缓冲液配制.docx
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缓冲液配制
乙醇-醋酸铵缓冲液(pH3.7):
取5mol/L醋酸溶液15.0ml,加乙醇60ml和水20ml,用10mol/L氢氧化铵溶液调节pH值至3.7,用水稀释至1000ml,即得。
三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH8.0):
取三羟甲基氨基甲烷12.14g,加水800ml,搅拌溶解,并稀释至1000ml,用6mol/L盐酸溶液调节pH值至8.0,即得。
三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH8.1):
取氯化钙0.294g,加0.2mol/L三羟甲基氨基甲烷溶液40ml使溶解,用1mol/L盐酸溶液调节pH值至8.1,加水稀释至100ml,即得。
三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH9.0):
取三羟甲基氨基甲烷6.06g,加盐酸赖氨酸3.65g、氯化钠5.8g、乙二胺四醋酸二钠0.37g,再加水溶解使成1000ml,调节pH值至9.0,即得。
乌洛托品缓冲液:
取乌洛托品75g,加水溶解后,加浓氨溶液4.2ml,再用水稀释至250ml,即得。
巴比妥缓冲液(pH7.4):
取巴比妥钠4.42g,加水使溶解并稀释至400ml,用2mol/L盐酸溶液调节pH值至7.4,滤过,即得。
巴比妥缓冲液(pH8.6):
取巴比妥5.52g与巴比妥钠30.9g,加水使溶解成2000ml,即得。
巴比妥-氯化钠缓冲液(pH7.8):
取巴比妥钠5.05g,加氯化钠3.7g及水适量使溶解,另取明胶0.5g加水适量,加热溶解后并入上述溶液中。
然后用0.2mol/L盐酸溶液调节pH值至7.8,再用水稀释至500ml,即得。
甲酸钠缓冲液(pH3.3):
取2mol/L甲酸溶液25ml,加酚酞指示液1滴,用2mol/L氢氧化钠溶液中和,再加入2mol/L甲酸溶液75ml,用水稀释至200ml,调节pH值至3.25~3.30,即得。
邻苯二甲酸盐缓冲液(pH5.6):
取邻苯二甲酸氢钾10g,加水900ml,搅拌使溶解,用氢氧化钠试液(必要时用稀盐酸)调节pH值至5.6,加水稀释至1000ml,混匀,即得。
枸橼酸盐缓冲液:
取枸橼酸4.2g,加1mol/L的20%乙醇制氢氧化钠溶液40ml使溶解,再用20%乙醇稀释至100ml,即得。
枸橼酸盐缓冲液(pH6.2):
取2.1%枸橼酸水溶液,用50%氢氧化钠溶液调节pH值至6.2,即得。
枸橼酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH4.0):
甲液——取枸橼酸21g或无水枸橼酸19.2g,加水使溶解成1000ml,置冰箱内保存。
乙液——取磷酸氢二钠71.63g,加水使溶解成1000ml。
取上述甲液61.45ml与乙液38.55ml混合,摇匀,即得。
氨-氯化铵缓冲液(pH8.0):
取氯化铵1.07g,加水使溶解成100ml,再加稀氨溶液(1→30)调节pH值至8.0,即得。
氨-氯化铵缓冲液(pH10.0):
