非淀粉多糖水解酶活力测定分光光度法国家标准Word下载.docx
- 文档编号:21121355
- 上传时间:2023-01-27
- 格式:DOCX
- 页数:16
- 大小:298.42KB
非淀粉多糖水解酶活力测定分光光度法国家标准Word下载.docx
《非淀粉多糖水解酶活力测定分光光度法国家标准Word下载.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《非淀粉多糖水解酶活力测定分光光度法国家标准Word下载.docx(16页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
(4)原理;
(5)仪器设备及器具;
(6)材料与试剂;
(7)分析步骤;
(8)结果分析等。
(9)附录
1.范围
本标准规定了非淀粉多糖水解酶活力的一种通用测定方法,包括仪器和设备、试剂和材料、试验步骤和结果分析。
本标准适用于纤维素酶、果胶酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶等常见的单一及复合非淀粉多糖水解酶制剂的活性测定。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。
凡是注日期的引用文件,仅所注日期的版本适用于本文件。
凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB5009.7食品中还原糖的测定
GB/T6682分析实验用水规格和试验方法
3.术语和定义
下列术语和定义适用于本标准。
3.1非淀粉多糖non-starchpolysaccharides,NSP
广泛存在于植物细胞壁中,是植物中结构性碳水化合物的统称,由纤维素、半纤维素、果胶类物质以及抗性淀粉组成;
是植物组织中由若干单糖通过糖苷键连接而成的多聚体,包括除淀粉外的所有碳水化合物。
3.2非淀粉多糖水解酶non-starchpolysaccharidehydrolase
能催化纤维素、β-葡聚糖、果胶和木聚糖等非淀粉多糖底物中的糖苷键断裂,产生还原糖的一系列酶类,包括纤维素酶、β-葡聚糖酶、果胶酶、木聚糖酶等单一及其复合酶。
3.3酶活力单位enzymeactivityunit
在一定条件下,每min催化底物释放1μmol还原糖所需要的酶量为1个酶活单位,以U表示。
4.原理
单一及复合的非淀粉多糖水解酶制剂可以水解滤纸,木聚糖、β-葡聚糖和果胶产生还原糖。
还原糖在沸水浴条件下可以将3,5-二硝基水杨酸(DNS)还原成棕红色的氨基化合物(3-氨基-5-硝基水杨酸)。
该化合物在540nm波长下有最大吸收。
在一定范围内,该吸光度与还原糖含量呈一定的线性关系。
而还原糖的生成量又与单一及复合的非淀粉多糖水解酶的活力成正比。
因此,通过分光光度法测定反应液在540nm的吸收强度,可以计算单一及复合的非淀粉多糖水解酶的活力。
5.材料与试剂
5.1酶制剂:
纤维素酶,果胶酶,木聚糖酶和β-葡聚糖酶购置于不同厂家。
5.2底物:
定性滤纸(快速定性滤纸孔径8-15um,直径9cm)、木聚糖(来源于玉米芯)、β-葡聚糖和果胶。
5.3无水葡萄糖。
5.4酒石酸钾钠(C4H4KNaO6·
4H2O),苯酚,亚硫酸钠,氢氧化钠,冰乙酸,三水乙酸钠,甘氨酸,磷酸氢二钠,柠檬酸,考马斯亮蓝G-250,甲醇,乙醇,磷酸。
5.5氢氧化钠溶液(200g/L)
20.0g氢氧化钠,加水溶解,定容至100mL。
5.6乙酸溶液(0.1mol/L)
0.60mL冰乙酸,加水稀释,定容至100mL。
5.7乙酸钠溶液(0.1mol/L)
1.36g三水乙酸钠,加水溶解,定容至100mL。
