实验一 血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳Word文档下载推荐.docx
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从正极端起,依次为:
清蛋白、α1蛋白、α2球蛋白。
β蛋白、γ球蛋白。
如图2所示:
定量测定时,可将膜条用滤纸压平吸干,按区带分段剪下,分别浸在0.4NNaOH溶液中,并剪下相同大小的无色区带,膜条作空白对照,迸行比色;
或者将干燥的电泳图谱膜条放入透明液中浸泡2~3min后贴于洁净玻璃板上,干后,即为透明的薄膜图谱,可用光密度计直接测定。
实验二酪蛋白的制备
学习从牛乳中制备酪蛋白的原理和方法。
牛乳中主要的蛋白质是酪蛋白,含量约为35g/L。
酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物,等电点为4.7。
利用等电点时溶解度最低的原理,将牛乳的pH调至4.7时,酶蛋白就沉淀出来。
用乙醇洗涤沉淀物,除去脂类杂质后,便可得到纯的酪蛋白。
1.牛奶
2.离心机
3.抽滤装置
4.精密pH试纸或酸度计
5.电炉
6.烧杯
7.温度计
1.95%乙醇
2.无水乙醚
3.0.2MpH4.7醋酸-醋酸钠缓冲液
A液:
0.2M醋酸钠溶液
B液:
0.2M醋酸溶液
称有机纯醋酸(含量大于99.8%)12.0g,定容至1000ml
4.去A液1770ml,B液1230ml混匀,即得pH4.7醋酸-醋酸钠缓冲液。
5.乙醇乙醚混合溶液:
乙醇:
乙醚=1:
1(V/V)
1.将100牛奶加热到4℃。
边搅拌边缓缓加入预热至40℃的缓冲液,并调节pH之后,冷却至室温。
以3000r/min离心10min。
弃去上清液,得酪蛋白粗制品。
2.用水洗涤三次,3000r/min离心,弃去上清液。
3.在沉淀中加入乙醇,搅拌片刻,将全部悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤。
用乙醇-乙醚混合液沉淀两次,最后再用乙醚沉淀两次,抽干。
4.将沉淀摊开在表面皿上,干燥后得酪蛋白纯品。
5.准确称量后,计算含量,并与理论含量(3.5g/100ml)相比求出实际得率。
酪蛋白含量g/100ml:
牛乳(g%)
得率=
100%
实验三甲醛滴定法测氨基氮
初步掌握甲醛滴定法测定氨基酸含量的原理和操作要点。
水溶液中的氨基酸为两性离子,因而不能直接用碱滴定氨基酸的羧基。
用甲醛处理氨基酸,甲醛与氨基结合,可形成—NH—CH20H,—N(CH2-0H)2等羟甲基衍生物,使NH3+放出的H+游离出来,这样就可用碱滴定放出的H+,测定氨基氮,从而计算出氨基酸的含量。
若样品中只含某一种已知氨基酸,由甲醛滴定的结果可算出氨基酸的量。
若样品是多种氨基酸的混合物〈如蛋白水解液〉,则滴定结果不能作氨基酸滴定量的依据。
一般常用此法测定蛋由质水解程度,水解程度的增加滴定值增大,当水解完全后,滴定值保持平衡。
但脯氨酸与甲醛作用生成不稳定化合物,致使滴定结果偏低;
脯氨酸的酚基结构又可使滴定结果偏高。
1、锥形瓶
2、25ml碱式滴定管
3、移液管
1.0.5%酚酞酒精溶液
0.5g酚酞溶于100mL60%乙醇中
