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细胞工程实验指导秦玉芝9115
秦玉芝《细胞工程实验》教案
课程编号073409B
2006-2007年第一学期
2004生物工程学专业
2006-2007学年第1学期2004生工
细胞工程实验
授课人秦玉芝
细胞工程概述
所谓细胞工程,是指以细胞为基本单位进行培养、增殖或按照人们的意愿改造细胞的某些生物学特性,从而创造新的生物和物种,以获得具有经济价值的生物产品。
它主要由两部分构成,其一是上游工程,包含细胞培养、细胞遗传操作和细胞保藏三个步骤。
另一个则是下游工程,是将已转化的细胞应用到生产实践中去,以生产生物产品的过程。
顾名思义,植物细胞工程,当然就是针对植物细胞的细胞工程了,它是细胞工程的一个重要组成部分。
自1904年Hanning成功培养离体胚以来,伴随着相关理论与技术的飞速发展,植物细胞工程也取得了巨大的成就。
现在,我们已经可以利用细胞融合及DNA重组等现代生物技术从细胞和分子水平改良现有品种甚至于组建新品种。
1983年转基因植物问世,并于1986年起被批准进入田间试验,美国APHIS到97年1月31日已批准多达两千五百八十四例田间试验。
不仅如此,一些转基因植物已经开始进行商业化生产。
从1994年Calgene公司的延熟番茄FLAVRSAVRTM成为首例被批准进行商业化生产的转基因作物开始,其后截止至1997年1月,美国已批准十七例,加拿大十八例,澳大利亚四例,日本七例。
我国农业部也已于97年上半年批准了转基因延熟番茄的商业化。
由此可见,植物细胞工程将对我们的生活产生越来越大的影响,我们应对此加以重视,了解一些新的研究成果及新技术,以求在生物工程这个二十一世纪的龙头产业中占有一席之地。
植物细胞工程涉及诸多理论原理及实际操作技术,首当其冲的自然是培养技术,也就是将植物的器官、组织、细胞甚至细胞器进行离体地、无菌的培养。
它是对细胞进行遗传操作及细胞保藏的基础。
此类技术发展起步较早,相对而言已比较成熟,各种培养基制备及很多操作方法已经基本规范化。
针对植物的培养主要有植物组织培养、植物细胞培养、花药及花粉培养、离体胚培养以及原生质体培养这几个大类,每一种都还可可以继续细分为更具体的小类。
组织培养首先将外植体分离出来,然后在无菌及适当条件下培养以诱导出愈伤组织,另外在愈伤组织随外植体生长一段时间后还需要进行继代培养,以避免代谢产物积累及水分散失等因素的影响。
细胞培养可分为悬浮细胞培养、平板培养、饲养层培养和双层滤纸植板几类,它们都是将选定的植物细胞于适当的条件下进行培养,以得到大量基本同步化的细胞,为遗传操作提供材料。
花粉及花药培养主要是使花粉改变正常发育途径而转向形成胚状体和愈伤组织,从而产生单倍体植株。
离体胚培养有幼胚与成熟胚培养两类,通过使用相应的培养基使离体胚正常的萌发生殖,以供研究和操作使用。
原生质体的培养则是一切利用原生质体进行遗传操作的基础,它是将取得的植物细胞去除细胞壁形成原生质体后进行培养,具体方法与细胞培养有一定的相似之处。
作为后继操作的基础,培养技术的选择是非常重要的。
采用适当的培养方法可以更好地进行遗传操作和保存细胞,而错误的选择是有可能影响结果甚至导致试验和生产失败,造成时间和金钱的浪费。
仅仅对细胞进行培养是不够,要使培养的细胞能为人类服务,就要对其进行一定的改造,这就涉及到了细胞的遗传操作。
可以说,遗传操作是整个细胞工程中最为重要也最具挑战性的一环。
它极大的依赖于理论原理、操作技术以及设备的发展。
随着基因组学的发展,各项基因组计划正在紧锣密鼓地进行,由于DNA序列分析方法的革新,诸如高效毛细管自动化测序、DNA芯片法以及大规模平行实测法的应用大大加快了基因组计划的进程。
拟南芥基因组计划将于2004年完成,水稻、番茄和玉米基因组的测序也正在进行。
是类计划所提供的信息将不断定位大量有价值的基因,而最近的研究还表明影响作物产量的可以是单基因的改变而不仅仅是多基因决定。
所有这一切的基础研究都为遗传操作提供了更多、更准确的理论依据。
实验技术的发展则使精确、高效的遗传操作变得更加方便。
