基于纳米复合材料的应用.docx
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基于纳米复合材料的应用
摘要
目的药物敏感性试验简称药敏试验,旨在了解病原微生物对各种抗生素的敏感程度,指导临床合理选用抗生素的种类和用量,以做到利用药物对疾病进行更加准确的治疗。
由于在实践操作中所进行的各种标准药敏试验的周期较长,一般需要耗用几十个小时,且操作过程较复杂,需要有经验的专业实验人员进行反复验证。
因此,建立灵敏、快速和操作简单的药物敏感性试验方法在科研应用方面具有非常重要的意义。
本研究以普鲁士蓝(PB)为光学探针,大肠埃希氏菌(E.coli)为模型微生物所构建一种新型的光学体外药敏试验方法,用于快速的检测出药物有效性及筛选出抗菌新化合物,弥补现有的方法缺陷。
方法实验以K3[Fe(CN)6]为电子受体,定量转移微生物呼吸作用所产生的电子,自身被还原为K4[Fe(CN)6],与后续加入的FeCl3反应生成普鲁士蓝(PB)。
当微生物的活性受到抑制时,其呼吸作用会减弱,相应生成的PB的量也会减少。
因此,可通过700nm处测定PB的吸光度确定受试微生物活性变化。
通过考察[Fe(CN)6]4-的生成量,确定体系的稀释倍数和FeCl3的加入量;通过考察吸光度值与E.coli固定时间的关系,确定氧化石墨烯(GO)固定E.coli的最佳时间;通过比较固定化E.coli在Luria-Bertani(LB)培养基和磷酸缓冲溶液中活性随存储时间的变化趋势,确定最佳存储条件;根据吸光度值的变化,将最优条件下制备的GO固定E.coli颗粒用于检测阿米卡星、庆大霉素、左氧氟沙星、万古霉素、头孢噻肟钠5种抗生素的有效性。
结果4h培养时间内,45mmol/LK3[Fe(CN)6]足够用于转移微生物呼吸作用产生的电子,但生成的K4[Fe(CN)6]量过多,导致生成的PB沉淀,因此应在加入FeCl3之前,将培养液稀释至5mmol/L。
当固定时间为16h时,以具有表面GO结构的石墨颗粒为载体的E.coli固定效果最好。
培养相同的时间,在PBS中保存的GO固定E.coli的吸光度值比其在培养基中保存时的吸光度值小。
以GO固定E.coli为受体的光学方法进行药物的有效性检测中,抗生素对菌体活性的影响与接触时间和抗生素种类相关。
阿米卡星、庆大霉素、左氧氟沙星和头孢噻肟钠均可对E.coli产生明显抑制作用;相比之下,万古霉素的作用较弱。
结论与一般的药物有效性检测方法不同,在优化条件下的基于GO固定E.coli的PB光学检测方法更加简便、快捷、低耗、价廉,同时具有较好的灵敏度。
所以,该方法在抗菌类药物的检测和临床诊断方面具有一定的应用潜力。
关键词:
药敏实验;普鲁士蓝;光学方法;抗生素;药物有效性
ABSTRACT
ObjectiveThedrugsusceptibilitytestreferredtoasthedrugsensitivitytest,whichisdesignedtounderstandthesensitivityofpathogenicmicroorganismtovariousantibioticsinordertoguideclinicalrationalselectionofthetypesanddosageofantibiotics.Sothedrugsusceptibilitytestensuresamoreaccurateuseofdrugtotreattheobjectivedisease.However,thetestingcycleofvariousstandarddrugsusceptibilitytestsaresolong,evenspendingdozensofhours.Otherwise,thestandarddrugsusceptibilitytestisoftenneedingcomplexoperationsandprofessionalstorepeatedlyverifytheaccuracyofthetestresults.Therefore,establishmentofarapid,sensitiveandsimpledrugsusceptibilitytestisofgreatsignificantinscientificresearchandapplication..Thisstudyappliesacommondye-Prussianblue(PB)asaopticalprobeandEscherichiacoli(E.coli)asamodelmicroorganismtobuildanovelopticaldrugsusceptibilitytestinvitroforrapiddetectionofdrugeffectivenessandscreeningofnewantibacterialcompounds.Weexpectthatthisnovelmethodismakingupthedefectsofexistingdrugsusceptibilitytest.MethodsInourtest,K3[Fe(CN)6]thatwasasaelectroncarrierwasusedtotransfertheelectronsfrombacterialrespiration.ThenreductionproductofK4[Fe(CN)6]wasmixedwithanadditionofFeCl3togenerateprussianblue(PB).Thebacterialrespirationshouldbeweakenedwhenthebacterialactivitieswereinhibited.SotheproductionofPBwasreduced.Therefore,thebacterialactivitiescouldbemeasuredatPBabsorbanceof700nm.Productionof[Fe(CN)6]4-wasstudiedtoensureasuitabledilutionrationofoursystemandadditionalconcentrationofFeCl3.TherelationshipbetweenabsorbancevalueandimmobilizedtimewasstudiedtoscreenanoptimumimmobilizedtimeofE.colionGO.Twodifferentstoredmethods,suchasLuria-Bertani(LB)cultureandphosphoricacidbuffersolution,wererespectivelystudiedtoscreenanoptimumstoredcondition.Finally,ouroptimumconditionswereusedtoprepareGOimmobilizedE.colifordetectingtheeffectivenessesofantibiotics,suchasamikacin,gentamicin,levofloxacin,vancomycinandcefotaximesodium.ResultsK3[Fe(CN)6]of45mmol/Lwasenoughtotransferallelectronsfrombacterialrespirationwithin4hincubationtime.ButtheproductionofK4[Fe(CN)6]wastoomanytoproducestablePBsolution.SotheincubationcultureshouldbedilutedandensuredthecontentofK4[Fe(CN)6]of5mmol/LbeforeadditionofFeCl3solution.TheoptimumimmobilizedtimeofE.coliwas16hwhenthegraphiteparticleswasmodifiedwithGOstructureonitssurface.Atthesameincubationtime,thePBabsorbanceproducedbyrespirationofE.colithatwasstoredinthePBSwaslowerthanE.colithatwasstoredintheLBculture.TheGOimmobilizedE.coliwasastestingmodeltoapplyintotestofdrugeffectivenesswithopticalmethod.Allresultsshowedthattheeffectivenessesofantibioticsonthebacterialactivitieswererelatedtothecontacttimeandthekindsofusedantibiotics.Theantibioticsofamikacin,gentamicin,levofloxacinandcefotaximesodiumallshowedobviouslyinhibitionsontherespirationofE.coli.Comparingwithotherfourkindsofantibioticsmentionedabove,theeffectivenessofvancomycinwasweaker.ConclusionItwasdifferentfromgeneraldrugeffectivenessdetectionmethod,thePBopticaldetectionmethodwithGOimmobilizedE.coliwassimpler,lowerconsumption,rapiderandcheaper,wellwithgoodsensitivity.Soourstudyhasacetrainpotentialinthedetectionandclinicaldiagnosisofantibacterialdrugs.