5.8乙酸-乙酸钠缓冲溶液(0.1mol/L,pH=5.5)
准确称取23.14g三水乙酸钠,加冰乙酸1.70mL。
加水溶解,定容至2000mL。
测定pH。
若偏离5.5,则用0.1mol/L的乙酸溶液(5.6)或0.1mol/L的乙酸钠溶液(5.7)调节pH至5.5。
5.9甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液(pH=9.0,含有0.44mmol/L的CaCl2)
A液:
0.8mol/L甘氨酸溶液(含有0.44mmol/L的CaCl2);
B液:
0.8mol/L氢氧化钠溶液;
将A、B两液混合,配置为pH9.0的缓冲溶液,室温下放置,一周内有效。
5.10不同pH磷酸氢二钠(Na2HPO4)-柠檬酸缓冲溶液的配置
0.2mol/LNa2HPO4溶液的配置:
先称量71.64g十二水合磷酸氢二钠,用超纯水溶解并定容至1L的容量瓶中。
0.1mol/L柠檬酸溶液的配置:
先称量21.01g一水合柠檬酸,用超纯水溶解并定容至1L的容量瓶中。
不同pH缓冲溶液的配置如下表1所示。
室温下放置,一周内有效。
表1.不同pH缓冲溶液的配置
pH
0.2mol/LNa2HPO4(mL)
0.1mol/L柠檬酸(mL)
4.8
9.86
10.14
5.6
11.60
8.40
6.4
13.85
6.15
7.2
17.39
2.61
8.0
19.45
0.55
5.11葡萄糖标准储备液(10mg/mL)
称取烘干至恒重的无水葡萄糖(5.3)1.000g,加水溶解,定容至100mL。
5.123,5-二硝基水杨酸试剂(DNS试剂)
准确称取3,5-二硝基水杨酸3.15g,加水500mL搅拌溶解,水浴至45℃,然后逐渐加入氢氧化钠溶液(5.5)100mL,边加边搅拌,直至完全溶解(温度不要超过48℃),再逐步加入酒石酸钾钠91.0g,苯酚2.50g和亚硫酸钠2.50g,搅拌至溶解,冷却至室温后,定容至1000ml。
过滤,将滤液储存在棕色瓶中,避光保存。
室温下存放7天后方可使用,有效期为6个月。
警告:
处理酸碱和配制DNS试剂时,应在通风橱或通风良好的房间进行,戴上保护眼镜和乳胶手套,一旦皮肤或眼睛接触了上述物质,及时用大量的水冲洗。
5.13染色液
考马斯亮蓝G-2500.1g(精确至0.01g)、乙醇50mL、85%(m/v)磷酸25mL,用水定容至1000mL,保存备用。
5.14脱色液
取100mL冰乙酸、100mL甲醇,用水定容至1L,室温保存。
5.155×
蛋白加样缓冲液
250mmol/LTris-HCl(pH6.8),10%SDS,0.5%溴酚蓝,50%甘油,7.5%DTT
5.16蛋白预染marker。
6.仪器设备及器具
6.1分析天平:
精度0.001g。
6.2pH计:
精确至0.01。
6.3磁力搅拌器:
附带加热功能。
6.4电磁振荡器。
6.5离心机:
最小转速不小于1000×
g。
6.6恒温水浴锅:
温度控制范围在20℃~100℃之间,精度为0.1℃。
6.7秒表。
6.8分光光度计。
6.9移液枪:
精度为1μL。
6.10定性滤纸(1.0cm×
6.0cm)。
7.分析步骤
7.1绘制标准曲线
7.1.1分别吸取葡萄糖标准储备液(5.11)0.00、0.20、0.40、0.80、1.00、1.20、1.60、2.00mL于10mL容量瓶中,用水定容至10.0mL,配置成浓度为0.00mg/mL~2.00mg/mL的葡萄糖标准系列。
7.1.2分别吸取葡萄糖标准溶液(7.1.1)各1.0mL于25mL具塞玻璃试管中,加超纯水2.0mL和DNS试剂(5.12)2.0mL于各管中(每管3个平行),混匀。