取氯化铵5.4g,加水20ml溶解后,加浓氯溶液35ml,再加水稀释至100ml,即得。
硼砂-氯化钙缓冲液(pH8.0):
取硼砂0.572g与氯化钙2.94g,加水约800ml溶解后,用1mol/L盐酸溶液约2.5ml调节pH值至8.0,加水稀释至1000ml,即得。
硼砂-碳酸钠缓冲液(pH10.8~11.2):
取无水碳酸钠5.30g,加水使溶解成1000ml;另取硼砂1.91g,加水使溶解成100ml。
临用前取碳酸钠溶液973ml与硼砂溶液27ml,混匀,即得。
硼酸-氯化钾缓冲液(pH9.0):
取硼酸3.09g,加0.1mol/L氯化钾溶液500ml使溶解,再加0.1mol/L氢氧化钠溶液210ml,即得。
醋酸盐缓冲液(pH3.5):
取醋酸铵25g,加水25ml溶解后,加7mol/L盐酸溶液38ml,用2mol/L盐酸溶液或5mol/L氨溶液准确调节pH值至3.5(电位法指示),用水稀释至100ml,即得。
醋酸-锂盐缓冲液(pH3.0):
取冰醋酸50ml,加水800ml混合后,用氢氧化锂调节pH值至3.0,再加水稀释至1000ml,即得。
醋酸-醋酸钠缓冲液(pH3.6):
取醋酸钠5.1g,加冰醋酸20ml,再加水稀释至250ml,即得。
醋酸-醋酸钠缓冲液(pH3.7):
取无水醋酸钠20g,加水300ml溶解后,加溴酚蓝指示液1ml及冰醋酸60~80ml,至溶液从蓝色转变为纯绿色,再加水稀释至1000ml,即得。
醋酸-醋酸钠缓冲液(pH3.8):
取2mol/L醋酸钠溶液13ml与2mol/L醋酸溶液87ml,加每1ml含铜1mg的硫酸铜溶液0.5ml,再加水稀释至1000ml,即得。
醋酸-醋酸钠缓冲液(pH4.5):
取醋酸钠18g,加冰醋酸9.8ml,再加水稀释至1000ml,即得。
醋酸-醋酸钠缓冲液(pH4.6):
取醋酸钠5.4g,加水50ml使溶解,用冰醋酸调节pH值至4.6,再加水稀释至100ml,即得。
醋酸-醋酸钠缓冲液(pH6.0):
取醋酸钠54.6g,加1mol/L醋酸溶液20ml溶解后,加水稀释至500ml,即得。
醋酸-醋酸钾缓冲液(pH4.3):
取醋酸钾14g,加冰醋酸20.5ml,再加水稀释至1000ml,即得。
醋酸-醋酸铵缓冲液(pH4.5):
取醋酸铵7.7g,加水50ml溶解后,加冰醋酸6ml与适量的水使成100ml,即得。
醋酸-醋酸铵缓冲液(pH6.0):
取醋酸铵100g,加水300ml使溶解,加冰醋酸7ml,摇匀,即得。
磷酸-三乙胺缓冲液:
取磷酸约4ml与三乙胺约7ml,加50%甲醇稀释至1000ml,用磷酸调节pH值至3.2,即得。
磷酸盐缓冲液:
取磷酸二氢钠38.0g,与磷酸氢二钠5.04g,加水使成1000ml,即得。
磷酸盐缓冲液(pH2.0):
甲液——取磷酸16.6ml,加水至1000ml,摇匀。
乙液——取磷酸氢二钠71.63g,加水使溶解成1000ml。
取上述甲液72.5ml与乙液27.5ml混合,摇匀,即得。
磷酸盐缓冲液(pH2.5):
取磷酸二氢钾100g,加水800ml,用盐酸调节pH至2.5,用水稀释至1000ml。
磷酸盐缓冲液(pH5.0):
取0.2mol/L磷酸二氢钠溶液一定量,用氢氧化钠试液调节pH值至5.0,即得。
磷酸盐缓冲液(pH5.8):
