人类基因组DNA的提取与鉴定.doc
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实验一人类基因组DNA的提取与鉴定
实验目的
1、学习人类基因组DNA的提取原理和方法。
2、熟悉应用分子生物学实验常用仪器。
实验原理
哺乳动物的一切有核细胞都可以用来制备DNA,除特殊要求外,白血球、肝或脾组织是最常用的材料。
原始材料较少或较难获得时(如羊水细胞),还必须经过细胞培养来获得足够量的细胞;有时为了简便易行起见,还可以无创伤地采集材料,如用口腔上皮脱落细胞、发根细胞。
根据材料来源不同,采取不同的材料处理方法,而后的DNA提取方法大体类似,但都应考虑以下原则:
(1)防止和抑制DNase对DNA的降解;
(2)尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏,保持DNA分子的完整;(3)将蛋白质、脂类、糖类等物质分离干净。
制备基因组DNA是进行基因结构和功能研究的重要步骤,通常要求得到的片段的长度不小于100-200kb。
在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素,以保证DNA的完整性,为后续的实验打下基础。
一般真核细胞基因组DNA有107-9bp,可以从新鲜组织、培养细胞或低温保存的组织细胞中提取,常是采用在EDTA以及SDS等试剂存在下用蛋白酶K消化细胞,随后用酚抽提而实现的。
这一方法获得的DNA不仅经酶切后可用于Southern分析,还可用于PCR的模板、文库构建等实验。
一、材料
一份提取总DNA的细胞或组织
1.5mlEppendorf管、微量移液器与吸头、15ml离心管、三角瓶(500或1000ml)。
二、设备
离心机、电子天平、恒温水浴箱、紫外分光光度计、电泳仪、电泳槽、凝胶成像仪、微波炉或沸水浴、透射紫外灯。
三、试剂
1.细胞核裂解液(STE):
0.1mol/LNaCl,10mmol/LTris-HCl,1mmol/LEDTA
2.0.8%(W/V)标准琼脂糖;
3.0.5×TBE缓冲液
4.其他试剂:
TE缓冲液或重蒸水、氯仿/异戊醇(24:
1,V/V)、异丙醇或无水乙醇、电泳加样缓冲液、溴化乙锭(EB)
四、操作步骤(酚法抽提染色体DNA)
(一)DNA的提取
1.采集口腔粘膜脱落细胞,用舌头舔颊粘膜上颚、用牙刮颊部,嘬咀,用分泌出的唾液反复漱口;将唾液吐到杯中。
用生理盐水洗涤,2000rpm离心10分钟,倒掉上清;重复1次。
2.沉淀中加1ml1×细胞核裂解液(STE),混匀,再加350mlSTE和150ml10%SDS,摇匀,至出现粘稠透明状。
加10ml20mg/ml蛋白酶K,摇匀。
37℃温箱过夜或50℃3~4小时。
3.加等体积饱和酚,轻摇混匀10分钟,室温2000rpm离心10分钟,去除蛋白和SDS的沉淀。
4.小心移上清至另一离心管,加等体积氯仿混匀5分钟,室温2000rpm离心5分钟。
5.小心移上清,若上清不清亮透明,则用等体积氯仿再抽提一次。
6.将上清移入另一离心管中,沿离心管壁向DNA溶液中加入2.5倍体积的无水乙醇,轻轻摇动离心管混和至体系完全均一,见白色絮状DNA。
用移液器吸头挑出DNA沉淀,在新配制的70%乙醇洗二次,室温干燥5分钟,再将DNA溶于20-100mlTE中,测OD值。
7.TE溶解的DNA,在4℃下可保存一年,如要求长期保存,则需加2倍体积无水乙醇置-70℃保存。
(二)DNA的鉴定及定量
1.比色法:
DNA在260nm处有最大的吸收峰,蛋白质在280nm处有最大的吸收峰,盐和小分子则集中在230nm处。
因此,可以用260nm波长进行分光测定DNA浓度,OD值为1相当于大约50μg/ml双链DNA。
