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1.1实验材料3
1.1.1中药4
1.1.2鸡胚4
1.1.3病毒4
1.2实验仪器与试剂4
1.3实验方法4
1.3.1IBV标准毒株ELD50的测定5
1.3.2中药提取液安全浓度的测定5
1.3.3中药提取液在鸡胚水平上对病毒作用效果的测定5
2.结果5
2.1ELD50的测定结果5
2.2中药提取液安全浓度的测定结果6
2.3中药提取液对病毒毒力作用效果的测定结果6
3.分析与结论7
3.1分析7
3.2结论7
致谢8
参考文献8
英文摘要9
专业:
动物生物技术班级:
11级2班姓名:
辛亚洲
指导老师:
龚争职称:
畜牧师
摘要目的探究中药水煎液在鸡胚水平上抗禽传染性支气管炎病毒的作用效果。
方法本试验以三种单味中药和两种复方中药水提制剂作为试验材料,接种在11日龄的鸡胚上,观察其对鸡传染性支气管炎病毒(IBV)的作用效果。
结果实验数据表明,选用的单味和复方中药的水提取物在其安全浓度范围内,均对鸡传染性支气管炎病毒有一定的阻断和抑制作用,复方B、板蓝根、连翘对IBV的阻断作用效果显著,而蒲公英、复方E对病毒的阻断作用一般。
在对病毒的抑制作用方面,复方中药提取物明显优于单方,且效果显著。
结论复方B提取液对IBV的阻断和抑制作用较为突出。
关键词鸡传染性支气管炎病毒;
鸡胚;
单、复方中药;
中药提取物
引言
近些年来,禽类病毒性传染病已然成为制约家禽养殖业发展的重要因素,它不仅造成大批畜禽死亡和畜产品质量下降给养禽业造成巨大经济损失,而且某些人畜共患病还威胁人类健康[1]。
在我国各地,随着家禽养殖规模的不断增大,养殖户对禽类传染性疾病的重视也不断增加。
其中鸡传染性支气管炎是最近几年研究比较多的一种禽类病毒性传染病。
鸡传染性支气管炎(Infectiousbronchitis,IB),又称小鸡支气管炎(chickbronchitis)或喘息病(gaspingdisease)等,系病毒引起鸡的一种急性、高度接触传染的呼吸道疾病,病毒可以通过呼吸系统直接接触感染家禽及污染的垫料、设备或其他污染物传播[2]。
主要侵害鸡的呼吸系统、消化系统以及泌尿生殖系统,以气管啰音、咳嗽和打喷嚏为特征[3]。
患病鸡的主要临床表现为张口呼吸、咳嗽、伸颈。
各性别、各日龄的鸡均易感染,但主要侵害1-4周龄雏鸡,幼雏鸡感染本病后常引起输卵管永久性退化,因呼吸道或肾脏病变而引起的死亡率高达40%-90%[4],鸡感染传染性支气管炎病毒后,通常会引起饲料报酬率降低,死淘率增加,该病造成的生产效益下降比死亡损失要大,严重危害养鸡业生产[5]。
1982年以来在我国一直广泛流行,即使免疫措施做的很到位的鸡场也偶有发生。
为了预防并控制该病的发生与流行,现在临床上常采用方法是疫苗接种。
但是由于该病毒的变异性强、疫苗种类和接种操作方法不当,使得该病不能有效的得到控制。
根据历年的实验证实具有较好抗病毒活性的中药就有300多种,其中100多种为常用中药[6]。
目前,国内外有关抗病毒中药的研究日益增多,从中筛选出有效成分已成为抗病毒新药研发的一个热点[7]。
近几年,抗病毒西药虽然在一定程度上填补了治疗病毒性疾病的空缺,可是长期应用易产生耐药性,降低疗效,病情复发,已然成为临床治疗及新药开发的重要问题[8]。
且复方与单方相比较,当两种及两种以上具有一致作用方向的药物合用时,将会产生协同作用,但是如果它们的作用相反,那么彼此之间也会产生一定的拮抗作用。
同时复方可能还能减少耐药性的出现,从而增加边缘效应药物的一些抗菌活性等诸多优点。
我国的中草药资源丰富、有害残留少、毒副作用小以及病原菌不易产生耐药性等优点在疫病防治中备受关注[9]。
蒲公英含有的多糖类、黄酮类、酚酸类、三萜类、植物甾醇等多种活性成分,具有清热解毒、消肿散结等功效[10]。
研究发现蒲公英有抗菌[11]、抗突变[12]、抑瘤[13]、抗氧化[14]等多种药理学作用。
板蓝根又叫大青根、靛青根。
是一种中药材,主要含有氨基酸和腺苷等。