2.0.05%溴麝香草酚蓝溶液
0.05g溴麝香草酚蓝溶于100mL20%乙醇溶液中
3.1%甘氨酸溶液
1g甘氨酸溶于100rnl蒸馏水
4.标准0.100mol/LNaOH溶液,可采用0.100mol/L标准HCl溶液标定
5.中性甲醛溶液
50ml甲醛溶液,加约3ml0.5%酚酞指示剂,滴加o.1mol/LNaOH溶液,使溶液成微粉红色,临用前配制。
取3只锥形瓶,编以1、2、3号。
于1、2号瓶中各加甘氨酸溶液2.0ml及水5.0ml;
于3号瓶中加水7.0ml。
然后3只锥形瓶中各加入甲醛溶液5.0ml,0.05%溴麝香草酚蓝溶
液两滴及0.5%酚酞酒精溶液4滴。
再用标准0.1mol/LNaOH溶液,滴定至紫色(pH0.7-9.0)。
则每ml氨基酸溶液中含氨基氮的mg数为:
氨基氮(mg/ml)=
注:
A——滴定样品消耗NaOH溶液的ml数
B——滴定空白消耗NaOH溶液的ml数
1.4008——1ml0.1mol/LNaOH溶液相当的氮mg
实验四氨基酸纸层析法
通过氨基酸的分离,了解层析法的基本原理和操作方法。
用滤纸为支持物进行层析的方法,称为纸层析法。
纸层析所用展层溶剂大多由水和有机溶剂组成。
滤纸纤维与水的亲和力强,与有机溶剂的亲和力弱,因此在展层时,水是固定相,有机溶剂是流动相。
溶剂由下向上移动的称上行法;
由上向下移动的称下行法。
将样品点在滤纸上(此点称原点),进行展层,样品中氨基酸在两相中不断迸行分配。
由于它们的分配系数不同,不同氨基酸随流动相移动的速率就不同,于是将氨基酸分离开来。
形成距原点距离不等的层析点。
溶质在滤纸上的移动速率用Rf值表示:
Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。
在一定条件下,某种物质的Rf值是常数。
本实验采用纸层析法分离氨基酸。
氨基酸是无色的,利用茚三酮反应,可将氨基酸层析点显色作定性、定量用。
1.氨基酸溶液:
缬氨酸、组氨酸、亮氨酸和谷氨酸溶液及它们的混合液,各组分浓度均为0.5%。
2.层析缸
3.层析滤纸(新华1号)
4.毛细管
5.吹风机
6.烘箱
7.喷雾器
8.刻度尺
9.铅笔
10.表面皿
1.展层剂:
正丁醇:
甲酸:
水=15:
3:
2(V/V)
2.显色剂:
0.5g茚三酮溶于100ml无水丙酮,即得0.5%茚三酮一无水丙酮溶液,贮于棕色瓶中备用。
1.标记:
取层析滤纸(22×
14cm)一张。
在纸的一端距边缘2~3cm处用铅笔划一直线,在直线上每间隔2cm做一记号,标出5个原点。
用毛细管将各氨基酸样品点在5个原点上,用量10~20μl,点子直径不超过3mm,边点样边用电吹风吹干。
3.展层:
将点好样滤纸放入装于展层剂的层析缸内,展层剂必须在点于下方。
盖层析缸。
待溶剂上升至15~20cm,用铅笔描出溶剂前沿界线,把滤纸放于表面皿上,于烘箱内105℃15min烘干。
4.显色:
用喷雾器均匀喷上显色剂后于烘箱内100℃5min,即可显出个层析斑点。
5.计算各种氨基酸的Rf值。
实验五酵母核糖核酸的提取及组分鉴定
了解核酸的组分,并掌握鉴定核酸组分的方法。
酵母核酸中RNA含量较多,DNA少于2%。
RNA可溶于碱性溶液,当碱被中和后,加入乙醇可使解聚的核糖核酸沉淀,由此即得到RNA粗制品。