Keywords:
Drugsusceptibilitytest;Prussianblue;Opticalmethods;Antibiotics;Drugeffectiveness
前言
随着抗菌药物在我们日常生活中的广泛使用,导致越来越多的细菌开始对药物产生耐药性,给由细菌导致的疾病的治疗带来了非常大的困难。
目前致病性耐药菌已成为大家广泛关注的一个问题,要解决这一严峻的问题不仅需要我们有不乱使用抗生素的意识,同时也需要研发出新的更有效的抗生素开对抗细菌以及耐药菌。
但是现在生产抗生素的技术发展非常的缓慢,相关的研究也不是很规范,达不到现在医药生产企业对药品生产效率的要求,影响了企业对新药的研发进程。
研发新药时需要建立药物量-效曲线关系模型以及确定所治疗疾病。
研发抗菌药物,确定目标疾病与筛选微生物和剂量确定是分不开的。
测药物对微生物抑制作用的大小所用的方法为药物的敏感性实验,他是估计药物对细菌抑制作用的比较方便的方法,且由于其具有较好的准确度和重复性,所以被用于初期筛选新药以及监测抗菌药物疗效和检测细菌耐药性。
在对药物进行敏感实验时宜用阴性对照的方法,但是近年来在药物的提取,合成以及后来的药物敏感性检测中有较大量的使用,所以一般的阴性对照试验对药敏实验的安全和准确已不能保障。
新药的研发除了需要时间,大量的人力物力,还要克服成功率低,具有相对较高的风险,周期和投入等实际问题。
现在纸片扩散法仍然是作为抗菌药物进行有效性检测的体外测试方法,但纸片扩散法的实验周期相对较长,需要消耗大量的试剂且需要专业的工作人员操作,给药物的研发增加了很多的任务。
因此我们需要寻找能克服上述缺点的一种方法来完成对临床进行药效监测和研发新的抗菌药。
例如,PCR技术。
这些新的药敏实验方法能够更快速,更灵敏的获取耐药性微生物的信息。
虽然新型的药物检测方法相对于传统方法在灵敏度、准确度方面有优势,但是新型的药敏实验方法需要更高的实验费用。
本实验采用光学方法,以铁氰化钾做为反应体系,通过微生物的呼吸作用使之发生电子转移生成亚铁氰化钾,然后根据其与三氯化铁生成普鲁士蓝进行光学检测。
通过探究微生物使用的浓度,培养的时间以及所给的营养物质对灵敏度的影响确定适宜的检测条件。
并应用哌拉西林、阿莫西林、庆大霉素、阿米卡星和左氧氟沙星5种常见抗生素对20株E.coli临床分离物的实际检测。
然后与传统的药物敏感性实验结果进行比较。
实验部分
1仪器和试药
1.1材料和试剂
磷酸氢二钠天津市瑞金特化学品有限公司,磷酸二氢钾天津市博迪化工有限公司,硼酸沈阳市联邦试剂厂,无水碳酸钙天津永晟精细化工有限公司,葡萄糖北京化工厂,铁氰化钾天津博迪化工股份有限公司,谷氨酸,盐酸左氧氟杀星氯化钠注射液黑龙江科伦制药有限公司批准文号:
国药准字H20055367,硫酸庆大霉素注射液河南润弘制药股份有限公司批准文号H41020318,硫酸阿米卡星注射液江苏吴中医药集团有限公司苏州制药厂批准文号H32021408,注射用盐酸万古霉素浙江医药股份有限公司新昌制药厂批准文号H20033366,头孢噻肟钠哈药集团制药总厂批准文号H23021721,3,5-二氯苯酚(DCP)沈阳市联邦试剂厂。
实验用的E.coli来自于锦州医科大学附属一院,经活化后用15%甘油置冰箱中冷冻保存。
1.2溶液配制
Luria-Bertani(LB)培养基:
胰蛋白胨10.0gL-1,酵母粉5.0gL-1,NaCl10.0gL-1,用0.1molL-1NaOH调节pH至7.4±0.2,120°C灭菌20min,待用。
PBS:
0.12molL-1Na2HPO4,0.08molL-1KH2PO4。
GGA:
葡萄糖150mgL-1,谷氨酸150mgL-1。
K3[Fe(CN)6]储备液:
采用去离子水配制330mmolL-1K3Fe(CN)6,实验当天使用。
1.3实验仪器
电化学工作站820C才华仪器有限公司,CJJ79-1磁力加热搅拌器,电子天平沈阳龙腾电子有限公司;压力蒸汽灭菌器上海申安医疗器械厂;721紫外分光光度计上海欣茂仪器有限公司;洁净工作台SW-CJ-1E(洁净等级100级)上海博迅实业有限公司。