具有清热解毒的疗效。
连翘又叫连壳,主要含有连翘酚和黄酮甙等。
具有清热解毒和消肿的功效。
当归味甘、辛,性温。
主要成分为苯酚类。
有补血、和血、调经止血、润肠滑肠之功效[15]。
研究表明各多糖样品对大鼠移植性肿瘤EC、Hep、S180、Lewis、B16等瘤株具有一定程度的抑制作用,其肿瘤生长抑制率可达39%,副作用较少,且可长期用药。
甘草又名国老、灵通、甜草,为豆科植物甘草、胀果甘草或光果甘草的干燥根及根茎[16]。
味甘,性平,归心、肺、脾、胃经,具有补脾益气,清热解毒,祛痰止咳,缓急止痛,调和诸药的功效[17]。
有效成分为黄酮类混合物和多糖,而黄酮类化合物具有抗炎、抗变态反应的功效。
早先产于山西、陕西、山东及东北3省,现大多已经绝迹或甚少。
目前,宁夏、甘肃、青海、内蒙古、新疆和陕西榆林地区作为甘草大宗商品的供货地,新疆甘草的蕴藏量较多、种质资源最为丰富[18]。
本实验分别采用板蓝根、蒲公英、连翘三种单味中药的水提制剂和以生地、黄柏、山楂、当归、赤芍、白头翁、青皮、黄连按照一定比例组成主要配方E、由知母、地黄、牡丹皮、云参、赤芍、黄连、栀子、黄荟、连翘、甘草按照一定比例组成复方B的水煎剂为试验材料,在11日龄鸡胚上观察对鸡传染性支气管炎病毒(IBV)的作用效果。
1材料与方法
1.1实验材料
1.1.1中药选用蒲公英、板蓝根以及连翘作为单方,E复方(白头翁、黄连、生地、黄柏、山楂、当归、赤芍、青皮),B复方(知母、地黄、牡丹皮、云参、赤芍、黄连、栀子、黄荟、连翘、甘草)。
单方水提液的制备按照常规水煎法进行提取,各分别取蒲公英50g、板蓝根50g、连翘50g,加10倍体积的水,用电热炉煎煮,微沸2h。
三层纱布趁热过滤后,药渣再加以5倍体积的水,用电热炉煎煮,微沸2h,将两次的过滤液合并,旋转蒸发仪将药液减压浓缩成相当于含生药量1.0g/mL,调pH至7.2-7.4。
高压灭菌,4℃冰箱保存备用。
复方E水提液的制备按照常规水煎法进行提取,按10:
10:
5:
4的比例分别称取白头翁20g、黄连20g、生地20g、黄柏20g、青皮10g、山楂10g、当归10g、赤芍8g,再加以10倍体积的水,用电热炉煎煮,微沸2h。
三层纱布趁热过滤后,药渣再再加以5倍体积的水,用电热炉煎煮,微沸2h,将两次的过滤液合并,旋转蒸发仪将药液减压浓缩成相当于含生药量1.0g/mL,调pH至7.2-7.4。
复方B水提液的制备按照常规水煎法进行提取,按6:
6:
4:
5称取知母12g、地黄12g、牡丹皮8g、云参10g、赤芍10g、黄连8g、栀子12g、黄荟10g、连翘10g、甘草10g,共102g,再加以10倍体积的水,电热炉煎煮,微沸2h,将两次的过滤液合并,旋转蒸发仪将药液减压浓缩成相当于含生药量1.0g/mL,调pH至7.2-7.4。
1.1.2鸡胚SPF鸡蛋购自北京梅里亚维通实验动物有限公司,由预防兽医学实验室孵化器孵化。
1.1.3病毒IBV毒株,由家禽疫病防控监测安徽省重点实验室提供。
1.2实验仪器和试剂
仪器:
超净工作台(苏净集团安泰公司)、电磁炉(江苏苏泊尔电器有限公司)、TGL-16C型高速台式离心机(上海安亭科学仪器厂)、立式高压蒸汽灭菌器、YP3001型电子台秤(上海精科)、GSP-9050MBE型隔水式恒温培养箱、BCD-215KADZ型电冰箱(青岛海尔股份有限公司)、西厨多功能粉碎机(广州煌子西厨设备制造有限公司)、RAININPipet-One手动移液器。
试剂:
50%乙醇、生理盐水、PBS液等。
1.3实验方法
1.3.1IBV毒株ELD50的测定
将IBV毒株按照10倍比连续稀释4个稀释度,取各稀释液接种于11日龄SPF鸡胚,各个稀释度接种4枚SPF鸡胚,一个鸡胚接种0.1ml,同时留取4枚SPF鸡胚作为空白对照。
将鸡胚置于37.8℃恒温孵化箱内孵化,每间隔8小时照蛋。
连续照蛋五天,舍弃第一天死亡的鸡胚,每次观察活胚的孵化情况及打开蛋壳检查死胚的病变情况,并做好观察记录。
1.3.2中药提取液安全浓度的测定