1.干酵母粉
2.天平
3.烧杯
4.抽滤瓶
5.布氏漏斗
6.移液管
7.玻棒
8.pH试纸
9.离心机
1.0.2%NaOH溶液
2.乙酸(A.R)
3.95%乙醇
4.无水乙醚(C.P)
5.氨水(C.P)
6.10%H2SO4溶液
7.5%AgNO3溶液:
5gAgNO3溶于蒸馏水,定容至l00ml,贮于棕色瓶中。
8.苔黑酚一三氯化铁试剂
9.定磷试剂
1.RNA的提取
称取4g干酵母粉于100ml烧杯中,加入0.2%NaOH溶液40ml,沸水浴中加热30min并经常搅拌。
加数滴乙酸,使提取液呈酸性。
4000r/min离心10~15min,取上清夜,边搅边搅拌边加入95%乙醇洗涤两次,无水乙醚洗两次后,将沉淀转移至布氏漏斗中抽滤,干燥后即得粗RNA。
2.鉴定:
取上述粗RNA0.5g,加10%H2SO4溶液5ml,加热至沸1~2min,制得RNA水解液。
(1)嘌呤碱:
取水解液2ml,加氨水2ml,5%NaOH溶液,观察是否产生絮状嘌呤碱的银化合物。
(2)核糖:
取水解液0.5ml,加苔黑酚-FeCI3;
试剂1ml,加热至沸1min,观察颜色变化。
(3)磷酸:
取水解液1ml,加定磷试剂1ml,水浴上加热,观察溶液是否变成蓝色。
实验六蒽酮比色定糖法
掌握蒽酮比色定糖法的原理及方法。
蒽酮可以和游离的己糖或多糖中的己糖基,戊醛糖及己醛糖酸起反应,反应后溶液呈蓝绿色,在620nm处有最大吸收。
蒽酮可与其它一些糖类发生反应,但显现的颜色不同。
当样品中存在有含较多色氨酸的蛋白质时,反应不稳定,呈现红色。
本法是一种快速而简便的定糖方法,多用于测定糖原含量,亦可用于测定可溶性糖含量。
l.移液管
2.刻度试管
3.水浴锅
4.冰浴锅
5.72型分光光度计
1.无蛋白糖类溶液:
2.蒽酮试剂
2g蒽酮溶于1000ml80%(v/v)硫酸中,现配现用。
3.标准葡萄糖溶液(0.1mg/ml)
100mg糖原溶于蒸馏水定容至1000ml。
1.制作标准曲线
取6支试管编号,依次加入标准糖溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5ml,均用蒸馏水补足至l.0ml。
置水浴中5min,各加蒽酮试剂4ml,沸水浴中准确煮沸10min,自来水冷却,室温放置10min后,比色测定光密度OD620,并以此为纵坐标,糖含量为横坐标,绘制标准曲线。
2.样品含量测定
吸取1ml无蛋白糖类溶液于试管中,水浴冷却,加入4ml蒽酮试剂,沸水浴中煮沸10min,自来水冷却,静置10min后比色测OD620,并由标准曲线上查出样品液糖含量。
3.计算:
实验七酶的特性
加深对酶性质的认识。
二、内容
(-)温度对酶活力的影响
1.原理:
酶的催化作用受温度的影响,在最适温度下,酶的反应速度最快。
大多数动物酶的最适温度为37~40℃,植物酶的最适温度为50~60℃。
酶对温度的稳定性与酶的存在形式有关。
有的酶的干燥制剂,虽加热到100℃,其活性并无明显改变,但在100℃溶液中却很快宪全失活。
低温能降低或抑制酶的活性,但不能使酶失活。
2.器材
〈1〉试管及试管架
〈2〉恒温水浴
〈3〉冰浴
〈4〉沸水浴
3.试剂
〈1〉0.2%淀粉的0.3%氯化钠溶液:
现配现用
〈2〉稀释200倍的唾液
用蒸馏水漱口,以清涂食物残渣,再含一口蒸馏水,半分种后使其流入量筒并稀释200倍,混匀备用。
〈3〉碘化钾-碘溶液
20g碘化钾和10g碘溶于100ml水中,用前稀释10倍。
4.操作方法
淀粉和可溶性淀粉遇碘呈蓝色。
糊精按其分子的大小,遇碘可呈蓝色、紫色、暗褐色或红色。
最简单的糊精遇碘不呈颜色,麦芽糖遇碘也不呈颜色。
在不同温度下,淀粉被唾液淀粉酶水解的程度,可由水解混合物遇碘呈现的颜色来判断。
取3支试管编号,分别加入1ml淀粉溶液,1、2号管中各加入稀释唾液1ml,3号管中为煮沸过的唾液1ml摇匀。
将1、3号两试管放入37℃恒温水浴,2号管放入冰水中,10min后取出,将2号管内液体分为两份,用碘化钾-碘溶液来检验1、2、3管内淀粉被唾液淀粉酶水解的程度,记录并解释所得结果。
将2号管剩余的一半溶液放入37℃水浴中继续保温10min后,用碘液检验,记录结果。
(二)pH对酶活性的影响
1.原理
酶的活力受环境pH的影响极为显著。
不同酶的最适pH值不同。
如唾液淀粉酶的最适pH约为6.8。
但酶的最适pH受底物和缓冲液性质的影响。
〈2〉移液管
〈3)滴管
〈4〉锥形瓶
〈5〉恒温水浴
〈1〉新配制的溶于0.3%NaCl的0.5%淀粉溶液
〈2〉稀释200倍的新鲜唾液
〈3〉溶液
〈4〉柠檬酸溶液
〈5〉碘化钾-碘溶液
〈6〉pH试纸
pH分别为5.0、5.8、6.8、8.0四种
4.操作
锥形瓶号码
0.2mol/LNa2HPO4
(ml)
0.1mol/L柠檬酸
(ml)
pH
1
5.15
4.85
5.0
2
6.05
3.95
5.8
3
7.72
2.28
6.8
4
9.72
0.28
8.0
取4个锥形瓶编号,按表吸取试剂,配成pH5.0~8.0的四种缓冲溶液。
从四个锥形瓶中各取缓冲液3ml,分别注入4支编号拭管,随后每管加入0.5%淀粉溶液2ml和稀释200倍的唾液2ml,向各试管加人稀释唾液时间间隔为1min,将各试管内容物混匀,并依次置于37℃。
水浴中保温。
第4管加入唾液2min后,每隔1min从第3管中取出1滴混合液,置于白瓷板上,加一小滴碘化钾-碘溶液检验淀粉水解的程度。
待混合液变成棕黄色时,向所有试管依次添加1~2滴碘化钾-碘溶液。
添加溶液的时间间隔,从第一管起也为1min。
观察各试管内容物呈现的颜色,分析pH对唾液淀粉酶活性的影响。
(三)唾液淀粉酶的激活和抑制
1.原理:
酶的活性受某些物质的影响,能使酶活性增加的物质称酶的激活剂,使酶活性降低的物质称酶的抑制剂,如氯离子是唾液淀粉酶的激活剂,铜离子是其抑制剂。
2.器材:
〈1〉恒温水浴
〈2〉试管及试管架
3.试剂
〈1〉0.1%淀粉溶液
〈2〉稀释200倍新鲜唾液
〈3〉l%NaCl溶液
〈4〉l%CuSO4溶液
〈5〉l%Na2SO4溶液
〈6〉碘化钾-碘溶液
4.操作
取4支试管编号,分别加入0.1%淀粉溶液l.5ml和稀释唾液0.5ml后,第1管加1%CuSO4溶液0.5ml,第2管加1%NaCl溶液0.5ml,第3管加1%Na2SO4溶液0.5ml,第4管加热蒸馏水0.5ml,摇匀,置于37℃水浴保温10min后,分别加人2~3滴碘化钾-碘溶液。
记录结果并解释之,说明第3管的意义。
