人免疫缺陷病毒抗体测定.docx
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人免疫缺陷病毒抗体测定
人免疫缺陷病毒抗体测定
1.样品的接收、登记和处理
1.1采血3-4ml,收集到促凝管中(可采用常规用量的肝素或枸橼酸钠抗凝)
1.2检查样品的状况,有无严重溶血、微生物污染、血脂过多以及黄疸等情况。
如果污染过重或者认为样品不能被接受,要将样品情况立即通知送样人。
1.3仔细核对样本与送检单,然后编号
1.4样品为全血(抗凝),用3.000r/min离心15min,血清/血浆备用。
打开标本容器时要小心,以防内容物泼溅。
样品处理时若内容物有可能溅出,则应在生物安全柜中戴手套进行。
同时应戴口罩、防护眼镜,以防皮肤或粘膜污染。
1.5每天上午进行样品的检测。
节假日(短期1周内)进行检测的样品存放于2~8℃,需长期存放的样品,应置于-20℃以下。
需保存的血清在采集、保存过程中应注意无菌操作。
2.检测方法和步骤
2.1检测方法
(一)
酶联免疫吸附试验(ELISA)
2.1.1基本原理
以珠海丽珠试剂股份有限公司的ELISA(双抗原夹心法)为例。
采用双抗原夹心ELISA方法检测血清或血浆中人类免疫缺陷病毒HIV(1+2)型抗体。
在微孔条中预包被高纯度HIV(1+2)抗原,通过检品中抗HIV抗体桥连作用,与后面加入的HRP标记抗原结合,HRP对底物TMB作用显色。
通过酶标仪检测吸光度(OD值)从而判定检品中是否存在抗HIV抗体。
2.1.2检测步骤
实验准备:
试验开始前将试剂和样品放置在室温(18~23℃),平衡30分钟后使用。
配液:
将浓缩洗液用蒸馏水或去离子水20倍稀释备用
备好试剂盒、待检样品和外部对照质控血清后,按试剂盒说明书以及质控和安全防护要求进行筛查检测。
准备实验原始记录表
2.1.3实验操作
2.1.3.1装好所需使用数目的孔条,每孔均加入50μl样品稀释液。
留一孔作空白对照,暂不加任何液体。
另设3个阴性对照孔,1个HIV-1阳性对照孔,若需要可再设1个HIV-2阳性对照孔。
2.1.3.2每孔加入50μl待检样品及对照(对照要后加),加样时吹打混匀则效果更佳。
在反应板上加盖封板膜,振荡混匀,置37±2℃温箱或水浴锅中,孵育40min。
2.1.3.3置洗板机上洗涤6遍,每次静置30~60S,洗完后孔上方及底部不应残存液体。
2.1.3.4每孔加入100μl酶结合物(空白对照孔不加),在反应板上加盖封板膜,振荡混匀,置37±2℃温箱或水浴锅中,孵育40min。
2.1.3.5洗板6次后,每孔依次加入底物A、B液各50μl(包括空白对照孔),加盖封板膜,振荡混匀,37℃避光显色15min。
2.1.3.6每孔加入终止液各50μl(包括空白对照孔),振荡混匀终止反应。
2.1.3.7用空白对照孔调零,并尽快用酶标仪单波长450nm,或双波长450/630nm测OD值。
2.1.4实验结果
2.1.4.1临界值(Cut-off值)计算:
Cut-off值=0.08+阴性对照OD平均值(阴性对照OD平均值≤0.05按0.05计算)
2.1.4.2结果判定:
样本A值≥临界值时为抗HIV抗体阳性
样本A值<临界值时为抗HIV抗体阴性
2.1.5登记和报告
2.1.5.1填写实验原始记录表;将样品信息和检测结果录入标本登记表。
2.1.5.2对呈阴性反应的样品,出具HIV抗体筛查报告或化验单;对呈阳性反应的样品,须进行复检,不能出阳性报告。
2.1.5.3复检试验:
对初筛呈阳性反应的样品用原有试剂和另外一种不同原理或不同厂家的筛查试剂重复检测。