将标准管同时置于沸水浴中,反应5min,流水冷却,蒸馏水定容至25.0mL,混匀。
测量540nm处吸光度。
以葡萄糖质量为横坐标,以吸光度为纵坐标,绘制标准曲线,获得线性回归方程。
7.2制备与鉴定酶制剂溶液
7.2.1制备酶制剂溶液
采用6种不同来源的纤维素酶,果胶酶,木聚糖酶和β-葡聚糖酶摸索并建立非淀粉多糖水解酶酶活测定的统一方法。
固体样品:
按附录A表A.1中的建议称取适量酶制剂试样(不同来源的纤维素酶,木聚糖酶和β-葡聚糖酶),精确至0.001g。
加40.0mL乙酸-乙酸钠缓冲溶液(5.8),低温磁力搅拌30min,再用缓冲溶液(5.8)补充至100.0mL,在4℃下避光保存1h。
混匀后,1000×
g,4℃,离心3~5min。
取上清,再用缓冲溶液(5.8)做二次稀释(稀释后的待测酶液酶活应控制在0.04U/mL~0.1U/mL),并用乙酸(5.5)或乙酸钠溶液(5.6)调节pH为5.5。
液体样品:
直接用乙酸-乙酸钠缓冲溶液(5.7)按标识酶活力进行适当稀释,使稀释后酶活控制在0.04U/mL~0.1U/mL,并用乙酸(5.5)或乙酸钠溶液(5.6)调节pH为5.5。
果胶酶:
称取1~2g,精确到0.001g,先用少量的甘氨酸缓冲溶液(5.9)溶解,并用磁力搅拌器搅拌,直至固体完全溶解(约10min~15min),将上清液小心倾入容量瓶中,沉淀部分再加入少量缓冲溶液(5.9),搅拌溶解,如此反复2~3次,最后全部一如容量瓶中,用缓冲溶液(5.9)定容至100mL,摇匀,1000×
取上清,再用缓冲溶液(5.9)做二次稀释(稀释后的待测酶液酶活应控制在0.04U/mL~0.1U/mL),并用乙酸(5.5)或乙酸钠溶液(5.6)调节pH为5.5。
7.2.2测定酶制剂溶液中蛋白质含量
蛋白浓度用分光光度计测定,分别测定酶制剂溶液(7.2.1)在280nm和260nm吸光度值。
7.2.3鉴定酶制剂纯度
采用SDS-PAGE分别鉴定酶制剂溶液(7.2.1)的纯度。
小心拔掉8-20%Precast-GLgelTris-Glycine预制胶的梳子,正确安装电泳装置。
取适量酶制剂溶液加入5×
蛋白加样缓冲液(5.15),煮沸变性5min。
在加样孔内一次加入酶制剂溶液样品,并在两端泳道加入蛋白预染marker(5.16)。
电泳条件:
恒压160V,60min。
电泳结束后,小心取出胶,浸入染色液(5.13)中,置摇床上,室温染色30min。
回收染色液,加入脱色液(5.14),置摇床上缓慢脱色,直至条带清晰可见。
用凝胶扫描装置拍照。
7.3建立酶活性测定的统一方法
7.3.1底物筛选
以定性滤纸、木聚糖(来源于玉米芯)、β-葡聚糖和果胶为底物,按照GB/T23881-2009《饲用纤维素酶活性的测定滤纸法》、GB/T23881-2009《饲料添加剂木聚糖酶活力的测定分光光度法》、NY/T911-2004《饲料添加剂β-葡聚糖酶活力的测定分光光度法》及QB/T4482-2013《碱性果胶酶制剂》标准方法,分别测定纤维素酶,木聚糖酶、β-葡聚糖酶和果胶酶对不同底物的催化酶活,以此筛选出统一的底物。
7.3.2以滤纸为底物的酶活测定步骤
7.3.2.1吸取10.0mL经过适当稀释的酶液,在一定温度下平衡10min。
7.3.2.2在25mL具塞比色管中加入滤纸片。
定性滤纸(6.10)须对称剪成32片并全部放入,加1.0mL不同pH的缓冲溶液(5.8或5.10)浸润滤纸片,在一定温度下水浴平衡10min。
7.3.2.3实验组:
在平衡后的滤纸条(7.3.2.2)中依次加入0.50mL酶液(7.3.2.1),5.0mL水,振荡3s~s,一定温度下水浴酶解一定时间,加2.0mLDNS试剂(5.12),然后沸水浴煮沸5min,自来水冷却至室温,加水定容至25.0mL。