(四)酶的专一性
1.原理
酶具有高度的专一性。
本试验以唾液淀粉酶和蔗糖酶对淀粉和蔗糖的作用为例,来说明酶的专一性。
淀粉和蔗糖无还原性,唾液淀粉酶水解淀粉生成有还原性的麦芽糖,但不能催化蔗糖的水解,而蔗糖酶催化蔗糖产生还原性葡萄糖和果搪,但不能催化淀粉的水解。
用Benedict试剂检验糖的还原性。
〈2〉沸水浴
〈3〉试管及试管架
3.试剂:
〈1〉2%蔗糖溶液
〈3〉新配制溶于0.3%NaCl的1%淀粉溶液
〈4〉蔗糖酶溶液
将啤酒厂的鲜酵母用水洗涤2~3次(离心法)后,3置于滤纸上自然干燥。
取干酵母100g放于研钵中,加适量蒸馏水和少量细沙,用力研磨,提取约1h,再加蒸馏水使总体积达原体积10倍,离心,上清夜保存于冰箱备用。
〈5〉Benedict试剂
无水硫酸铜1.74g溶于100ml热水中,冷却后稀释至150ml。
取柠檬酸钠173g,无水碳酸钠100g和600ml水共热,溶解后冷却并加水至850ml,再将冷却的150ml硫酸铜溶液倾入。
本试剂可长期保存。
4.操作:
〈1〉淀粉酶的专一性
管号
5
6
0.1%淀粉溶液
/
2%蔗糖溶液
稀释唾液
煮沸过的稀释唾唾液(ml)
蒸馏水(ml)
取6支试管编号,按上表加入试剂后,置于37℃水浴15min,各加人Benedict试剂1ml,沸水浴中2~3min后,观察现象并解释之。
〈2)蔗糖酶的专一性
取6支试管编号,测定方法与测定淀粉酶专一性基本相同,只是将所加试剂改为蔗糖酶溶液,煮沸过的稀释唾液改为煮沸过的蔗糖酶溶液,在37℃水浴中时间为15min减少为5min,其余均相同,记录结果并解释之。
实验八维生素C的定量测定
1.学习定量测定维生素的原理和方法。
2.进一步掌握滴定法的基本操作技术。
维生素C是人营养中最重要的维生素之一,缺乏会引起坏血病,因此又称为抗坏血酸。
维生素C为水溶性维生素,具有很强的还原性。
在碱性溶液中加热并有氧化剂存在时,抗坏血酸易被氧化而破坏。
在中性或酸性环境中,能将染料2,6-二氯靛酚还原成无色的还原型2,6-二氯靛酚,同时抗坏血酸被氧化成脱氢抗坏血酸。
2,6-二氯靛酚在酸性溶液中呈红色,在中性或碱性溶液中呈蓝色,因此可在酸性条件下用其滴定样品还原型抗坏血酸,溶液A无色转变为微红时即为滴定终点。
根据染料的滴定可折算出样品中抗坏血酸的含量。
l.松针、新鲜蔬菜和新鲜水果
2.台式天平
3.移液管
4.研钵
5.漏斗
6.锥形瓶
7.容量瓶
8.微量滴定管
1.2%草酸溶液
2g草酸溶于100ml蒸馏水。
2.1%草酸溶液
lg草酸溶于l00ml蒸馏水。
3.标准抗坏血酸溶液
准确称取50.0mg纯抗坏血酸溶于1%草酸溶液并稀释至500ml。
贮于棕色瓶,冷藏,最好现用现配。
4.1%HCl溶液
5.0.1%的2,6-二氯靛酚溶液
溶500mg2,6-二氯靛酚于300ml含有104mgNaHCO3的热水中,冷却后加水稀释至500ml,滤去不溶物,贮于棕色瓶内冷藏(4℃下约可保存1周)。
临用时以标准抗坏血酸溶液标定。
1.制备样品液
〈1〉松针:
水洗净,滤纸吸去表面水分。
称0.5g于研钵中,1%HCl溶液5ml一起研磨,.放置片刻后,提取液移入5ml容量瓶,残渣再加1%HCl溶液5ml研磨,如此反复2~3次,最后用1%HCl溶液稀释至刻度,静置10min后过滤,滤液备用。