如用1cm光径,用H2O稀释DNA样品n倍并以H2O为空白对照,根据此时读出的OD260值即可计算出样品稀释前的浓度:
DNA(mg/ml)=50×OD260读数×稀释倍数/1000。
DNA纯品的OD260/OD280为1.8,故根据OD260/OD280的值可以估计DNA的纯度。
若比值较高说明含有RNA,比值较低说明有残余蛋白质存在。
OD230/OD260的比值应在0.4-0.5之间,若比值较高说明有残余的盐存在。
用重蒸水将比色杯冲洗干净,用重蒸水或TE把提取的样品稀释100倍。
将紫外分光光度计的波长设为260nm,以重蒸水或TE做为对照,测定OD值。
OD260=;
DNA的浓度=50OD260稀释倍数=。
将波长换成280nm及230nm,用同一样品再次测定OD值:
OD280=;OD230=;
OD260/OD280=;OD260/OD230=;
结论:
所提取的DNA。
2.电泳鉴定
取样品1μl、电泳缓冲液5μl、6×加样缓冲液1μl(含溴酚蓝和二甲苯青FF指示剂及甘油),混匀,在0.8%琼脂糖凝胶上进行水平板微型电泳,用噬菌体λDNA作为标准。
DNA区带应比较集中,泳动速度与λDNA相同或稍慢,证明分子量均>50kb。
一般见不到泳动速度比溴酚蓝快的RNA区带。
如果DNA不成区带,而是散开分布在λDNA与溴酚蓝之间,则说明DNA已经被降解成小分子,不能再用来进行限制性内切酶图谱分析。
五、注意事项
1.酚抽提时如果上清液太黏,不能和蛋白质分开时,可加入适量STE稀释,然后再用酚抽提。
2.保温可在45~55℃范围内进行。
3.真核生物的DNA分子很大,机械张力极易引起DNA分子的断裂,因此抽提DNA时动作不可过猛;溶液转移次数要尽量减少,而且转移时一定要用粗口径滴管,以防机械力(震动)将DNA分子打得太碎。
4.沉淀DNA时要小心操作,勿使纤维网断成小丝。
5.DNA溶于TE溶液时可先浓一点,发现太浓时再加些TE溶液。
这样能保证DNA样品不至于太稀而无法使用,一般来讲,DNA浓度为0.4~0.6mg/ml最为理想。
6.溶于TE溶液中的DNA样品比较稳定,可在4℃冰箱中存放1年而不会降解。
思考题:
1、我们知道,一条染色体含有一条DNA,基因组中不同的染色体DNA的大小是不同的。
按理来说,所提取的基因组DNA中含有多条大小不一的DNA。
但为什么用琼脂糖电泳后仅能见到一条主带呢?
2、基因组DNA制备过程中提取缓冲液有哪些成分,作用是什么?
3、基因组DNA制备过程中需注意的事项有哪些?
扩展内容
植物基因组DNA的提取
利用液氮对植物组织进行研磨,从而破碎细胞。
细胞提取液中含有SDS裂解细胞,使蛋白质变性沉淀,用酚氯仿抽提除去蛋白,得到的DNA溶液经乙醇沉淀。
一、材料
鲜嫩的水稻幼苗或其它禾木科植物。
液氮,陶瓷研钵,50ml离心管或1.5ml离心管,枪头,药勺。
二、设备
冷冻高速离心机,台式高速离心机,水浴锅,移液器,电泳设备等。
三、试剂
1.提取缓冲液:
100mmol/LTris·Cl,pH8.0;5mmol/LEDTA,500mmol/LNaCl,1.5%SDS,1mol/Lβ-巯基乙醇。
2.RNaseA母液。
3.5mol/LKAc
4.其它试剂:
酚:
氯仿:
异戊醇(25:
24:
1),氯仿,异丙醇,TE缓冲液,70%乙醇,灭菌双蒸水ddH2O。
四、操作步骤:
(一)植物组织裂解液抽提
1.取3-5克嫩叶,剪碎,研钵中加液氮磨成粉状后立即倒入50ml(1.5ml)离心管中,加入20ml(1ml)提取缓冲液,剧烈摇动混匀,60℃水浴保温30-60分钟(时间长,DNA产量高),不时摇动。
2.加入5ml(150ul)5mol/LKAc,颠倒混匀冰浴静置20分钟。
3.室温下5000rpm离心20分钟。
(二)植物基因组DNA纯化
1.取上清液于新离心管,用等体积酚:
氯仿:
异戊醇(25:
24:
1)抽提(在通风情况下操作)。
待分层后,12000rpm离心5分钟。
2.取上清液至干净离心管,加等体积氯仿抽提(在通风情况下操作),12000rpm离心5分钟。
3.仔细移取上清液至另一50ml(1.5ml)离心管,加入1倍体积预冷的异丙醇,混匀,室温下放置片刻即出现絮状DNA沉淀。
4.12000rpm离心5分钟,获得沉淀后,用70%酒精洗涤2-3次,风干沉淀。
(三)植物基因组DNA的溶解、检测和保存
1.在1.5mleppendorf中加入1ml(100ul)TE。
DNA很快溶解于TE。
2.加入5μlRNaseA(10μg/μl),37℃10分钟,除去RNA(RNA对DNA的操作、分析一般无影响,可省略该步骤)。
3.取2μlDNA样品在0.8%Agarose胶上电泳,检测DNA的分子大小。
同时取15μl稀释20倍,测定OD260/OD280,检测DNA含量及质量。
五、注意事项
1.所有用品均需要高温高压,以灭活残余的DNA酶。
2.所有试剂均用高压灭菌双蒸水配制。
3.用大口滴管或吸头操作,以尽量减少打断DNA的可能性。
4.用上述方法提取的DNA纯度可以满足一般实验(如Southern杂交、PCR等)目的。
如要求更高,可参考有关资料进行DNA纯化。
附录1DNA提取史中的重要事件
FricdrichMiescher(1844-1894),瑞士生理学家,有机化学家。
1868年医学院毕业后,在著名的有机化学家Hoppe-Seyle的实验室以浓细胞为材料,研究淋巴细胞的组成。
1869年,他从浓细胞的细胞核中分离出含有大量磷的“核素”,核素即是DNA。
这是人类第一次提取的DNA。
Marmur于1961年建立了用酚和氯仿从生物细胞中分离制备DNA的经典方法。
但是此法的条件比较剧烈,还只能得到分子量为5×106-5×107道尔顿的DNA制品,从六十年代后半期开始,尤其是蛋白酶K的发现,大大促进了真核生物细胞中分离提取高分子量DNA的研究。
在SDS和EDTA的存在下,蛋白酶K仍具有很高的活力,因而可在抑制DNA降解酶活力的条件下用蛋白酶K消化去除蛋白质,为制备高纯度、高分子量的DNA制品创造条件。
附录2试剂准备
1.STE裂解液:
2.5MNaCl4ml,2MTris-HCl(pH8.0)0.5ml,500mMEDTA(pH8.0)0.2ml,加水定容至100ml。
2.酶解液:
200mMNaCl,20mMTris-HCl(pH7.4);50mMEDTA(pH8.0),1.5%SDS。
3.蛋白酶K:
10mg/ml配好后用一次性滤膜过滤,-20℃保存。
4.氯仿:
异戊醇=24∶1
5.Tris饱和酚(pH8.0)酚/氯仿/异戊醇(25:
24:
1)。
氯仿可使蛋白变性并有助于液相与有机相的分开,异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫。
酚和氯仿均有很强的腐蚀性,操作时应戴手套。
6.无水乙醇、75%乙醇,灭菌双蒸水ddH2O
7.RNA酶A母液:
将RNA酶溶于TE配制:
10mmol/LTris·Cl(pH7.5),15mmol/LNaCl中,配成10mg/ml的溶液,于100℃加热15分钟,使混有的DNA酶失活,贮存于-20℃。
冷却后用1.5mleppendorf管分装成小份保存于-20℃。
8.TE:
10mMTris-HCl(pH8.0),1mMEDTA(pH8.0)。
9.TAE电泳缓冲液,50X储存液,pH8.5:
242gTris碱,57.1ml冰醋酸,37.2gNa2EDTA.2H2O,加水至1L;1X工作液:
40mmol/LTr
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