在540nm处测吸光度A1。
7.3.2.4对照组:
在平衡后的滤纸条(7.3.2.2)中依次加2.0mLDNS试剂(5.12),0.50mL酶液(7.3.2.1)和5.0mL水,振荡3s~5s,一定温度下水浴酶解一定时间,然后沸水浴煮沸5min,自来水冷却至室温,加水定容至25.0mL。
在540nm处测吸光度A0。
7.3.3酶活性测定条件优化
7.3.3.1优化酶催化温度
固定pH为5.5,酶解时间为60min,考察酶解温度30℃、37℃、45℃、50℃、和60℃对酶活性测定的影响。
纤维素酶,果胶酶,木聚糖酶和β-葡聚糖酶都用pH为5.5的乙酸-乙酸钠缓冲溶液(5.8)溶解并稀释。
滤纸片也用乙酸-乙酸钠缓冲溶液(5.8)浸润。
将浸润的滤纸片和经过适当稀释的酶液,分别置于30℃、37℃、45℃、50℃、和60℃水浴平衡10min。
在平衡后的滤纸条中分别依次加入0.50mL平衡后的酶液,5mL水,振荡3s~5s,分别在30℃、37℃、45℃、50℃、和60℃水浴保温60min,加2.0mLDNS试剂(5.12),然后沸水浴煮沸5min,自来水冷却至室温,加水定容至25.0mL。
在540nm处测吸光度A1,作为实验组。
在平衡后的滤纸条中分别依次加2.0mLDNS试剂(5.12),0.50mL平衡后的酶液和5.0mL水,振荡3s~5s,分别在30℃、37℃、45℃、50℃、和60℃水浴保温60min,然后沸水浴煮沸5min,自来水冷却至室温,加水定容至25.0mL。
在540nm处测吸光度A0,作为对照组。
以(A1-A0)带入标准曲线(7.1.2),并按照公式
(2)计算各酶的酶活。
7.3.3.2优化酶催化pH
酶解温度为7.3.3.1优化的统一温度,酶解时间为60min。
考察酶解pH为4.8,5.5,6.4,7.2,和8.0时对酶活性测定的影响。
按照7.2.1酶制剂溶液的制备步骤,分别用pH为4.8,5.5,6.4,7.2,和8.0的缓冲溶液(5.8或5.10)溶解并稀释酶制剂。
滤纸片也分别用不同pH的缓冲溶液(5.8或5.10)浸润。
配制好的酶液按照7.3.2的步骤进行酶活测定。
7.3.3.3优化酶催化时间
酶解温度为7.3.3.1优化的统一温度,酶解pH为7.3.3.2优化的统一pH。
考察酶解时间为30,45,60,75,和90min时对酶活性测定的影响。
用7.3.3.2优化的pH缓冲溶液按照7.2.1的步骤配制酶制剂溶液并浸润滤纸片。
按照7.3.2的步骤测定酶活性,温度设定为7.3.2.1优化的统一酶催化温度,分别水浴酶解30,45,60,75,和90min,测定酶活。
7.4方法适用性评价
购买不同来源和不同厂家的四种非淀粉多糖水解酶(表2),按照7.3建立的统一酶活性测定方法,测定各种酶制剂的酶活,以此评价该方法的适用性。
表2.不同来源和不同厂家的非淀粉多糖水解酶。
酶制剂
来源/厂家
原始酶活(U/g)
纤维素酶
美仑生物
400,000
果胶酶
麦克林
30,000
百灵威
10,000
木聚糖酶
100,000
60,000
β-葡聚糖酶
源叶生物
50,000
8.结果计算与分析
8.1绘制葡萄糖标准曲线
以葡萄糖质量为横坐标,以吸光度为纵坐标,绘制标准曲线如图1。
获得线性回归方程,y=(-0.0166±
0.010)+(0.5183±
0.009)x,R2=0.998。
图1.葡萄糖标准曲线。
8.2酶制剂溶液的鉴定
8.2.1蛋白质含量的测定
酶制剂溶液中蛋白质的含量以C表示,按照公式
(1)计算:
C=(1.45×
OD280nm-0.74×
OD260nm)×
n……………………….
