复序列和间隔。
在连续传代的母系病毒中,有20%是不稳定型。
这一现象,即使将病毒反复纯化也不能避免,单一病毒颗粒就可以形成这一结果。
DNA稳定型和不稳定型的感染性没有差别。
它们之间的转变可以用下列重组模式
来解释:
第一步在DNA分子的第一套串联重复序列与另一个分子的第二套之间发生重组,这样,可以形成缺乏一套重复序列和间隔序列的分子,以及具有三套重复序列的分子。
由于重复序列在倒置末端重复区内,因此,重组可以发生在同一分子或不同分子的对立端,这样就可以形成许多具有不同数量重复序列的分子,包括稳定型DNA分子。
三、痘病毒基因组的保守区与变异区
除浣熊和Tatera痘病毒外,其它痘病毒科成员基因组的酶谱是十分相似的。
以5种正痘病毒,即痘苗病毒4株、猴痘病毒3株、天花病毒2株、牛痘病毒4株和鼠痘病毒2株,共15株进行DNA酶切分析,从HindIII切点的分布来看,中央区大约有120kb区段是保
守的,但其中也有一些型特异性的差异存在,特别是鼠痘病毒株,在近末端区的变异则较大,包括长度和序列。
在兔痘、牛痘和痘苗病毒DNA倒置末端重复区间有同源序列。
有人
采用详细的酶谱分析证明,Utrecht株和Elstree株DNA的差异完全发生在末端,包括末
端的重复序列和附近序列。
Panicali等(1981)报道,在痘苗病毒WF株的传代过程中分
离出两种变异株,称为S和L变异株。
两种变异株经HindIII、AvaI、XhoI、SstII和SmaI分析说明,在S变异株中有一段6.3Md的缺失,它位于离末端6.8Md之外,也就是刚好在倒置末端重复区之外。
这段缺失的片段在体内体外均有转录物,但对该毒株在Hela细胞上生长周期并无影响。
作者认为多出的6.3Md片段,可能在病毒进化过程的早期来源
于宿主细胞,而为病毒复制所必需,在随后的演变过程中为其它机制所取代。
另外,他还证明WF株的AvaIM片段(DNA最末端的大小常有变化,变化范围大约有50〜300bp)。
由此可见,一般来说,正痘病毒基因组中央区约120kb为保守区,两侧的侧翼区长
40kb。
一般认为中央保守区编码与病毒繁殖有关的重酶类,而两侧的侧翼区则与型特异性、
宿主范围等性质有关。
四、痘病毒变异株
1.TK变异株:
胸腺嘧啶核苷激酶(TK)是一种嘧啶旁路代谢的酶类,它可促使胸腺
嘧啶核苷磷酸化,形成5'
单磷酸胸腺嘧啶核苷。
采用在5'
溴去氧尿苷的压力下,很易选
择出TK—变异株。
痘病毒的TK基因位于HindIIIJ片段中,TK基因常用作基因工程的一种选择性标记,在TK基因部位插入外源基因的重组痘苗病毒,可以表达外源基因而不影响
病毒的繁殖。
Weir等(1983)对3株自发的TK变异株的TK基因编码区进行了序列分析,并与野毒株进行了比较,结果发现,3株TK—变异株都是由于一个核苷酸重复引起移码而造成的。
2.ts变异株:
ts变异株是病毒株天然变异的一种常见形式。
采用克隆基因片段标记拯
救的方法,对属于17个互补组的33株痘苗病毒ts变异株进行了基因定位。
结果说明,所
有ts变异的基因损害部位均集中在中央保守区,从HindIIIE至SalIJ,大约60%的基因组
内。
没有一个ts株基因定位于外侧片段HindIIIF、HindIIIK、SalIC、SalIE、SalIF或SalII之内。
也有人认为ts株基因定位于HindIIIF内。
ts株的基因定位集中在中央保守区,这同时说明保守区内含有病毒繁殖的主要功能。
兔痘病毒中也存在ts变异株。
3.U、P或Uhr变异株:
正痘病毒在鸡胚绒毛尿囊膜(CAM上生长时,有的可以产
生溃烂的病灶或痘斑,中央有出血呈红色,称红痘。
有1%左右的野毒株可以产生白的非溃
烂的病灶,称为白痘。
这种白痘的变异株以“U'
或“『表示,相对应的野毒株则为U+o
在U变异株中,凡不能在PK细胞中繁殖者以“P”或“hr”表示,相对应的野毒株则为P+o
这样,野毒株为『、P+,U变异株则为U、P+,P变异株则为U、Po
对牛痘病毒、猴痘病毒、兔痘病毒的U或P变异株的酶谱分析表明,在其基因组的两
端有缺失。
在兔痘病毒变异株,左右两端DNA各可缺失10和20MD相当于整个DNA勺25%。
其DNA左臂缺失,右臂不缺失可影响U变异株在猪肾和兔角膜细胞上的繁殖。
某兔痘U变
异株,其毒力下降。
毒力下降与基因组右臂的缺失有关。
兔痘病毒U变异株的基因缺失可
发生在左或右臂,但牛痘和猴痘病毒则发生在右臂,痘苗病毒可发生在左臂。
4.PAAr变异株:
在高浓度的PAA(磷羧乙酸)下可抑制痘苗病毒DNA多聚酶,使部
分病毒的繁殖受到抑制。
但可分离出对PAA有抵抗的变异株,称为PPA变异株。
这一特征
可用于作为标记拯救的表型特征,从而确定痘苗病毒DNA多聚酶基因位于HindIIIE片段右
侧端2kb的EcoRl-ClaI片段中。
PAA变异株的基因本质尚未阐明。
五、痘病毒基因组的多肽编码图
痘病毒基因组约有180〜200kb或120〜132Md,编码大约150〜200个多肽。
它编码的多肽可以分成3类:
立即早期蛋白、早期蛋白和晚期蛋白。
前两者是病毒在感染后4h
内所合成的有关病毒复制的酶类,后者主要是病毒的结构蛋白。
确定病毒DNA的多肽编码
图的方法,主要是采用克隆的基因片段与从受染细胞中提取的立即早期RNA早期RNA或
晚期RNA进行杂交,然后再将杂交的相应RNA洗脱出来,在无细胞翻译系统、35S甲硫氨酸
存在的条件下,翻译出相应的蛋白,在SDS-PAG上进行检测,这一技术称为杂交翻译法。
要确定单一多肽的基因定位,还要进一步缩小克隆的基因片段进行杂交翻译,结合功能检测、S1双链保护试验、序列分析等才能最后阐明单一多肽的基因定位与结构。
六、痘苗病毒基因组表达调节的特点
痘苗病毒的基因组很复杂。
目前,大部分基因组的一级结构已经阐明。
根据资料来看,痘苗病毒有具自身的基因调节机制,这些特点可以归纳如下:
1.基因的连续性:
不论是早期还是晚期基因均具有连续的编码序列,未发拼接现象,但也有报道11K基因存在有不连续现象或转录后加工的迹象。
2.启动子序列:
有较特殊的,为本身RNA多聚酶所识别的启动子序列。
痘苗病毒的
RNA多聚酶与大肠杆菌、酵母、果蝇等原核、真核RNA多聚酶有相当的同源性。
早期启动
子位于RNA转录起始上游30bp处,大致上可分为3个区段:
起始区、间隔区、核心区,各区内都有保守序列。
已发现一种早期转录因子VETF含有82KD和77Kd蛋白,类似于
DNA结合蛋白TFIID。
晚期启动子也位于RNA转录起始上游30bp处,大致上也可分为3个区段:
转录起始区(6bp)、间隔区(6bp)和A/T丰富区(约20bp)。
由此可见,痘苗病毒启动子的一致区显然不同于真核系统和原核系统的启动子,后者的活动子具有两个一致区。
痘苗病毒启动子的另一个特点是,一个基因的启动子序列常是另一个基因编码区的一部分。
有的基因部分重叠,说明基因编码十分紧凑。
3.起始密码子附近序列:
Kozak(1984)比较了211种高级真核细胞的mRNA发现其
ATG附近的序列有一明显的特点,ATG前-3位是嘌呤,而且主要是A,而-1、-2、-4和-5