2方法和结果
2.1石墨烯颗粒的制备
GO不仅具有很好的电子传导速度(1000m/s),其结构和组成的特殊性也使得该材料的光学性能、生物相容性和机械强度等性质较为优越,所以在生物传感领域应用广泛。
本文通过制备具有表面GO结构的载体,固定E.coli,用于开发抗生素类药物有效性检测的光学微生物传感技术。
准确称取150g石墨棒将其切成15cm左右长度放置于500mL中,用量筒准确量取200mL浓硫酸,将其缓慢倒入烧杯中浸没石墨棒,充分反应20min。
准确称取NaNO2和KMnO4各5g备用。
先将NaNO2投入石墨棒-浓硫酸反应体系中,并迅速转移至冰水浴中保存;投入已准备好的KMnO4,用玻璃棒持续搅拌。
待石墨棒表面出现大量的孔隙且搅拌费力时,立即将烧杯放入温水浴中1min,再转移至80℃的水浴锅中,直至烧杯壁上有大量的气泡附着时,加入200mL的去离子水停止反应。
加入10%盐酸后,将表面具有大量GO结构的石墨棒趁热过滤,并用去离子水洗涤数次至无SO42-为止。
将表面具有大量GO结构的石墨棒封入透析袋,置于装有去离子水的大烧杯中浸没,隔两小时换一次水,并用pH试纸测定其酸碱度。
待pH近中性,取出短棒,放入恒温摇床于37℃烘干后,切成3cm左右的颗粒置于烧杯中备用。
2.2GO固定大肠杆菌颗粒的制备
在无菌条件下将0.2mLE.coli菌种接种到已灭菌的300mLLB培养基中后,向培养基中投入切粒整齐的具有表面GO结构的石墨颗粒,以灭菌锡纸封口,并置于恒温摇床中培养。
达到预定培养时间后,以灭菌药匙捞出GO固定E.coli颗粒,备用。
2.3电化学方法测试[Fe(CN)6]4-的浓度
新鲜配330mmol/LK3[Fe(CN)6]储备液并将其存放在冰箱里保存,取4支1mL心管分别加入0.1mL的45mmolL-1的K3[Fe(CN)6]溶液,0.1mL的220mgL-1的GGA溶液,然后用新鲜配置的PBS溶液将其稀释至1mL。
向4支小离心管中分别投入已经18h培养的GO固定E.coli颗粒后,置于37°C的恒温摇床中培养,分别于1h、2h、3h和4h一管进行测试。
根据前人研究表明,E.coli呼吸作用所产生的电子可通过Fe(CN)63-转移至微生物体外,同时[Fe(CN)6]3-转变成[Fe(CN)6]4-,因此可采用电化学工作站结合计时电流法检测培养液经不同培养时间所含[Fe(CN)6]4-的量。
置外加电压为450mV,工作电极为Pt微阵列电极,参比电极为Ag/AgCl(饱和KCl)电极,对电极为铂电极,响应时间为15s
如下图2.3a所示,随着培养时间的增加,极限电流值也在不断增大,说明培养液中所含的[Fe(CN)6]4-的量在不断增加。
以5mmol/LK4[Fe(CN)6]的极限电流值为参考,计算不同培养时间时,培养液中所含[Fe(CN)6]4-的浓度(图2.1b)。
当培养时间分别为1h、2h、3h和4h时,所测得的电流值分别为3.202e-8A、7.969e-8A、9.832e-8A、12.62e-8A,5mmol/LK4[Fe(CN)6]的电流值为2.000e-8A,由比例关系可求得相对应时间内因微生物呼吸作用产生[Fe(CN)6]4-的浓度分别为8.004mmol/L、19.92mmol/L、24.58mmol/L、31.55mmol/L。
因K4[Fe(CN)6]与FeCl3反应所生成普鲁士蓝的摩尔比为1:
1,所以可根据上述计算结果得出需要加入的FeCl3量。
但根据实验结果,当加入FeCl3的浓度超过5mmol/L时,普鲁士蓝絮凝,因此应适当稀释含有[Fe(CN)6]4-的培养液后再加入FeCl3,使之生成稳定的普鲁士蓝溶液。
Fig2aThecurveofrelationshipbetweenincubationtimeandlimitingcurrent
图2a培养时间和计时电流的关系曲线
Fig2bThecurveofrelationshipbetweenincubationtimeandpotassiumferrocyanideconcentration.