如两种试剂复测均呈阴性反应,则报告HIV抗体阴性如均呈阳性反应,或一阴一阳,送艾滋病确认实验室进行确认。
2.2检测方法
(二)
金标法
2.2.1基本原理
将特异性的抗原(或抗体)以条带状固定于硝酸纤维膜上,将胶体金标记试剂吸附在结合垫上。
当待测样品(血清或尿液)加到试剂条一端的样品垫上后,通过毛细作用向前移动,溶解固化的结合垫上的胶体金标记试剂后相互反应,再移动至固定的抗原(或抗体)的区域时,待测物和金标试剂的复合物又与之发生特异性结合而被截留,聚集在检测带上,通过可目测的胶体金标记物得到直观的显色结果。
而流离标记物则越过检测带,达到与结合标记物自动分离之目的。
以英科新创的人类免疫缺陷病毒抗体诊断试剂盒为例
用经胶体金标记的重组HIV抗原(Au-HIV-Ag)包被的玻璃纤维素膜、重组HIV抗原(HIV-Ag)和抗HIV单克隆抗体包被的硝酸纤维素膜制成。
检测阳性样本时,血清样本中HIV抗体与胶体金标记抗原结合形成复合物,由于层析作用复合物沿纸条向前移动,经过检测线时与预包被的重组HIV-Ag结合形成“Au-HIV(1+2)-Ag-HIV-Ab-HIV(1+2)-Ag”夹心物而凝聚显色,游离的胶体金标记重组Au-HIV(1+2)-Ag则在对照线处与抗HIV单克隆抗体结合而富集显色。
阴性标本则仅在对照线处显色。
2.2.2检测步骤:
2.2.2.1将待测标本从储存条件下取出,平衡至室温
2.2.2.2从包装盒中取出测试卡平衡至室温,打开铝箔包装袋,平置于台面上
2.2.2.3用微量加样器取60μl样本血清,加到测试卡的加样处;或用试剂盒内所配塑料滴管吸取样本,垂直滴加三滴于测试卡的加样处。
2.2.2.4加样后,阳性标本可在1-30分钟内检出。
2.2.3结果判定
阳性:
测试卡在检测区和对照区位置出现两条紫红色条带。
如果检测区的紫红色条带隐约可见,建议对该样本重复试验,并使用其他方法确认。
阴性:
测试卡只在对照区位置出现一条紫红色条带
失效:
对照区未出现紫红色条带,表明不正确的操作过程或试剂盒已变质损坏或者是样本中抗体的含量过高。
在此情况下,将待测标本稀释后用新的测试卡重新测试。
注意:
测试区(T)内的紫红色条带可呈现颜色深浅的现象。
但是,在规定的观察时间内,不论该色带颜色深浅,即使只有非常弱的色带也应判定为阳性结果。
2.2.4注意事项
2.2.4.1检测线颜色的深浅的程度与样品中抗体的滴度没有一定的必然联系
2.2.4.2任何一种测试都不能绝对保证样品中没有低浓度的抗体存在,所以阴性结果任何时候不能排除HIV暴露和感染的可能。
2.2.4.3不用EDTA抗凝的全血血浆样品可能会得到不正确的结果。
3.仪器的使用维护和校准
3.1酶标读数仪、洗板机
3.1.1每天核对滤光片波长,检查洗板机管道是否通畅,是否有漏液现象。
3.1.2每周清洁仪器表面,保护光学零件不沾灰尘。
3.1.3每月检查洗涤时各孔是否与相应的冲洗头对位良好,负压是否符合规定要求。
3.1.4每年检查、清洗滤光片,如果出现破裂或霉点则要更换。
根据仪器内具有的校准程序或使用校准板,对滤光片的精密度进行校准并保留记录。
3.1.5实验过程中发现异常情况,应随时进行处理,可根据使用情况更换必要的部件。
3.2移液器
1年至少应该标定1次,送计量局进行校准。
3.3生物安全柜
3.3.1每年检定一次生物安全柜
3.3.2保持所有操作在窗扇4英寸以内
3.3.3清洁物质和污染物隔离开,减少相互干扰,使用后及时清理。
3.4冰箱和水浴箱
必须每天检查和记录低温、超低温冰箱及水浴箱的温度,并做好记录。
3.5记录