取磷酸二氢钾8.34g与磷酸氢二钾0.87g,加水使溶解成1000ml,即得。
磷酸盐缓冲液(pH6.5):
取磷酸二氢钾0.68g,加0.1mol/L氢氧化钠溶液15.2ml,用水稀释至100ml,即得。
磷酸盐缓冲液(pH6.6):
取磷酸二氢钠1.74g、磷酸氢二钠2.7g与氯化钠1.7g,加水使溶解成400ml,即得。
磷酸盐缓冲液(含胰酶)(pH6.8):
取磷酸二氢钾6.8g,加水500ml使溶解,用0.1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至6.8;另取胰酶10g,加水适量使溶解,将两液混合后,加水稀释至1000ml,即得。
磷酸盐缓冲液(pH6.8):
取0.2mol/L磷酸二氢钾溶液250ml,加0.2mol/L氢氧化钠溶液118ml,用水稀释至1000ml,摇匀,即得。
磷酸盐缓冲液(pH7.0):
取磷酸二氢钾0.68g,加0.1mol/L氢氧化钠溶液29.1ml,用水稀释至100ml,即得。
磷酸盐缓冲液(pH7.2):
取0.2mol/L磷酸二氢钾溶液50ml与0.2mol/L氢氧化钠溶液35ml,加新沸过的冷水稀释至200ml,摇匀,即得。
磷酸盐缓冲液(pH7.3):
取磷酸氢二钠1.9734g与磷酸二氢钾0.2245g,加水使溶解成1000ml,调节pH值至7.3,即得。
磷酸盐缓冲液(pH7.4) :
取磷酸二氢钾1.36g,加0.1mol/L氢氧化钠溶液79ml,用水稀释至200ml,即得。
磷酸盐缓冲液(pH7.6):
取磷酸二氢钾27.22g,加水使溶解成1000ml,取50ml,加0.2mol/L氢氧化钠溶液42.4ml,再加水稀释至200ml,即得。
磷酸盐缓冲液(pH7.8):
甲液——取磷酸氢二钠35.9g,加水溶解,并稀释至500ml。
乙液——取磷酸二氢钠2.76g,加水溶解,并稀释至100ml。
取上述甲液91.5ml与乙液8.5ml混合,摇匀,即得。
磷酸盐缓冲液(pH7.8~8.0):
取磷酸氢二钾5.59g与磷酸二氢钾0.41g,加水使溶解成1000ml,即得。
30%丙烯酰胺储存液:
称Acr30g,Bis0.8g,加水至100ml,过滤后置棕色瓶内。
1%TEMED:
取TEMED1ml,加水至100ml,置棕色瓶内4℃贮存。
10%过硫酸铵(AP):
称AP10g,加水100ml,置棕色瓶内4℃贮存。
0.2mol/LpH7.2磷酸盐缓冲液:
称Na2HPO4·12H2O51.58g及NaH2PO4·2H2O8.74g,溶于水中并定容1L。
分离胶缓冲液(1.5MTris-Cl缓冲液pH8.8):
Tris18.17g,加水dH20约80ml用1MHCl调pH至8.8,定容至100ml
浓缩胶缓冲液(1MTris-C1缓冲液pH6.8):
Tris12.1g,加水约80ml用1MHCl调pH至6.8,定容至100ml
1.染料饱和酒精溶液的配制
配制染色液常先将染料配成可长期保存的饱和酒精溶液,用时再予以稀释配制。
配制饱和酒精溶液,应先用少量95%酒精先在研钵中徐徐研磨,使染料充分溶解,再按其溶解度加于95%酒精之中,贮存于棕色瓶中即可。
附表1 几种常用染料在95%酒精中的溶解度(26℃)
染料名称溶100mL95%酒精中的重量(g)
美蓝1.48
结晶紫13.87