将5种中药液用生理盐水分别做50倍稀释后再分别做连续2倍、3倍、4倍、5倍、6倍比稀释,得50、100、150、200、250、300倍比6个稀释度,取这6个稀释度的稀释液接种于11日龄SPF鸡胚,每个稀释度接种4枚鸡胚,每枚鸡胚接种0.2ml,同时准备4枚SPF鸡胚作为空白对照。
连续照蛋五天,舍弃第一天死亡的鸡胚,每次观察活胚的孵化情况及打开蛋壳检查死胚的病变情况,并做好记录工作。
根据最后存活下来的鸡胚数量来测定中药对鸡胚的毒性,找到对鸡胚孵化没有影响的最大浓度,该浓度就是对鸡胚的最大安全浓度。
1.3.2中药提取液在鸡胚水平上对病毒作用效果的测定
阻断作用的测定:
先将最大安全浓度的中药液接种于11日龄SPF鸡胚,将鸡胚放入37.8℃恒温箱中保温,4小时以后取出,再将含有100倍半数致死量浓度的病毒液按0.1ml/枚接种于鸡胚。
接种4枚鸡胚,同时准备4枚SPF鸡胚作为空白对照。
抑制作用的测定:
先将含有100倍半数致死量浓度的病毒液接种于11日龄鸡胚,将鸡胚置于37.8℃恒温箱中保温,4个小时后取出,再将最大安全浓度的中药液按0.2ml/枚接种于鸡胚。
将鸡胚置于37.8℃恒温箱中孵化,每间隔8小时照蛋。
2结果
2.1ELD50的测定结果
表1鸡胚接种IBV72h后死胚情况
病毒稀释度
接种鸡胚数(枚)
死胚数量(枚)
活胚数量(枚)
死亡百分率
10-5
4
100%
10-6
3
1
75%
10-7
25%
10-8
结果按Reed-Muench法计算公式得,其半数致死量为10-7/0.1mL
2.2中药提取液安全浓度的测定结果
实验结果如下
(1)蒲公英成分提取液在浓度为8.33mg/ml时对鸡胚发育无影响。
蒲公英全成分提取液最大安全浓度为8.33mg/ml。
(2)板蓝根成分提取液在浓度为6.25mg/ml时对鸡胚发育影响不明显,毒性不大。
板蓝根全成分提取液最大安全浓度为6.25mg/ml。
(3)连翘成分提取液在浓度为4.5mg/ml时对鸡胚发育稍微有影响,但与对照胚比较,没有显而易见的差别。
连翘全成分提取液最大安全浓度为4.5mg/ml。
(4)复方E成分提取液在浓度为19mg/ml时对鸡胚发育无影响,毒性小。
该成分提取液最大安全浓度为19mg/ml。
(5)复方B成分提取液在浓度为7.2mg/ml时时对鸡胚发育无影响,该成分提取液最大安全浓度为7.2mg/ml。
2.3中药提取液对病毒毒力作用效果的测定结果
表2中药提取液对病毒毒力的阻断作用的测定结果
死胚数量(枚)
IBV(0.1ml/枚)
蒲公英
2
板蓝根
连翘
复方E
复方B
由表2可知:
板蓝根、连翘、复方B对病毒的阻断效果比较明显,蒲公英、复方E阻断效果一般。
表3中药提取液对病毒毒力的抑制作用的测定结果
由表3可知:
复方E和复方B对病毒有抑制作用,且效果显著。
单方对病毒抑制作用一般。
3分析与结论
3.1分析
从试验结果可以看出:
在研究中药的阻断作用中,若先接种中药提取液再接种IBV,观察到接种了蒲公英、板蓝根、连翘水煎提取液后均出现死亡鸡胚,但死亡程度不同。
蒲公英、复方E导致半数鸡胚死亡,而板蓝根、连翘、复方B均致死一枚。
说明板蓝根和连翘对IBV的阻断有一定的效果,蒲公英对IBV也有阻断效果,但效果不显著,中药复方B比复方E对IBV有更好的阻断效果。
中药制剂对病毒的抑制实验中先接种IBV再接种不同的单、复方中药提取液,均有死亡鸡胚出现,也表现为不同程度的死亡。
蒲公英、板蓝根均半数致死,复方E和复方B各致死1枚鸡胚。
蒲公英、板蓝根在对病毒的抑制实验中效果明显,连翘抑制作用不明显。
而复方E和复方B对病毒的抑制效果特别明显,且复方在整体上比单方对病毒的抑制效果好,其结果和房秀云等[19]章祥根等[20]所报道的结果相接近。
可能的原因是在复方中药中不同中药在作用方向一致的情况下具有协同抑制IBV的效果。
在研究单、复方中药提取液对IBV毒力的阻断作用与抑制作用的试验中,均有死胚出现。