将外源DNA导入靶细胞的方法不断完善,除了以前经常使用的质粒载体、病毒载体、转座因子和APC(酵母人工染色体)等途径外,通过lipoplex\polyplex介导、裸DNA、"基因枪"、超声波法和电注射法等非病毒方式转换细胞的方法也开始被广泛的使用;细胞融合方法已被不断的改进,融合率增大;细胞诱变也取得了较大的进展,诱变方式不断增加。
这些理论和技术的发展都为更好的改造细胞创造了条件。
培养或改造好的细胞是进行研究和生产的基本材料,为了使其不致死亡并尽量保持优良的特性,就需要进行适当的保藏。
一般是根据细胞的特点,人工创造条件使其生长代谢活动尽量降低,处于休眠状态,以抑制增殖和减少变异。
作为世界上最大的细胞库,ATCC早在92年就已经有了三千两百多个细胞系入库,而且数量还在不断增加。
此外还有CSH(美)、NCTC(英)、NRRL(英)、KCC(日)等著名的保藏机构,国内也有一些较为大型的机构,足见各国对细胞保藏的重视。
由于植物细胞有其自身的特点,因而其保藏方法不可能与微生物完全相同。
通常采用的方法是液氮超低温保藏方法。
这种方法利用液氮的温度可以达到零下一百九十六是使度,远远低于一般细胞新陈代谢作用停止的温度(零下一百三十摄氏度)从而使细胞的代谢活动停止,化学作用随之消失,达到长期保藏的目的。
操作时要注意从常温到低温的过渡,以使细胞内的自由水通过膜渗出,避免其产生冰晶而损害细胞。
另外还有低温冻藏法及其他一些保藏方法,但多用于短期保藏。
细胞工程的目的,是得到人们所需要的生物产品。
要使已经改造好的细胞产生大量具有经济价值的产物,就必须依靠下游加工过程,也就是我们常说的下游工程。
它的作用就是大量培养细胞,并从培养液中分离、精制出有关的生物化工产品。
由于植物细胞的高度易碎性,对剪切力的敏感、细胞有去分化和聚集作用,增殖时间长等独特性,使其大规模培养技术明显比微生物和动物细胞的发展缓慢。
但通过不懈的努力,现在已经具备在2万升规模的生物反应器中培养烟草细胞的能力。
而日本的三井石化也已经在使用七百五十升发酵罐通过培养植物细胞而生产紫草宁,且产量较高,可满足全日本百分之四十上的需要。
相信随着理论以技术的不断完善,植物细胞的大规模的培养将会很快的成为一种常规的生产手段。
培养后的培养物经过处理后被分离、提纯。
分离和精制过程所需的费用在整个生产过程中的占有很大的比例,一般为百分之六十,有些甚至高达百分之八十至百分之九十,而且还有继续加剧的取向。
因此该过程的落后也可能阻碍细胞工程的发展。
世界各国现在已经都比较重视这个问题,英国早在83年就发起了生物分离计划(BIOSEP),专门研究分离与精制,我国也曾经召开过专门会议。
分离与精制的困难是由于培养液自身的理化特性所决定,这就需要在上游工程时就考虑到这方面的问题,同时不断推出新的分离纯化技术及方法,从而简化过程、降低成本,这在实际生产中是很重要的。
诚然,细胞工程的伟大和神奇确实令人惊叹不已,但随着这一类技术的迅猛发展,基因产品的广泛应用,其安全性已引起了人们的广泛关注。
虽然从本质上来讲,转基因植物和常规育成的品种是一样的,两者都是在原有品种的基础上对其一部分进行修饰,或增加新特性,和消除原来的不利性状,但是,以前所用的有性杂交仅仅局限于种类和近缘种之间,而转基因植物却大胆突破了这一局限,其外源基因可以来自植物、微生物甚至动物。
在这种情况下,人们对可能出现的新组合、新性状是否会影响人类健康和生物环境还缺乏足够的认识和经验。
至少从目前来说,我们还不可能很精确的预测某一个外源基因在新的遗传背景中会产生什么样的相互作用。
并且,转基因植物还可以对它所在的环境产生一定的影响。
比如现在应用最多的抗除草剂基因就可能通过同属野生植物异花传粉而逐渐扩散进入自然界,从而使杂草的控制变得更加困难;而抗虫、抗病基因也有可能通过类似的途径转移到环境,给野生种群带来选择优势而变得无法收拾。
虽然现在一般通过生殖隔离(设置缓冲作物带和隔离区)来防止基因漂流至临近作物,但若进行大规模生产和推广时就会难于加以控制。
另外,转基因作物还可能造成对微生物的影响,Hoffman等就曾发现转基因油菜中的基因可转至黑曲霉中,虽然机制还不明确,但至少存在这个事实。
自然界中存在着植物病毒间异源重组,病毒的异源包装(转移包装)可以改变其宿主范围。
转基因植物表达的病毒外壳蛋白在体外实验中可以包装入侵的另一种病毒的核酸,产生一种新病毒,虽然在小规模的田间实验中并未发现这种情况,但长期的大规模生产应用中是否也是怎样呢?