(1)
式
(1)中:
C——蛋白浓度,mg/mL;
n——稀释倍数
酶制剂溶液中蛋白质含量的测定结果见表3。
酶制剂的本质是蛋白质,表3结果说明纤维素酶(里氏木霉/阿拉丁),纤维素酶(绿色木霉/国药),果胶酶(黑曲霉/阿拉丁),木聚糖酶(曲霉/Sigma),和β-葡聚糖酶(青霉/Sigma)蛋白浓度都较高。
其中,果胶酶(黑曲霉/国药)蛋白浓度较低,与称取的酶质量相差较大。
表3.酶制剂溶液中蛋白质含量。
称取质量(g)
OD280
OD260
蛋白浓度(mg/mL)
里氏木霉(阿拉丁)
≥25000
0.05292
0.61
0.50
0.5145
绿色木霉(国药)
≥15000
0.05514
0.4
0.12
0.4912
黑曲霉(国药)
≥50
1.00081
0.2
0.07
0.3832
黑曲霉(阿拉丁)
>
30000
0.08282
1.81
1.55
1.4775
曲霉(Sigma)
≥2500
0.10765
0.03
0.2678
青霉(Sigma)
≥11000
0.06550
0.37
0.40
0.405
8.2.2酶制剂纯度鉴定
酶制剂电泳纯度鉴定如图2。
由图可知,这些酶制剂纯度都不是很高,但与8.2.1蛋白浓度测定数据一致。
查文献知,纤维素酶,果胶酶,木聚糖酶和β-葡聚糖酶都是一种复合酶。
纤维素酶是降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的总称,它不是单体酶,而是起协同作用的多组分酶系,是一种复合酶,主要由外切β-葡聚糖酶、内切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶等组成。
果胶酶的有效成分主要是果胶甲酯酶,聚半乳糖醛酸酶,和果胶裂解酶。
木聚糖水解酶系是一类降解木聚糖的酶系,包括β-1,4-内切木聚糖酶、β-木糖苷酶、α-L-阿拉伯糖苷酶、α-D-葡糖苷酸酶、乙酰基木聚糖酶和酚酸酯酶。
β-葡聚糖酶可使高分子的粘性葡聚糖分解成低粘度的异麦芽糖和异麦芽三糖。
使β-D-葡聚糖中的1,3-β-和1,4-β-糖苷键水解为寡糖和葡萄糖。
因此,电泳条带不单一合理。
图2.8-20%Precast-GLgelTris-Glycine预制胶鉴定酶制剂的纯度。
1.纤维素酶(里氏木霉/阿拉丁)2.纤维素酶(绿色木霉/国药)3.果胶酶(黑曲霉/国药)4.果胶酶(黑曲霉/阿拉丁)5.木聚糖酶(曲霉/Sigma)6.β-葡聚糖酶(青霉/Sigma)。
8.3底物筛选
以定性滤纸、木聚糖(来源于玉米芯)、β-葡聚糖和果胶为底物,按照GB/T23881-2009《饲用纤维素酶活性的测定滤纸法》、QB/T4482-2013《碱性果胶酶制剂》、GB/T23881-2009《饲料添加剂木聚糖酶活力的测定分光光度法》和NY/T911-2004《饲料添加剂β-葡聚糖酶活力的测定分光光度法》标准方法,分别测定纤维素酶,果胶酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶对不同底物的催化酶活,结果见表4。
由表4可知,定性滤纸适合作为纤维素酶、果胶酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶的统一酶活测定的底物。
表4.酶活性测定的统一底物筛选(酶活单位,U/g)。
不同底物
定性滤纸
木聚糖
β-葡聚糖
果胶
纤维素酶(≥25000U/g)
25116.24±
772.94
18525.49±
612.93
23467.63±
591.87
3844.91±
619.11
纤维素酶(≥15000U/g)
15782.34±
712.14
9213.90±
712.87
13839.12±
601.01
1816.71±
831.91
果胶酶(≥50U/g)
21.14±
2.57
18.94±
2.82
21.31±
3.37
47.23±
2.11
果胶酶(>
30000U/g)
25384.30±
942.12
23193.99±
731.34
22231.42±
842.94
28139.87±
913.92
木聚糖酶(≥2500U/g)
1893.47±
339.12
2331.86±
142.41
1768.94±
101.10
1109.28±
242.12
β-葡聚糖酶(≥11000U/g)
9881.39±
528.94
8994.48±
822.94
10481.94±
583.52
4139.13±
8.4酶活测定条件优化
酶制剂的酶活以X表示,单位为酶活性单位每克(U/g),按式
(2)计算:
式
(2)中:
X——非淀粉多糖水解酶的酶活力,单位为U/g;
m——根据标准曲线方程上计算得的(A1-A0)值对应的葡萄糖的质量,单位为毫克(mg);
M——葡萄糖的摩尔质量,180.2g/mol;
t——酶解反应时间,单位为分钟(min);
1000——转化因子,1mmol=1000μmol;
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 淀粉 多糖 水解 活力 测定 分光光度法 国家标准