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牛肉膏蛋白胨培养基。
⑵半合成培养基:
既有天然物质又含化学试剂的培养基称半合成培养基。
如马铃薯蔗糖培养基。
⑶合成培养基:
采用多种化学试剂配制的,各种成分及其用量都确切知道的培养基。
如高氏一号培养基。
根据培养基制成后的物理状态可分为:
⑴液体培养基:
呈液体状态的培养基。
⑵固体培养基:
外观呈固体状态的培养基。
⑶半固体培养基:
将各种营养成份按比例配制成营养液后,加入适量固化剂,处于半固体状态的培养基。
根据培养基的功能和用途可分为:
⑴基础培养基:
含有多数有机营养型细菌所需养分。
⑵加富培养基:
加入有利于某类微生物生长繁殖所需的营养物质,使其增值速度快于其他微生物。
⑶选择培养基:
加入某些物质或除去某些营养物质以阻抑其他微生物生长,从而有利于某一类群或某一目标微生物生长。
⑷鉴别培养基:
用来检查微生物的某些代谢特性。
(二)干、湿热灭菌
干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。
细胞内的蛋白质凝固性与其本身的含水量有关,在菌体受热时,当环境和细胞内含水量越大,则蛋白质凝固就越快,反之含水量越小,凝固缓慢。
高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内,通过加热,使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽。
从而使沸点增高,得到高于100℃的温度。
导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。
三.材料仪器
1.药品:
马铃薯200克葡萄糖20克 琼脂15-20克水1000毫升
自然pH
2.器材:
天平、药匙、瓷缸、玻璃棒、电炉、pH试纸、试管、三角瓶、分装漏斗、牛皮纸、棉花、线绳、高压锅。
四.实验内容及方法
(一)培养基的配制
1.称量:
称取200g马铃薯,洗净去皮切成小块,加水煮烂(煮沸20-30分钟,能被玻璃棒戳破即可),用四层纱布过滤
2.溶解:
,按照培养基配方加葡萄糖和琼脂,继续加热搅拌混匀,稍冷却后再补足水分至1000毫升。
如是配制固体培养基,在琼脂的熔化过程中,需不断搅拌,并控制火力不要使培养基溢出或烧焦。
待完全熔化后,补足所失水分。
3.调节pH值:
用玻璃棒沾少许液体,测量pH值。
本实验可略去。
4.过滤:
用滤纸或多层纱布过滤,一般无特殊要求可省去。
5.分装及包扎:
根据不同的需要,可将制好的培养基分装入试管内(用分装漏斗)或三角瓶内,管(瓶)口塞上棉塞。
最后用牛皮纸将棉塞部分包好。
6.灭菌:
高压蒸汽灭菌,121℃灭菌20分钟。
7.灭菌后试管摆放斜面
(二)种子的制备
从4℃冰箱中取出菌种斜面,用接种环接种至PDA斜面培养基上,每人1根,30℃培养48h后备用。
五、作业
1.在配制培养基的操作过程中应注意些什么问题?
为什么?
2.高压蒸气灭菌开始之前,为什么要将锅内冷空气排尽?
灭菌完毕后,为什么待压力降低为“0”时才能打开排气阀,开盖取物?
