TRIzol法提RNADNA和蛋白质Word格式文档下载.docx

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亏染注意事项：

1.经常更换新手套，皮肤上常带有的细菌，霉菌可能成为RNase的来源。

2.使用灭过菌的RNA专用塑料制品避免交*污染。

3.RNA在TRIzol试剂中时不会被RNase污染，但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。

玻璃器皿可在150C烘烤4小时，塑料制品可在0.5MNaOH中浸泡10分钟，然后用水彻底清洗，高压灭菌，即可去除RNase。

4.配制溶液应使用无RNase的水（将水加入处理过不含RNase的玻璃瓶中，加入DEPC至终浓度0.01%v/v,放置过夜，高压灭菌。

注：

DEPOT致癌之嫌，需小心操作。

）

RNA勺提取

准备试剂：

氯仿，异丙醇，75%乙醇，无RNase的水或0.5%SDS溶液均需用DEPC处理过的水配制）

操作步骤:

1.匀浆处理:

a.组织将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1mlTRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。

样品体积不应超过TRIzol体积10%。

b.单层培养细胞直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞，每10cm2面积（即3.5cm直径的培养板）加1ml,用移液器吸打几次。

TRIzol的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数。

TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA亏染。

c.细胞悬液离心收集细胞，每5-10X106动物、植物、酵母细胞或

1X107细菌细胞加入1mlTRIzol，反复吸打。

加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRN降解。

一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。

2.将匀浆样品在室温（15-30C）放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。

3.可选步骤：

如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌

肉，植物结节部分等）可于2-8C10000Xg离心10分钟，取上清。

离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量DNA上清中含有

RNA处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除。

取澄清的匀浆液进行下一步操作。

5.每使用1mlTRIzol加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置

3分钟。

6.2-8C10000Xg离心15分钟。

样品分为三层：

底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。

RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60%。

7.把水相转移到新管中，如要分离DNA和蛋白质可保留有机相，进

一步操作见后。

用异丙醇沉淀水相中的RNA每使用1mlTRIzol加

入0.5ml异丙醇，室温放置10分钟。

8.2-8C10000Xg离心10分钟，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。

移去上清。

9.用75%乙醇洗涤RNA沉淀。

每使用1mlTRIzol至少加1ml75%乙醇。

2-8C不超过7500Xg离心5分钟，弃上清。

10.室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀，大约晾5-10分钟即可.不要真空离心干燥，过于干燥会导致RNA勺溶解性大大降低。

加入25-200卩I无RNase勺水或0.5%SDS用枪头吸打几次,55-60C放置10分钟使RNA溶解.如RNA用于酶切反应，勿使用SDS溶液。

RNA也可用100%的去离子甲酰胺溶解，-70C保存。

注意事项：

1.从少量样品（1-10mg组织或102-104细胞）中提取RNA0寸可加入少许糖原以促进RNA沉淀。

例如加800mlTRIzoI匀浆样品，沉淀RNA前加5-10卩gRNase-free糖原。

糖原会与RNA一同沉淀出来，糖原浓度不高于4mg/ml是不影响第一链的合成，也不影响PCF反应。

2.匀浆后加氯仿之前样品可以在-60至-70C保存至少一个月。

RNA沉淀可以保存于75%酒精中2-8C一星期以上或-5至-20C一年以上。

3.分层和RNA沉淀时也可使用台式离心机，2600Xg离心30-60分钟。

预期产量：

1mg组织或1X106细胞提取RNA分别为：

肝和脾6-10卩g,肾3-4卩g,骨骼肌和脑组织1-1.5卩g,胎盘1-4

卩g,上皮细胞8-15卩g,成纤维细胞5-7卩g。

常见问题分析：

得率低：

A.样品裂解或匀浆处理不彻底

B.RNA沉淀未完全溶解

A260/A280V1.65:

A.检测吸光度时，RNA样品没有溶于水，而溶于

了TE中。

低离子浓度和低pH值条件下A280值偏高

B.样品匀浆时加的试剂量太少

C.匀浆样品时未在室温放置5分钟

D.吸取水相时混入了有机相

E.RNA沉淀未完全溶解。

RNA降解：

A.组织取出后没有马上处理或冷冻

B.待提取RNA的样品没有保存于-60至-70C,而保存在了-5至-20C

C.细胞在用胰酶处理时过度

D.溶液或离心管未经RNase去除处理

E.电泳时使用的甲醛pH值低于了3.5

DNA亏染：

A.样品匀浆时加的试剂量太少

B.样品中含有有机溶剂（如乙醇,DMSC等）,强缓冲液或碱性溶液蛋白聚糖和多糖污染：

沉淀RNA的过程中作以下改进可去除这些污染，步骤7中,每使用1mlTRIzol在水相中加0.25ml异丙醇和0.25ml高盐溶液（0.8M柠檬酸钠和1.2MNaCl）混合离心,按之前操作进行。

这种方法可使蛋白聚糖和多糖留在溶液中，高效沉淀出纯RNA从含

有大量多糖的植物中提取RNA寸应在匀浆后离心，并加上以上操作步骤。

DNA勺分离

乙醇0.1M柠檬酸钠（含10%乙醇）75%乙醇8mMNaOH操作步骤：

1.样品加氯仿分层后,移去上层水相,用乙醇沉淀中间层和有机相中

的DNA每使用1mlTRIzol加0.3ml无水乙醇混匀，室温放置3分

钟，2-8C不超过2000Xg离心5分钟。

2.移去上清，（如需分离蛋白质，可保留，进一步操作见后）用含

10沱醇的0.1M柠檬酸钠洗涤DNA沉淀。

每用1mlTRIzol加入1ml

柠檬酸钠，室温放置30分钟，2-8C2000Xg离心5分钟，弃上清，重复一次。

3.用75%乙醇再洗一遍DNA沉淀，每用1mlTRIzol加入1.5-2ml75%

乙醇，室温放置10-20分钟（不时颠倒混合）2-8C2000Xg离心5分钟，弃上清。

4.室温放置晾干DNA5-15分钟，用8mMNaOH溶解DNA从50-70mg组织或107细胞中分离的DNA溶于300-600卩l8mMNaOHDNA的浓度通常为0.2-0.3卩g/卩l。

提取的DNA沉淀不易溶于水和Tris缓冲液中，建议用弱碱溶解，8mMNaO的pH值为9,溶解DNA后可用TE,HEPE碉节pH从某些样品（尤其是组织）中提取的DNA中可能包含一些胶状不溶物可＞12000Xg离心10分钟除去。

DNA勺定量：

取一份溶于8mMNaOH勺DNA加水测A260值。

一单位A260

值相当于50卩g/ml双链DNA根据DNA产量可估计细胞数，人，大

鼠，小鼠1X106二倍体细胞含DNA勺量分别为7.1卩g,6.5卩g,5.8卩g。

1mg组织或1X106细胞提取DNA分别为肝和肾3-4卩g骨骼肌，脑组织，胎盘2-3卩g人，大鼠，小鼠培养细胞（1X106）5-7

□g成纤维细胞5-7卩g

应用：

1.用于PCR溶于8mMNaOH勺DNA用0.1MHEPE碉pH至8.4,取0.1-1□gDNA用作模板。

2.酶切反应用HEPES或1mMEDTAS节pH至适当值。

每□gDNA使

用3-5单位的酶，80-90%的DNA是可消化的。

1ml8mMNaOH溶解的DNA样品pH值调节

FinalpH0.1MHEPES（□l）FinalpH1MHEPES（□l）

8.4867.223

8.2937.032

8.0101

7.8117

7.5159

1.DNA在中间层和有机相中时可在2-8C保存过夜。

2.DNA沉淀在75%乙醇中2-8C可保存几个月。

3.DNA在8mMNaO溶液中4C可放置过夜，如长期保存需用HEPES调节pH至7-8并且加EDTA至1mM可置于4C或-20C长期保存。

A.样品匀浆和裂解的不彻底

B.最终得到的DNA沉淀没有完全溶解

A260/A280V1.70:

了TE中

B.酚除去的不彻底，可用0.1M柠檬酸钠（含10沱醇）再洗一遍DNA沉淀。

DNA降解：

C.样品匀浆时使用了高速匀浆仪

RNA亏染：

A.氯仿分层后水相去除的不干净

B.DNA沉淀用0.1M柠檬酸钠（含10沱醇）洗的不彻底

蛋白质的提取

异丙醇含0.3M盐酸胍的95%乙醇无水乙醇1%SDS操作步骤：

1.取沉淀DNAB剩余的上清，用异丙醇沉淀蛋白质。

每使用1mlTRIzol加1.5ml异丙醇，室温放置10分钟，2-8C12000Xg离心10分钟弃上清。

2.用含0.3M盐酸胍的95临醇洗涤蛋白质沉淀。

每使用1mlTRIzol加2ml洗涤液，室温放置20分钟，2-8C7500Xg离心5分钟，弃上清，重复两次。

用2ml无水乙醇同样方法再洗一次。

3.真空抽干蛋白质沉淀5-10分钟，用1%SD溶解蛋白质，反复吸打，50C温浴使其完全溶解，不溶物2-8C10000Xg离心10分钟除去。

分离得到的蛋白质样品可用于WesternBlot或-5至-20C保存备用。

注意事项：

1.蛋白质沉淀可保存在含0.3M盐酸胍的95%L醇或无水乙醇中2-8C一个月以上或-5至-20C一年以上。

2.用0.1%SDS在2-8C透析三次，10000Xg离心10分钟取上清即可用于WesternBlot。

B.最后得到的蛋白质沉淀未完全溶解蛋白质降解：

组织取出后没有马上处理或冷冻电泳时条带变形：

蛋白质沉淀洗涤不充分

Trizol

Trizol试剂是可即用的从动物、植物细胞和组织或微生物中提取总

RNA的试剂。

在样品裂解或匀浆过程中，Trizol可溶解细胞内含物，同时具有使蛋白变性、抑制RNase活性的作用，保持RNA的完整性。

可以从富含多糖、脂肪酸、蛋白质及RNase的样品中获得完整的RNA.经过Trizol试剂处理后的裂解物，仅仅只需加入氯仿混匀，离心后，便分为三种液相：

上层水相含有RNA中层的半固体相含有DNA下层的有机相含有少量的DNA和大量的蛋白质、多糖、脂肪酸和其它细胞碎片。

取出水相，用异丙醇可沉淀回收RNA,一般所得RNA溶于DEPC水后的A260/280值为1.6-1.8。

Trizol试剂可用于小量样品（50-100mg组织、5X106细胞），也可用于大量样品（>

1g组织或>

107细胞），对人、其它动物、植物和细菌组织都适用，整个操作步骤方便快捷，一个小时内即可完成反应，可同时处理大量不同样品。

提取的总RNA没有DNA和蛋白的污染，可用于RT-PCRNorthernBlot、核酸酶保护实验、mRNA分离和体外翻译等。

包装清单：

Trizol50ml或者100ml说明书1份

保存条件：

2-8C保存，本试剂自订购之日起一年内有效。

注意事项:

1.所有离心管、枪头及相关溶液都必需无RNA酶污染。

耐高温器物可150C烘烤4小时以除去RNA酶，其它器物除RNA酶可考虑用0.01%的DEPC水浸泡过夜，然后灭菌、烘干。

溶液需用灭菌的DEPCK配制：

加0.01%（体积比）DEPC至MiliQ级水中，处理过夜，灭菌即成DEPC水。

2.必需戴一次性手套操作，且尽量不要对着RNA羊品呼气或说话，以防RNA酶污染。

3.Trizol含有毒物质苯酚，避免接触皮肤或吸入。

为防止溅入眼睛，请戴防护眼镜或使用透明保护屏。

如皮肤接触Trizol，请立即用大量去垢剂和水冲洗，如仍有不适，请听取医生意见。

4.需自备氯仿，异丙醇，75%L醇（DEPC水配制），和DEPC水。

使用说明：

1.细胞裂解或组织匀浆。

a.贴壁细胞：

吸尽培养液，按照每10平方厘米细胞加入1mlTrizol，晃动3-5下，再用枪吹打2-3下，确保全部裂解，然后吸至离心管中。

b.悬浮细胞：

离心收集细胞，吸尽液体，每五百万至一千万动植物或酵母细胞，或一千万细菌，加入1mlTrizol适当vortex，确保全部裂解。

某些酵母和细菌如裂解不充分，可用匀浆器匀浆，或者用液氮研磨，确保全部裂解。

c.组织：

先将组织剪切成小块，放入普通玻璃匀浆器内，或者用液

氮研磨组织样品。

每50mg-80m昶织加入1mlTrizol，匀浆。

2.室温静置5－15分钟。

对于某些蛋白、多糖或脂含量很高的细胞或组织，Trizol裂解后可能会有不溶物或油脂状漂浮物，需12,000

xg,4C离心10分钟，然后吸取澄清的Trizol裂解产物至一新的离心管中。

3.按照每毫升Trizol加入0.2ml氯仿，vortex混匀或猛烈晃动15秒，室温放置2-3分钟。

5.12,000xg,4C离心15分钟，然后吸取含总RNA的上层水相至

一新的离心管中，每毫升Trizol约可吸取0.5-0.55ml。

6.按每毫升最初的Trizol加入0.5ml异丙醇,颠倒数次混匀,室温沉淀10分钟。

7.12,000Xg4C离心10分钟，在管底可见胶状RNA沉淀，弃上清。

8.每毫升最初的Trizol加入1ml75%乙醇，vortex或颠倒混匀，

9.7,500Xg4C离心5分钟，弃上清。

再用离心机甩一下（＞5,000rpm,离心1秒），小心吸尽液体。

10.待RNA略干后，加入20微升DEPC水溶解，-70C冻存。

注意，

切勿让RNA过分干燥，否则将极难溶解，且测出的A260/280值会低

于1.6。

问题指南

低得率：

A.样品裂解或匀浆处理不彻底；

B.最后得到的RNA沉淀未完全溶解。

A.检测吸光度时，RNA样品不是溶于TE,而是溶于水。

低离子浓度和低pH条件下，A280值会较高；

B.样品匀浆时加的试剂量太少；

C.匀浆后样品未在室温放置5分钟；

D.水相中混有有机相；

E.最后得到的RNA沉淀未完全溶解。

A.组织取出后没有马上处理或冷冻；

B.样品或提取的

RNA沉淀保存于-5--20C,未在-60--70C保存；

C.细胞在胰酶处理时被破坏；

D.溶液或离心管未经RNase去除处理；

E.电泳时使用的甲酰氨pH低于3.5。

DNA污染：

A.样品匀浆时加的试剂体积太少；

B.样品中含有组织溶剂（如乙醇，DMS等），强缓冲液或碱性溶液。

蛋白和多糖污染：

离心去上清后得到的RNA沉淀经以下操作应可去除这些污染：

在上一步中，每使用1mlTrizol，在水相中加0.25ml异丙醇和0.25ml高盐溶液（0.8M柠檬酸钠和1.2NaCI）。

混合，离心，然后按照操作进行。

这种方法可使蛋白多糖和多糖留在溶液中，而高效沉淀出纯RNA从植物中提取RNA时，应在匀浆后离心，并加上以上操作步骤。