〈2〉新鲜蔬菜和和水果
水洗净,用纱布或吸水纸吸干水分,称取20g置于组织搅碎机中,加2%草酸溶液100ml打成浆状。
称取浆状物5.0g于容量瓶中,加2%草酸定容至50ml,静置10min后过滤,滤液备用。
2.滴定:
〈1〉滴定T值:
准确吸取标准抗坏血酸溶液1.0ml于锥形瓶中加9ml草酸,以0.1%2,6-二氯靛酚溶液滴定至淡红色,并保持15秒钟为终点,有所用染料体积计算出1ml染料相当于多少mg抗坏血酸,即得T值。
〈2〉样品测定
准确吸取样品液两份于锥形瓶中,每份10.0rnl,滴定方法同前。
记录滴定所耗2,6一二氯靛酚溶液ml数(v),并按下式计算样品抗坏血酸含量。
抗坏血酸(mg/100g)
式中W-------10ml样液相当于含样品之g数
实验九脂肪骏的β-氧化
了解脂肪酸β-氧化作用及滴定方法。
在肝脏中,脂肪酸经β-氧化作用生成乙酰辅酶。
两分子乙酰辅酶A缩合生成乙酰乙酸。
乙酰乙酸可脱羧生成丙酮,也可还原生成β-羟丁酸、乙酰乙酸、β-羟丁酸和丙酮总称为酮体,其为机体代谢的中间产物,正常情况下,含量甚微。
本实验用新鲜肌糜与丁酸保温,生成的丙酮在碱性条件下,与碘生成碘仿。
剩余的碘,可用标准的硫代硫酸钠滴定。
反应式为:
根据滴定样品与滴定对照所消耗的硫代硫酸钠溶液体积之差,可以计算由丁酸氧化生成丙酮的量。
1.家兔
2.恒温水浴
4.剪刀和镊子
5.锥形瓶
6.漏斗
7.试管及试管架
9.研钵
1.0.1%淀粉溶液
2.0.9%HaOH溶液
3.0.5N/L丁酸溶液
吸取5ml丁酸于100ml0.5N/LNaOH溶液中,混匀。
4.15%三氨乙酸溶液
5.10%NaOH溶液
6.1o%HCl溶液
7.正丁酸
8.0.1N/L碘溶液
称12.7g碘和约25g碘化钾溶于水中,定容至1000ml,混匀后,用标准0.lN/LNa2S2O3溶液标定。
9.标准0.02N/LNa2S2O3溶液
临用时将已标定的1N/LNa2S2O3稀释即可。
1.制备肝糜:
家兔颈部放血处死,取出肝脏。
用0.9%NaCl溶液洗去污血,滤纸吸去表面水分。
称取5g置研钵中,加少量0.9%NaCl溶液,研磨成细浆。
再加0.9%NaCl溶液至总体积10m1。
2.酮体的生成:
取2个锥形瓶,各加3ml1/15mol/LpH7.6磷酸盐缓冲液。
向一个锥形瓶中加人2ml正丁酸;
另一个锥形瓶不加正丁酸,作为对照。
然后各加入2ml肝糜,混匀置43℃恒温水浴保温⒈5小时。
3.沉淀蛋白质:
从水浴中取出锥形瓶,各加3ml15%三氯乙酸溶液,在对照瓶中追加2ml正丁聆酸,混匀,净置15min后过滤,滤液分别收集在两支试管中。
4.酮体的测定:
吸取两种滤液各2ml分别放入另外两个锥形瓶中,再备加3ml0.1N/L碘溶液和3ml10%NaOH
溶液,摇匀后静置10min。
加人3ml10%HCL溶液中和。
然后用0.02N/L标准硫代硫酸钠溶液滴定剩余碘。
滴定浅黄色时,加入3滴淀粉溶液作指示刑。
摇匀,继续滴到蓝色消失。
记录滴定样品与对照所用的Na2S2O3溶液的ml数,并按下式计算丙酮的含量:
实验十自主设计实验
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