此外,公众对转基因植物的接受性和标签问题得到也是我们应该考虑的问题。
由此可见,细胞工程是一柄双刃剑,在造福于人类的同时也可能毁灭人类,甚至整个地球。
这就要求我们在大力发展的同时注意其安全性,不断完善理论以技术,使其更好地为人类服务。
1.细胞工程基础实验技术
1.1实验目的
使学生了解培养基母液的配制方法和注意事项;掌握培养的配制及灭菌方法,为植物愈伤组织诱导实验准备培养基。
1.2器皿洗涤
玻璃器皿洗涤:
新的玻璃器皿上附有游离的碱性物质,其洗涤方法是用1%的HCl溶液浸泡一昼夜,再用合成洗涤剂洗刷,然后用清水反复冲洗,最后用蒸馏水冲洗1~2次,干燥后即可使用。
已使用过的试管、烧杯、三角瓶等的洗涤方法是,先将器皿中的残渣除去,用清水洗净,再用合成洗涤剂洗刷,用清水冲洗干净,最后用蒸馏水冲洗1~2次。
用过的吸管、滴管等内径狭小的玻璃制品,需先放入铬酸洗涤液中浸泡两小时以上,取出后经流水冲洗半小时左右,再用蒸馏水冲洗1~2次,然后烘干或晾干。
载玻片和盖玻片容易破碎,洗涤时不宜用力擦洗,其洗涤方法是先用清水冲洗,然后放入铬酸洗涤液中浸泡几小时或用稀铬酸洗涤液煮沸半小时,取出后用清水冲洗干净,将其储藏在95%的酒精中。
塑料用品洗涤:
塑料用品一般用合成洗涤剂洗涤,因其附着力较强,因此冲洗时必须反复多次,最后用蒸馏水冲洗。
金属用品洗涤:
金属用品一般不宜用各种洗涤液洗涤,需要清洗时,一般用酒精擦洗,并保持干燥。
1.3培养基配制
1.3.1母液配制
为工作方便起见,常用培养基通常先按配方配制成浓度高于实际使用浓度若干倍的母液,使用时按按比例稀释即可。
一般大量元素配制成10-20倍母液,微量元素和其它成分配制成100-200倍母液。
常用的MS培养基母液配制见附表。
配好的母液需贮存于2~4℃的冰箱中,定期检查有无沉淀和微生物污染,如果出现沉淀或微生物污染,则不能使用。
1.3.2植物激素配制
植物激素一般配制成浓度为0.1~1.0mg/ml的溶液,贮存在2~4℃下备用。
由于多数激素难溶于水,一般按以下方法配制。
IAA:
先用少量95%乙醇使之充分溶解,再加蒸馏水定容至需要浓度的体积。
NAA:
可溶于热水中,也可采用与IAA同样的方法配制。
2,4-D:
先用少量1N的NaOH溶液充分溶解,然后缓慢加入蒸馏水定容至需要浓度体积。
细胞分裂素类:
KT和BA等细胞分裂素类物质均溶于稀盐酸,应先用少量1N的HCl溶解后再稀释至需要浓度。
赤霉素:
赤霉素的水溶液稳定性较差,一般用95%的乙醇配制成5~10mg/ml的母液低温保存,使用时再稀释。
1.4实验用品及溶液
实验按每4个学生一组,每组分发培养基母液及激素母液一套,50ml量筒、1000ml有刻度烧杯、吸球、电炉各1个,5ml
移液管9支,50ml三角瓶20个。
公用设备:
pH计,高压灭菌锅。
1.5操作方法
实验按500ml容量一组配制培养基,保证下一次实验每一学生有5瓶培养基供接种用。
愈伤组织诱导培养基:
MS+2.4-D2.5mgl-1+Sucrose20g-1+Agar7g-1
A.向容量瓶中顺序加入培养基母液:
大量元素25ml微量元素2.5ml铁盐2.5ml其它成分各2.5ml
2.4-D 终浓度为2.5mg/L
B.加入实际配制培养基体积约2/3-3/4的蒸馏水,加入10g蔗糖后搅拌使其溶化,用0.5N的NaOH和0.5N的HCl调整pH至5.8-6.0。
C.加入3.5g琼脂,将烧杯置于电炉上,搅拌加热使琼脂完全溶化,然后用蒸馏水定容至终体积500ml,继续加热几分钟使之混合均匀后分装于三角瓶中。