每次使用、维护、校准都要填写仪器使用记录和维护校准记录。
4.实验中的质量控制
阳性对照OD值不低于1.5、阴性对照OD值不高于0.1时的实验结果有效。
否则应重新试验。
质控规则及使用
4.1告警(2S):
当外部对照的S/CO值超出2s范围时,系统处于告警状态,应予注意,是否可以继续检测需要进一步观察。
4.2失控(3S):
当外部对照的S/CO值超出3s范围时,系统处于失控状态,本次实验结果不能被接受,可能是系统误差、随机误差或外部对照滴度下降造成。
4.3位移:
连续几次(3~5次)外部对照S/CO值都落在均值的一侧则称为位移,提示实验条件发生了较大的变化。
4.4趋势:
连续几次(5~7次)外部对照S/CO值几乎按一个方向分布时称为趋势,通常由参数的缓慢改变引起。
4.5出现下列情况时,应暂停检测查找原因:
出现一次3s范围的变化、连续两次出现同一方向2s范围的变化、连续四次出现同一方向的1s范围的变化、连续10次结果都在1s范围内,但落在均值线的同一侧。
4.6质控图的分析及失控处理
4.6.1当出现失控时,必须找出问题原因,找出解除故障的方法,并消除原因,防止将来出现同样的问题。
4.6.2由专人负责建立质控图,定期召开质控分析会,讨论质量控制情况。
4.6.3更换不同厂家的试剂盒后,必须重新绘制质控图。
改用新批号试剂盒也应重新制作质控图。
使用新批号或不同厂家的试剂盒必须在质控图上注明使用日期。
4.6.4使用新批次的外部对照质控物时,必须重新绘制质控图。
5.实验室的清理和消毒
5.1HIV实验室常用物品的消毒方法
5.1.1废弃物缸:
10%次氯酸钠(含10,000ppm有效氯)。
5.1.2生物安全柜工作台面和仪器表面:
70%乙醇。
5.1.3溢出物:
10%次氯酸钠(w/v)。
5.1.4污染的台面和器具:
40%甲醛水溶液,也可以用过氧化氢或过氧乙酸。
5.1.5使用后非一次性用品,(尖锐物品置于不宜刺破的容器内),高压消毒后再重复使用。
5.1.6污染的非一次性工作衣应先消毒后再洗涤;
5.2实验室废弃物的处理
5.2.1HIV实验室所有废弃物,包括用过的一次性手套和工作衣,置于专门污物袋内,经高压消毒后焚烧。
5.2.2废液经消毒液处理过夜后倾倒。
5.3需带出实验室的物品在被带出实验室前必须进行消毒。
5.4必要时生物安全柜和实验室甲醛蒸气熏蒸。
生物安全柜:
25ml福尔马林(40%甲醛,w/v)和等量水混合后放在一个蒸发皿中使其在密封的生物安全柜中蒸发,保持至少6小时,最好过夜。
实验室:
福尔马林和水加热沸腾,其体积根据实验室的大小而定。
6.实验室安全防护
6.1HIV检测实验室应为每个工作人员配备足够的防护服,包括白大衣、隔离衣或一次性工作服。
平时应将清洁的防护服置于实验室清洁区内专用存放处。
6.2离开实验室时,应脱去防护服。
每次穿过的污染的防护服应及时放入污衣袋中,待消毒后方可洗涤或废弃。
6.3当含有HIV的液体(样品或病毒培养液)及有可能溅到工作人员时,应使用防渗透性的(如塑料)围裙。
6.4当发现防护服已被污染时,应立即更换。
6.5艾滋病实验室应配备一次性手套、一次性口罩、安全防护眼镜及冲洗眼睛的装置。
进入实验室应穿隔离衣,戴手套。
如果接触物传染危险性大,则应戴双层手套和防护眼镜。
6.6艾滋病实验室应配备实验室专用的工作鞋,鞋面覆盖足背,鞋底防滑。
6.7皮肤受损、患病都会增加感染的危险。
皮肤的任何伤口和擦伤都应以防水敷料覆盖
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- 关 键 词:
- 免疫 缺陷 病毒 抗体 测定