龙胆紫10.00
碱性复红3.20
沙黄3.41
2.常用染色液的配制
(1)碱性美蓝(亦称骆氏美蓝)染色液:
取美蓝饱和酒精溶液30ml,加入0.01%氢氧化钾水溶液l00mL,混合即成。
此染色液在密闭条件下可保存多年。
若将其在瓶中贮至半满,松塞棉塞,每日拔塞摇振数分钟,并不时加水补充失去的水分,约1年后可获得多色性,成为多色美蓝染色液。
(2)草酸铵结晶紫(亦称赫克结晶紫)染色液:
取结晶紫饱和酒精溶液2mL,加蒸馏水18mL稀释10倍,再加入1%草酸铵水溶液80mL,混合过滤即成。
(3)革兰氏碘溶液:
将碘化钾2g置乳钵中,加蒸馏水约5mL。
再加入碘片1g,予以研磨,并徐徐加水,至完全溶解后,注入瓶中,被加蒸馏水至全量为300mL即成。
此液可保存半年以上,当产生沉淀或褪色后即不能再用。
(4)沙黄水溶液:
沙黄也称番红花红。
将沙黄饱和酒精溶液以蒸馏水稀释10倍即成。
此液保存期以不超过4个月为宜。
(5)石炭酸复红染色液:
取3%复红酒精溶液10mL,加入5%石炭酸水溶液90mL混和过滤即成。
(6)稀释石炭酸复红染色液:
将石炭酸复红染色液以蒸馏水稀释10倍即成。
(7)3%盐酸酒精(亦称含酸酒精):
加浓盐酸3mL于95%酒精97mL中即成。
(8)瑞士染色色液:
取瑞氏染料0.1g置乳钵中,徐徐加入甲醇,研磨以促其溶解。
将溶液倾入有色中性玻瓶中,并数次以甲醇洗涤乳钵,亦倾入瓶内,最后使全量为60mL即可。
将此瓶置暗处过夜,次日滤过即成。
此染色液须置于暗处,其保存期约为数月。
(9)姬姆萨染色液 取姬姆萨氏染料0.6g加于甘油50mL中,置55~60℃水浴中1.5~2h后,加入甲醇50mL,静置1日以上,滤过即成姬姆萨染色液原液。
临染色前,于每毫升蒸馏水中加人上述原液1滴,即成姬姆萨染色液。
应当注意,所用蒸馏水必须为中性或微碱性,若蒸馏水偏酸,可于每l0mL左右蒸馏水加入1%碳酸钾溶液l滴,使其变成微碱性。
特殊染色法
1.荚膜染色法
(1)美蓝染色法:
带负电荷的菌体与带正电荷的碱性染料结合成蓝色,而荚膜因不易着色而染成淡红色。
抹片自然干燥,甲醇固定,以久储的多色性美蓝液作简单染色,荚膜呈淡红色,菌体呈蓝色。
注:
多色性美蓝即碱性美蓝,亦称骆氏美蓝。
(2)瑞氏染色法或姬姆萨染色法:
抹片自然干燥,甲醇固定,以瑞氏染色液或姬姆萨染色液染色,荚膜呈淡紫色,菌体呈蓝色。
(3)节氏(Jasmin)荚膜染色法:
取9mL含有0.5%石炭酸的生理盐水,加入lmL无菌血清(各种动物的血清均可)混合后成为涂片稀释液。
取此液一接种环置于载玻片上,又以接种环取细菌少许,均匀混悬其中,涂成薄层,任其自然干燥,在火焰上微微加热固定,然后置甲醇中处理,并立即取出,在火焰上烧去甲醇。
以革兰氏染色液中的草酸铵结晶紫染色液染色0.5min,干燥后镜检。
背景淡紫色,菌体深紫色,荚膜无色。
2.鞭毛染色法
(1)莱氏(Leifson)鞭毛荚膜染色法
鞭毛宽一般约0.01~0.05微米,在普通光学显微镜下看不见,用特殊染色法在染料中加入明矾与鞣酸作媒染剂,让染料沉着于鞭毛上,使鞭毛增粗容易观察,染色时间愈长,鞭毛愈粗。
染色液:
钾明矾或明矾的饱和水溶液20mL、20%鞣酸水溶液10mL、蒸馏水l0mL、95%酒精15mL、碱性复红饱和酒精溶液3mL,依次序将各液混合,置于紧塞玻瓶中,其保存期为1个星期。