用记号笔写上学号或姓名。
D.分装好的培养基置于高压蒸汽灭菌锅中灭菌,灭菌条件为温度121℃,压力1.1kg/cm2,灭菌时间20min.左右。
灭菌后的培养基置于无菌室保存备用。
(如培养器皿为培养皿.培养基用之前最好吹干约1-2小时,即把盖子上的水珠吹干即可)
1.5灭菌方法介绍
培养基灭菌分装好的培养基置于高压蒸汽灭菌锅中灭菌,灭菌条件为温度121℃,压力1.1kg/cm2,灭菌时间灭菌时间与培养基容量的关系见下表。
如果使用人工控制的灭菌锅,必须注意灭菌温度的稳定控制,因为温度过高会引起培养基成分和pH的改变,而温度过低则会造成灭菌不彻底。
灭菌后的培养基室温下最好在1~2周内用完,特殊情况可贮存于4℃下1个月左右。
玻璃器皿灭菌,可任选湿热和干热灭菌方法灭菌。
湿热灭菌条件与培养基灭菌条件一致,但要适当延长灭菌时间,一般以25~30分钟为宜。
湿热灭菌后器皿和包装表面常常有水蒸气覆盖,如果不及时干燥常常容易微生物的再侵染,因此,器皿灭菌后应及时放入净化工作台上吹干。
干热灭菌即在烘箱中加热至160~180℃后恒温保持40分钟,或120℃灭菌2小时。
玻璃器皿放入烘箱之前必须完全干燥,以免引起破碎,灭菌时温度要缓慢上升,灭菌后待温度逐渐下降到60℃以下时才能开箱门,以免器皿因突然冷缩而破碎。
镊子、剪刀、解剖刀、接种针等金属制品灭菌,镊子、剪刀、解剖刀、接种针等金属制品使用前和使用过程中均必须灭菌并保持无菌状态。
使用前的灭菌可采用干热灭菌。
使用过程中的灭菌通常是将其浸泡在70%的酒精中,再以火焰将酒精烧去,待冷却后使用。
也可使用一种小型电热石英砂灭菌器,代替酒精灯,每次使用完后,将用具插入消毒器的中消毒,用时取出冷却。
培养基体积与灭菌时间的关系
培养基体积(ml)
灭菌温度(℃)
灭菌时间(min.)
20-50
121
20
50-500
121
25
500-5000
125
35
不同内型灭菌设备的使用方法;采用高压蒸气灭菌器对培养基进行灭菌
外植体灭菌与接种
胡萝卜营养根切片
胡萝卜营养根由外向内依次分为皮层、形成层和中轴三部分。
在切片消毒之前首先除去皮层的最外层,以减少胡萝卜营养根的带菌量。
形成层的分生能力最强,是产生愈伤组织的主要部分,因此在切片时应使每一个切片上都有形成层。
具体操作方法和步骤如下:
胡萝卜的截面图沿图中竖线切开沿图中竖线切成
首先沿横线把胡萝卜段切开两边部分弃去(如图)切片,每片厚0.5-1mm
图—1胡萝卜营养根切片的制作
A.选取生长正常、无病虫危害的组织材料,除去多余部分后将材料整理成适当的大小放入烧杯中。
特别不洁的材料则应先行用自来水冲洗。
B.用70~75%的乙醇处理材料0.5~1min.,立即除去乙醇。
C.然后在烧杯中加入消毒剂(建议使用次氯酸钠或饱和漂白粉溶液),同时滴1~2滴土温20,将烧杯置于摇床上振荡10~15min。
如材料污染较严重或组织较老,可适当考虑延长灭菌时间。
D.将烧杯置于净化工作台上,弃去消毒液,用无菌水洗3~4次,每次1min。
E.灭菌后的材料可置于垫有无菌纸的培养皿中备用。
需要注意的是,灭菌后的材料应立即接种培养,否则会造成二次感染,同时对于茎芽、花等组织材料,灭菌后若不立即接种培养,即会影响其生活力而使培养失败。
从灭菌处理完成后进入净化工作台操作开始,操作人员必需严格按无菌操作规则完成以后的步骤,否则会造成外植体污染
思考题:
1、 配制母液时为什么要按顺序加入各药品?