图2b培养时间和亚铁氰化钾浓度的关系曲线
2.4筛选GO固定E.coli的最佳反应时间
在无菌条件下将0.2mLE.coli菌种接种到已灭菌的300mLLB培养基中后,向培养基中投入切粒整齐的具有表面GO结构的石墨颗粒,以灭菌锡纸封口,并置于恒温摇床中培养6h、8h、10h、12h、16h、18h、20h和24h。
达到培养时间后,以灭菌药匙捞出GO固定E.coli颗粒,备用。
将已固定细菌的GO颗粒置于由0.1mL、0.15g/LGGA溶液,0.1mL、0.045mol/LK3[Fe(CN)]6溶液以及0.8mLPBS溶液所组成的培养液中反应1h。
PBS溶液是由0.12mol?
L-1Na2HPO4以及0.08mol?
L-1KH2PO4配制而成。
根据2.3实验结果,制备普鲁士蓝溶液前应对培养液适当稀释:
用枪头精确吸取培养液0.2mL,加入1mL的去离子水稀释,然后加入新鲜配置的0.08mol/L的FeCl3溶液2mL,摇匀,生成普鲁士蓝。
利用紫外分光光度计于700nm处测定普鲁士蓝的吸光度,因普鲁士蓝的生成量与微生物的活性成正比关系,因此可根据所测得的吸光度值筛选GO固定E.coli的最佳反应时间。
实验数据如图2.3所示,随着培养时间的增加,吸光度值也在增加;当培养时间为18h时,其吸光度值达到最大;当培养时间大于18h时,其吸光度值随着培养时间的增加而下降,应是由于E.coli逐渐增加,培养物质逐渐匮乏而导致菌体活性下降所致。
所以由实验可得,采用表面氧化技术制备的GO颗粒固定E.coli的最佳生长时间为18h,后续实验中均采用18h作为固定化时间。
Fig2.4ThecurveofabsorbancevaluechangesdependingontimespendofGOimmobilizedE.coli
图2.4吸光度值随GO固定E.coli的反应时间变化曲线
2.5不同的保存条件对E.coli活性的影响
将已经18h培养,收获的GO固定E.coli颗粒分别置于已灭菌的PBS溶液或原培养基中保存,用于保存的溶液必须完全浸没GO固定E.coli颗粒。
分别于保存的1d-10d无间断的在两种保存条件下各随机选取4粒GO固定E.coli颗粒作为测试对象,采用如2.4所述光学方法检测E.coli的菌株活性。
实验的结果如图2.5-1和2.5-2所示,同一保存条件下,吸光度值随着在K3[Fe(CN)]6体系中培养时间的延长而增加,说明增加培养时间可有效提高[Fe(CN)]64-的生成量;虽然经相同的K3[Fe(CN)]6体系培养1h、2h、3h和4h,但随着存储时间的增加,采用不同存储方式的GO固定E.coli颗粒产生的[Fe(CN)]64-的量均明显下降,表现为所对应的吸光度值与前一天相比均有所降低;此外,经相同的保存时间,相同的培养时间和培养条件,在培养基中保存的GO固定E.coli颗粒的活性优于PBS中保存的GO固定E.coli颗粒的活性,表现为培养基中保存的GO固定E.coli颗粒所产生的吸光度值更高。
相对于单纯的PBS保存,培养基可持续供给固定化E.coli营养物质,所以,于培养液中保存的菌株活性持续的时间较长。
由实验结果可观察到,保存时间和保存条件均会对固定化E.coli的活性产生影响,因此在应用中应慎重选择微生物的保存方法,并明确规定保存时间。
Fig.2.5-1Thecurveofabsorbancevaluechan
gesdependingonincubationtimeofGOimmobilizedE.colistoredinPBSsolutionatdifferentstorageti
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