染色剂:
含染料90%的美蓝0.1g、硼砂(Borax)1.0g、蒸馏水100mL
染色法:
滴染色液于自然干燥的抹片上,在温暖处染色l0min,若不作荚膜染色,即可水洗,自然干燥后镜检。
鞭毛呈红色;若作荚膜染色,可再滴加复染剂于抹片上,再染色5~l0min,水洗,任其干燥后镜检。
荚膜呈红色,菌体呈蓝色。
(2)刘荣标氏鞭毛染色法
染色液:
溶液一:
5%石炭酸溶液l0mL、鞣酸粉末2g、饱和钾明矾水溶液 l0mL
溶液二:
饱和结晶紫或龙胆紫酒精溶液。
用时取溶液一10份和溶液二l份,此混合液能在冰箱中保存7个月以上。
染色法:
取幼龄培养物制成抹片,干燥及固定后以溶液一和溶液二的混合液在室温中染色2~3min,水洗,干燥后镜检。
菌体和鞭毛均呈紫色。
(3)卡-吉二氏(Casares-Cill)鞭毛染色法
媒染剂:
鞣酸 10g、氯化铅(AICl3·6H20)18g、氯化锌(ZnCl2)l0g、盐酸玫瑰色素(Rosanillinehydrochloride)或碱性复红1.5g、60%酒精40mL。
先盛60%酒精10mL于乳钵中,再以上列次序将各物置乳钵中研磨以加速其溶解,然后徐徐加入剩余的酒精。
此溶液可在室温中保存数年。
此法染假单胞菌更好。
染色法:
制片自然干燥后,将上述媒染剂作1:
4稀释,滤纸过滤后滴于片上染2min。
水洗后加石炭酸复红染5min,水洗,自然干燥,镜检。
菌体与鞭毛均呈红色。
3.芽孢染色法
(1)复红美蓝染色法:
细菌的芽孢外面有较厚的芽孢膜,能防止一般染料的渗入,如用碱性复红、美蓝等作简单染色,芽孢不易着色。
采用对芽孢膜有强力作用的化学媒染剂如石炭酸复红进行加温染色,芽孢着色牢固,一旦芽孢着色后,于酸类溶液处理也难使之脱色,因此再用碱性美蓝溶液复染,只能使菌体着色。
抹片经火焰固定后,滴加石炭酸复红液于片上,加热至生蒸汽,经2~3min,水洗。
以5%醋酸脱色,至淡红色为止,水洗。
以骆氏美蓝液复染0.5min,水洗。
吸干或烘干,镜检,菌体呈蓝色,芽孢呈红色。
(2)孔雀绿—沙黄染色法:
抹片经火焰固定后滴加5%孔雀绿水溶液于其上,加热30~60s,使生蒸汽3~4次。
水洗0.5min,以0.5%沙黄水溶液复染0.5min。
水洗,吸干镜检。
菌体呈红色,芽孢呈绿色(所用玻片最好先以酸液处理,可防绿色褪色)。
4.异染颗粒染色法
异染颗粒的主要成分是核糖核酸和多偏磷酸盐,嗜碱性强,故用特殊染色法可染成与细菌其他部分不同的颜色。
(1)美蓝染色法:
抹片在火焰中固定后,以多色性美蓝染色0.5min,水洗,吸干,镜检。
菌体呈深蓝色,异染颗粒呈淡红色。
(2)亚氏(Albert)染色法:
抹片在火焰中固定后,以亚氏染色液染色5min,水洗后再以碘溶液染色1min,水洗,吸干,镜检。
菌体呈绿色,异染颗粒呈黑色。
亚伯特氏染色液和碘溶液的成分如下:
染色液:
甲苯胺蓝(Toludineblue)0.15g、孔雀绿0.20g、 冰醋酸lmL、
95%酒精2mL、 蒸馏水l00mL、
碘溶液:
碘片2g、碘化钾3g、蒸馏水300ml、
将碘片和碘化钾在乳钵中研磨,先加40~50mL水,使其充分溶解,然后再加足量蒸馏水。
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