溶解CaCl2·2H2O时,为什么要将蒸馏水加热?
2、 根据所给母液浓度、蔗糖、琼脂用量、pH值,按给出的培养基配方计算各种母液吸取量,填入下表。
培养基配方:
MS+KT1.0+BA2.0+NAA0.2+蔗糖3%+琼脂0.7%,pH5.8。
表6按上述配方计算各种母液吸取量并填入下表
药品名称
母液浓度
1L培养基母液吸取量
0.3L培养基母液吸取量
大量元素
10倍液
微量元素Ⅰ
100倍液
微量元素Ⅱ
1000倍液
铁盐
100倍液
VB1
0.4mg/ml
VB6
0.5mg/ml
烟酸
0.5mg/ml
Gly
1mg/ml
肌醇
20mg/ml
BA
0.5mg/ml
KT
0.5mg/ml
NAA
0.5mg/ml
蔗糖
琼脂
PH值
5.8
3、接种后污染调查
2种胚的离替培养及愈伤组织诱导技术
2.1实验目的
基本掌握植物愈伤组织诱导培养技术和调控条件
实验准备:
材料水稻成熟种子去壳(或取胚)。
实验课开始前30min.将实验用具用75%酒精擦洗后连同培养基置于超净工作台,打开超净工作台风机和紫外灯。
无菌培养皿每学生2套。
2.2实验材料及设备
外植体材料:
水稻种子(种胚/灌浆期);实验1配制的培养基。
设备及工具:
超净工作台;不锈钢镊子、剪刀、解剖刀、酒精灯等;75%酒精。
2.3操作方法
A.在自来水管下将手洗净,然后用75%酒精将手消毒,再进入超净工作台开始接种操作。
B.点燃酒精灯,将镊子、解剖刀在酒精灯下烤干。
C.将水稻成熟种子去壳,经70%酒精处理1分钟后,用0.1%的氯化汞浸泡并放入摇床以200转/分速度振荡30分钟,再用无菌水漂洗3遍。
将消毒过的稻种分别接种倒不同的培养基上,快速封好瓶口,用记号笔写上姓名和接种日期。
26℃±2℃暗培养,4周后计算愈伤组织诱导率:
愈伤组织诱导率=产生的愈伤组织米粒数/接种的米粒数×100%
2.4记载内容
培养基凝固状况;实验操作过程;种子的状况;每瓶接种数、接种总瓶数。
3.植物离体培养中形态观察与继代培养
3.1实验目的
观察植物离体培养过程中形态变化并进行形态描述
3.2实验过程
观察实验1愈伤组织诱导结果:
统计愈伤组织诱导率;结合理论学习进行分析。
将诱导出的愈伤组织进行继代培养,方法同实验2。
思考题
1、接种后污染调查
观察接种后2~5天的污染情况,填入下表:
观察日期
接种日期
接种数
污染数
污染率
主要污染菌种
4.植物细胞悬浮培养技术
4.1实验目的
1.掌握植物悬浮细胞系建立的方法,原理。
2.学会对悬浮细胞进行细胞记数及绘制细胞生长曲线。
4.2实验原理
植物离体培养可产生愈伤组织。
将疏松型的愈伤组织县浮在液体培养基中并在振荡条件下培养一段时间后,可形成分散县浮培养物。
良好的县浮培养物应具备以下特征:
(1)主要有单细胞和小细胞团组成;
(2)细胞具有量盛的生长和分裂能力,增殖速度快;(3)大多数细胞在形态上应具有分生细胞的特征,它们多呈等径形,核一质比率大,胞质浓厚,无液胞化程度较低。
要建成这样的县浮培养体系,首先需要有良好的起始培养物——迅速增殖的疏松型愈组织。
然后经过培养基成分和培养条件的选择,并经多次断代培养才能达到。
县浮培养细胞经长期继代培养后,染色体常有变异现象,细胞的再生能力也有逐渐降低的趋势,然而对于以上生产有用代谢特质为目的的大量培养,这种再生能力的降低不一定有不良影响。
4.3实验步骤
4.3.1实验准备:
培养基配方:
MS无机盐附加烟酸0.05mgL-1、VB6和VB1各0.01mgL-1、甘氨酸3mgL-1、肌醇100mgL-1、激动素0.2mgL-1、2,4—D0.1mgL-1、蔗糖20gL-1,pH5.8。