主要是C,并提出真核基因翻译起始的一致序列为CCA/GCCAUGG)。
而痘苗病毒基因的翻
译起始区,就已报道的,与真核不相似。
在ATG之后的核苷酸是嘌呤,A或G大致相等,
而ATG之前的主要是A和To
4.转录终止:
早期转录终止于T5NT之后50〜70bp处。
T5NT是Cis作用的区段,它
还有阻止上游转录干扰的功能。
而晚期转录在5'
端有聚(A)帽子,而聚(A)与mRNA
之间的连接则位于TAAATG序列内,但无明确的3'
端,不少基因的3'
端有CTATTC4次重复。
Joklik(1985)认为正痘病毒的基因组可能起源于原核基因,而疱疹病毒、腺病毒
和乳多空病毒基因组可能来源于真核基因。
第三节早期转录
一、TK基因
哺乳动物痘病毒的TK基因序列彼此相似,而与禽痘病毒的不同,后者在病毒基因组中
的位置也不同。
痘苗病毒的TK基因位于HindIIJ片段的左端,其一级结构基本吻合,但
在基因编码序列的两侧有少数核苷酸的差异,而Hruby认为不论在侧翼还是在编码区均有少许差异。
TKmRNA长度为570〜580bP,3'
端不一致,差异在10bp之内,编码177个氨基酸,分子量为20102d,这与TKmRNA在无细胞体系中翻译后在SDS-PAGE上测定
为19Kd的结果相似。
但是,过去从受染细胞中提取的TK部分提纯后测得的大小为40〜
42Kd。
由于自然的痘病毒TK大小为80Kd。
因此,推测它可能以四聚体的形式存在。
二、DNA聚合酶
痘苗病毒编码有本身的DNA聚合酶,它是分子量为110Kd的单一多肽。
该基因位于HindIIIE的右端,具有共同5'
端的两种RNA,3.4Kb和3.9Kb,在体外翻译可获得110Kd多肽。
三、mRN臓帽酶一RNA鸟苷酸转移酶大亚单位
真核mRNA一般要在5'
端和3'
端进行加工。
5'
端需要有一个帽子结构,3'
端有一聚(A)尾,长约150〜200bpo5'
端帽子结构用于与核糖体结合,使翻译过程能有效起始,这可能是通过细胞的某种多肽与5'
端的帽子结构相结合而介导的。
端帽子结构
还可抵抗5'
外切酶的降解,3'
端聚(A)可增加mRNA的稳定性。
痘苗病毒的mRNA
戴帽酶由两个亚单位所组成。
RNA鸟苷酸转移酶大亚单位定位于HindIIID片段左端3.1kb
处,其mRNA为3.0Kb,编码84Kd多肽,该酶小亚单位也定位于HindIIID片段。
再向
左靠近编码大亚单位的mRNA处,有一34Kd多肽,是聚(A)多聚酶的一个亚单位。
这一基因附近还有110Kd多肽,它是依赖于DNA的DNA聚合酶的大亚单位。
有可能在功能上相近的多肽均集中编码在这一区段。
四、表皮生长因子(EGF)
表皮生长因子(EGF和转化生长因子I型(TGF)各为53和50个氨基酸的多肽,两者均能结合EGF受体,后者是一种含有1200氨基酸的转膜糖蛋白。
EGF或TGF与受体结合
后可使后者磷酸化,增加其酪氨酸特异性激酶的活性,从而刺激细胞生长。
1985年Brown
等报道,从2,676个多肽序列库中发现有3种多肽与TGF相似:
①小鼠EGF②人EGF③19Kd痘苗病毒早期蛋白,140个氨基酸中的45〜85个氨基酸区段。
已知前两者与TGF同
源。
痘苗病毒早期19Kd多肽的编码区位于HindIIIC片段的倒置末端重复区内,在7.5Kd和42Kd多肽之间。
该多肽与rTGF(大鼠)比较有15
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