实验二产色素菌株的生长曲线测定
一、目的要求
了解实验菌株的生长曲线的基本特征,从而认识微生物在一定条件下生长、繁殖的规律。
二、基本原理
一定量的微生物,接种在适合的新鲜液体培养基中,在适宜的温度下培养,以菌数的对数作纵坐标,生长时间作横坐标,做出的曲线叫生长曲线。
一般可分为延迟期、对数期、稳定期和衰亡期四个时期。
不同的微生物有不同的生长曲线,同一种微生物在不同的培养条件下,其生长曲线也不一样。
因此,测定微生物的生长曲线对于了解和掌握微生物的生长规律是很有帮助的。
测定微生物生长曲线的方法很多,有血球计数法、平板菌落计数法、称重法、比浊法等。
本实验采用比浊法测定,由于细菌悬液的浓度与混浊度成正比,因此,可利用光电比色计测定菌悬液的光密度来推知菌液的浓度,并将所测得的光密度值(OD值)与其对应的培养时间作图,即可绘出该菌在一定条件下的生长曲线。
现已有直接用试管就可以测定OD值的光电比色计(图Ⅶ-10),只要接种一支试管,定期用它测定,便可做出该菌的生长曲线。
三、器材
培养48小时的菌株培养液,50ml/250ml的PDA液体培养基11瓶;
分光光度计,培养箱,无菌吸管等。
四、操作步骤
1.编号
取10瓶盛有PDA液体培养基的锥形瓶,用记号笔标明培养时间,即0、12、24、36、48、60小时。
处0为一瓶外,其他各两瓶。
2.接种
按2%的接种量,将菌悬液分别接种到已编号的10个锥形瓶中,1瓶做空白对照,接种后振荡,使菌体混匀。
3.培养
将接种后的10个锥形瓶置于恒温培养箱内上,30℃培养。
分别在0、12、24、36、48、60小时将编号为对应时间的锥形瓶取出,立即放冰箱中贮存,最后一同比浊测定光密度值。
4.比浊测定
以0号瓶为空白对照,选用590nm波长进行光电比浊测定。
从最稀浓度的菌悬液开始依次进行测定,对浓度大的菌悬液用未接种的PDA液体培养基适当稀释后测定,使其光密度值在0.1—2.0以内,记录OD值时,注意乘上所稀释的倍数。
五、实验报告
1.结果
(1)将测定的OD值填入下表。
培养时间
(h)
12
24
36
48
60
OD590
(2)绘制菌株的生长曲线
2.思考题
(1)为什么说用比浊法测定的细菌生长只是表示细菌的相对生长状况?
(2)在生长曲线中为什么会出现稳定期和衰亡期?
在生产实践中怎样缩短延迟期?
怎样延长对数期及稳定期?
怎样控制衰亡期?
试举例说明。
实验三液体发酵——最适碳源的筛选
1.掌握液体发酵的方法。
2.了解如何进行发酵条件优化。
二、材料
1.菌种:
产蓝色素菌种由发酵工程实验室提供
2.培养基:
PDA
三、试验设计
取活化后的PDA斜面菌种接入装有100mL已灭菌的PDA液体培养基中,培养48h作为液体种子。
碳源筛选以葡萄糖、玉米粉、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉取代PDA培养基中的葡萄糖,按50ml/250ml装液量,接种量为5%,经30℃液体培养48h后,测OD590。
每种糖三瓶。
四、实验结果
1.结果
碳源种类
葡萄糖
玉米粉
蔗糖
乳糖
可溶性淀粉
(2)绘制不同碳源利用柱形图,并做误差分析。
2.结论
实验四代谢产物的提取
1.掌握各种破壁方法。
2.了解产物的浓缩方法。
1.发酵液:
实验三提供
2.试剂:
无水乙醇、溶菌酶、乙酸
3.仪器:
离心机、冰箱、50ml小烧杯、10ml容量瓶、研钵、250ml容量瓶、旋转蒸发仪
三、实验过程
1.色素提取方法
1.1冻融破壁法:
取10mL发酵液,4000×
g离心10min,弃上清,菌体加入10mL无水乙醇,-20℃冰箱放置30min,再50℃剧烈搅拌20min;
4000rpm离心15min,取上清,然后定容至10mL,于波长570nm下测OD600值。
1.2超声波破壁法:
取10mL发酵液,4000×
g离心得菌体,加入10mL无水乙醇,用漩涡混合器将其混匀,然后在200W超声波清洗器中振荡30min。