用MS培养基配置2%的果胶酶并用过滤灭菌器过滤;配置液体培养基分装于100ml的三角瓶中,每瓶25ml。
实验材料:
水稻种子在黑暗条件下培养形成的愈伤组织,经过1-2次增殖培养后用于悬浮细胞系的建立。
4.3.2操作方法
1.用镊子夹取出生长旺盛的松软愈伤组织,放入三角瓶中并轻轻夹碎。
每100ml三角瓶含灭过菌MS培养基10~15ml,每瓶接种1~1.5g愈伤组织,以保证最初培养物中有足够量的细胞。
2.将已接种的三角置于旋转式摇床上。
在100r/min,25~28℃条件下,进行振荡培养。
3.经6~10天培养后,若细胞明显增殖,可向培养瓶中加新鲜培养基10ml,必要时,可用大口移液管将培养物分装成两瓶,继续培养。
(若细胞无明显增殖,可能是起始材料不适当,应考虑用旺盛增殖期的愈伤组织重新接种)。
可进行第一次继代培养。
4.悬浮培养物的过滤:
按“3”法继代培养几代后,培养液中应主要由单细胞和小细胞团(不多于20个细胞)组成。
若仍含有效大的细胞团,可用适当孔径的金属网筛过滤,再将过滤后的县浮细胞继续培养。
5.细胞计算。
取一定体积的细胞县液,加入2倍体积的8%的三氧化铬(CrO3),置700C水浴处理15min。
冷却后,用移液管重复吹打细胞悬液,以使细胞充分分散,混匀后,取一滴县液置入血细胞计数板上计数。
6.制作细胞生长曲线:
为了解县浮培养细胞的生长动态,可用以下方法绘制生长曲线图:
(1)鲜重法(freshweighmethod)
在转代培养的不同时间,取一定体积的悬浮细胞培养物,离心收集后,称量细胞的鲜重,以鲜重为纵座标,培养时间为横座标,绘制鲜重增长曲线。
(2)干重法(dryweighmethod)
可在称量鲜重之后,将细胞进行曲烘干,再称量干重。
以干重为纵坐标,培养时间为横坐标,绘制细胞干重生长曲线。
上述两种方法均需每隔2天取样一次,共取7次,每个样品重复三次,整个实验进行期间不再往培养瓶中换入新鲜培养液。
7.细胞活力的检查。
对于初学者,往往需要检测活细胞的比率。
可在培养的不同阶段,吸取一滴细胞县液,放在载玻片上,滴一滴0。
1%的酚藏花红溶液(用培养基配制)染色,在显微镜下观察。
几活细胞均不着色,而死细胞则很快被染成红色。
也可用0。
1%荧光双醋酸酯溶液染色,凡活细胞将在紫外光诱发下显示蓝绝色荧光,有经验的操作者,则可根据细胞形态,胞质环流判别细胞的死活。
8.细胞再生能力的鉴定:
为了解悬浮培养细胞是否仍具有再生能力,可将培养细胞转移到琼脂固化的培养基上,使基再形成愈伤组织,进而在分化培养基上,诱导植株的分化。
4.4注意事项:
1.上述步骤均灭菌操作,培养基、用具、器皿等要高压灭菌后方可使用。
2.如培养液混浊或呈现乳白色,表明已污染。
3.每次继代培养时,应在倒置显微镜下观察培养物中各类细胞及其它残余物的情况以有意识地留下圆细胞,弃去长细胞。
思考题
1、 研究细胞悬浮培养的意义何在?
挑选愈伤组织进行悬浮培养需注意什么问题?
2、 建立细胞悬浮系的步骤包括哪些?
一个良好的悬浮细胞培养体系应该具有什么样的特征?
5.显微计数
5.1实验目的
学习并掌握细胞显微计数的基本方法。
5.2细胞显微计数器工作原理
利用血球计数器在显微镜下直接计数是一种常见的微生物计总数的方法。
因为计数器载片和盖片间的容积一定,所以可以根据显微镜下观察到的微生物数目来计算单位体积内微生物总数。
血球计数器是一只特制载玻片。
载片上有两个方格网,每一方格网共分九个大方格,其中间的一个大方格
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