可能是由于中药提取液浓度小而IBV毒力强或者接受接种的SPF鸡胚是弱胚,也可能是复方中药成分之间相互作用,降低了对IBV毒力的阻断作用与抑制作用,导致接种了复方中药的试验结果与预期结果不一样。
也有可能在接种过程中操作失误,对鸡胚造成损伤,因而可能造成试验结果的偏差。
3.2结论
2007年杨洁、刘萍等人运用体外细胞培养法研究了黄芩等5种中药提取物的体外抗病毒药效[21].本试验选用的具有清热解毒、抗病毒功效的多种中药,板蓝根、连翘、蒲公英、复方B(包含知母、地黄、牡丹皮、玄参、赤芍、黄连、栀子、黄岑、连翘、甘草)、复方E(包含白头翁、黄连、生地、黄柏、青皮、山楂、当归、赤芍)水煮法获得提取液,通过接种SPF鸡胚进行试验。
结果表明5种单复方中药提取液均对IBV病毒呈现一定程度的阻断效果和抑制效果。
对病毒的阻断试验与抑制试验相比较表明:
蒲公英和复方B在对IBV的阻断与抑制试验中出现了相同的试验效果,但结果说明复方B在对IBV的作用效果上最为明显,而在对病毒的抑制试验中,复方明显比单方对病毒的作用效果更加明显。
致谢
衷心感谢龚争畜牧师在我论文完成期间,给予的帮助。
另外,在实验进行与论文撰写时安徽科技学院附属兽医院与安徽科技学院动物医学实验室的王旋等老师无私的帮助,李坤、任智恒等同学在实验期间与论文撰写期间热情的帮助表示感谢。
实验能够顺利完成,安徽科技学院动物科学学院提供的先进的仪器和理论依据给了我很大的帮助,在这里表示感谢。
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英文摘要
Abstract:
Objective:
ToexploreChinesemedicinedecoctiononthelevelofchickeneggsagainstavianinfectiousbronchitisviruseffect.Methods:
InthisexperimentthethreetraditionalChinesemedicine(TCM)andtwoflavorcompoundChinesemedicinepreparationastestmaterial,vaccinationintheageof10-12chickenembryosatthechickeninfectiousbronchitisvirus(IBV)effect.Results:
TheexperimentalresultshowsthattheselectionofsingleandcompoundthewaterextractofChinesetraditionalmedicineinsafeconcentrationrange,bothforchickeninfectiousbronchitisvirushascertainblockandinhibition,compoundB,radixisatidis,fructusforsythiaeofIBVblockingeffecthaveasignificanteffect,anddandelion,compoundEblockingeffectofviruses.InhibitionofvirusesinthecompoundChinesemedicineextractwasbetterthansingle,andtheeffectisremarkable.Conclusion:
TestsshowedthatthesingleandcompoundChinesemedicineextracthascertaineffectonresistancetoIBV,thecompoundextractofIBVblockBandinhibition.
Keywords:
avianinfectiousbronchitis(ib);
extractsoftraditionalChinesemedicine;
chick-embryoinoculation
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