离心,取上清,然后定容至10mL,于波长560nm下测OD值。
1.3研磨法:
g离心10min,得菌体。
将菌体置于冷冻干燥至恒重。
加一定量的石英砂在研钵中研磨成细粉状。
加入10mL无水乙醇,离心取上清,然后定容至10mL,于波长570nm下测OD值。
1.4溶菌酶法:
加入100ug/ml的溶菌酶乙醇溶液,570nm下测OD值。
1.5色素提取
将50ml发酵液在4000g下离心10min,弃上清液,在沉淀物中加入乙酸5ml,用旋涡混合器将其混匀,然后在200W超声波清洗器中振荡0.5h,将振荡液在4000g下离心15min,得到色素溶液。
若仍有色素残留在细胞残渣中,可重复上述操作步骤,直至不再能提取出色素为止。
将所得到的乙醇溶液用旋转蒸发仪真空干燥,即得到蓝色素的粗提物。
(1)将不同破壁方法后测定的OD值填入下表。
破壁方法
冻融破壁法
超声波破壁法
研磨法
溶菌酶法
2.对初提物进行描述。
实验五产物结构的鉴定
1.掌握薄层层析法。
2.了解HPLC。
薄层层析是一种微量而快速的层析方法。
最早是Izmailov和Schraiber在1938年采用氧化铝薄层分离了植物提取液。
层析是在吸附剂或支持剂均匀涂布的薄层上进行的,故称薄层层析。
为了使所要分析的样品各组分得到分离,必须选择合适的吸附剂。
硅胶、氧化铝和聚酰胺是广泛采用的吸附剂,硅藻土和纤维素是分配层析中最常用的支持剂,在吸附刘或支持剂中添加了适合的粘合剂再涂布,可使薄层粘牢在玻璃板(或涤纶片基)这类基底上。
硅胶G是一种添加了粘合剂的硅胶粉,约含12%-13%的石膏(CaSO4),它可以把一些物质从溶液中吸附于自身的表面上,利用它对各种物质的吸附能力不同,再用适当的溶剂系统展层使不同的物质得以分离。
薄层层析一般采用上行法,在具有密闭盖子的玻璃缸中进行,溶剂倒于缸底,简单地将薄板放入即可。
保证层析缸内有饱和的蒸气是实验成功的关键。
保证措施是在层析缸内壁衬一层浸湿溶剂的滤纸或缩小层析缸的容积。
因为层析时,溶剂会从薄层上蒸发,样品移动到一定距离的时间就会处长。
若所用溶剂系统由几个成分组成,挥发性较大的成分首先蒸发,就会使混合溶剂的组分改变,而溶剂的蒸发从薄板的中央向两边递减,致使溶剂前沿呈弯曲状,结果往往是使两边的Rf值大于中央位置的Rf值。
薄层层析与其它方法比有明显的优点:
层析时间短,可以分离多种化合物,用样品量少(微克级),与纸层析相比要灵敏10-100倍,观察结果方便,显色方法甚至可以用腐蚀性显色剂。
三、材料
1.初提产物:
实验四提供
氯仿、甲醇、50×
100G型硅胶板、HPLC级甲醇
离心机、冰箱、50ml小烧杯、10ml容量瓶、层析缸、HPLC
四、实验过程
1.制备硅胶G(省略,直接采用50×
100G型硅胶板(青岛海洋化工厂))
取硅胶G粉30g加75毫升0.1mol/L硼酸溶液,调匀后铺于洁净平整的玻板上,铺层后的薄板于100oC烘箱中烘干。
取出后可用,亦可贮于干燥器中备用。
薄层表面要求平整,厚薄均匀。
2.在硅胶G薄层上的分离
(1)活化:
将硅胶板在105oC烘箱30min,然后放入干燥器里。
(2)点样:
选制备好的薄板一块,在距底边1.5cm的直线上选四个点,相互距离2cm。
用毛细管或微量加样器,分别加样20µ
ɡ,斑点直径不超过2mm。
待薄层上样品自然干燥后,将薄板置于盛有层析溶剂的层析缸中。
(3)展开:
展开剂为氯仿:
甲醇=15:
1,自下向上展层,当展层溶剂到达离薄板项端约2cm处时取出薄板,前沿作一记号。
紫外下显示斑点。
(4)计算Rf值。
3.高效液相色谱(选做)
使用Agilent-1100高效液相色谱仪,色谱柱为AgilentEclipseXDB-C18,150mm×
4mm,5μm。
柱温:
30℃;
洗脱剂:
甲醇:
水(70:
30);
流速:
1.0mL/min;
检测波长:
570nm
五、实验结果
作出薄层层析图和HPLC图。
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