食品微生物检验学实验指导.docx
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食品微生物检验学实验指导
食品微生物检验学实验指导
课时分配及主要实验内容(总学时30,其中动检20,动食安30)
实验1微生物检验常规试验预备3
主要内容:
菌落总数测定和大肠菌群检验所需的1)研钵、剪刀、镊子、吸管、平皿的包扎与干热灭菌;2)实验所需培养基(营养琼脂、EMB琼脂、乳糖胆盐发酵管)和生理盐水的配制、分装、包扎和高压蒸汽灭菌。
实验2菌落总数测定3
主要内容:
1)样品的称取、匀浆和稀释;2)接种与琼脂倾注;3)24h后菌落计数及结果报告。
实验3大肠菌群MPN测定3
主要内容:
1)样品的称取、匀浆和稀释;2)接种于乳糖胆盐发酵管,培养;3)24h后观察产酸产气情况,划线于EMB琼脂,培养;3)48h时观察菌落特征,革兰氏染色、镜检;4)查MPN检索表,报告结果。
实验4蜡样芽孢杆菌检验3
主要内容:
1)将细菌肉汤培养物划线于普通琼脂、MYP琼脂,点种于卵黄琼脂平板,接种生化培养基,培养;2)24h时观察菌落特征,革兰氏染色、镜检;3)观察主要生化试验结果。
4)报告。
实验5致病性球菌检验3
主要内容:
1)将金黄色葡萄球菌和链球菌肉汤培养物划线于普通琼脂、血液琼脂,接种生化培养基,进行纸片法药敏试验,培养;2)24h时观察菌落特征,革兰氏染色、镜检;3)观察主要生化试验结果和药敏试验结果。
4)报告。
实验6魏氏梭菌检验3
主要内容:
1)形态及染色特性观察;2)细菌厌氧培养;3)家兔“泡沫肝”试验
实验7霉菌检验2
主要内容:
1)观察曲霉、毛霉和青霉在PDA琼脂上的菌落特性;2)挑取霉菌培养物制备压片,在显微镜下观察霉菌菌丝、孢子等结构。
实验8肉的微生物学检验2
主要内容:
1)鲜肉的感官性状观察;2)鲜肉压印片制备与镜检、细菌计数;3)微生物毒素呈色反应。
实验9乳的微生物学检验2
主要内容:
1)鲜乳的感官性状观察;2)乳的涂片制备与镜检、细菌计数;3)美兰还原试验。
实验10食品中沙门氏菌的检验6
主要内容:
1)沙门氏菌检验所需培养基的制备;2)细菌分离与菌落挑选;3)细菌生化试验;4)血清学鉴定;5)结果报告。
实验一微生物检验常规试验预备
[目的与要求]
1.熟悉菌落总数测定和大肠菌群检验所需的各种培养基的制备。
熟悉高压蒸汽灭菌器的使用。
2.熟悉玻璃器皿的包装与干热灭菌方法。
[主要内容]:
1研钵、剪刀、镊子、吸管、平皿的包扎与干热灭菌。
2实验所需培养基(营养琼脂、EMB琼脂、乳糖胆盐发酵管)和生理盐水的配制、分装、包扎和高压蒸汽灭菌。
1)配制700mL生理盐水(0.9%NaCl),分别分装与5个盐水瓶,每瓶90mL;分装18支试管,每管9mL。
2)配制乳糖胆盐培养基(发酵管)200mL,并分装于小试管各3mL,每管中加入一个充满培养基的小倒管,注意一定不能有气泡。
(配方:
2%蛋白胨,0.5%猪胆盐,1%乳糖,调pH7.4,然后加入0.4%溴甲酚紫2.5ml/100ml)
3)配制普通琼脂培养基400ML,分装于2个三角瓶。
(0.5%NaCl,1%蛋白胨,0.3%牛肉粉(膏),pH7.4,琼脂粉1.5%)
4)配制伊红美蓝培养基300mL。
(配方:
蛋白胨1%,NaCl0.5%,牛肉膏0.3%,pH7.4,琼脂粉1.5%,加热溶化后加入乳糖1%、2%伊红水溶液2mL/1000mL、0.65%美蓝1mL/1000mL)
5)TTC培养基
(1)2%乳糖发酵管40支,每管2.5ml(2%乳糖,2%蛋白胨)。
(2)TTC培养液100ml(2%蛋白胨,1%Nacl,1%Na2HPO4.12H2O,0.4%十二烷基硫酸钠,PH7.4)
(3)灭菌后加10%TTC8ml后分装于
(1),每管加2.5ml。
6)DC培养基(0.5%蛋白胨,0.5%Nacl,1%乳糖,0.3%K2HPO4.3H2O,0.2%柠檬酸铁铵,琼脂粉0.7%)溶于水后调PH7.2,加入10%去氧胆酸钠1ml及0.4%溴麝香草酚兰1.6ml。
[思考题]
1配制培养基时的一般原则和注意事项?
2使用高压灭菌器和恒温干燥箱的注意事项?
实验二菌落总数测定
[目的与要求]
通过本试验要求掌握食品的菌落总数测定的方法,菌落计数和报告方式,以及经常食用的各类动物性食品的菌落总数标准。
菌落总数是指食品检样经过适当处理,在一定的条件下培养后,所得1g或1mL检样中所含细菌菌落的总数,其也是判定食品被污染程度的标志。
[实验器材及试剂]
温箱、天平、灭菌试管、吸管、灭菌平皿、乳钵、剪子和镊子、稀释液、营养琼脂、显微镜、载玻片、革兰氏染色液,等。
[实验内容]
(一)检样稀释及培养:
1.以无菌操作,将检样25g(或25mL)剪碎放于含有250mL(或225mL)灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内预置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内,经充分振摇或研磨作成1:
10的均匀稀释液。
2.用1mL灭菌吸管,吸取1:
10稀释液1mL,注入含有9mL灭菌生理盐水的试管中振摇试管混合均匀,作成1:
100倍稀释。
3.另取lmL灭菌吸管,按
(2)操作10倍递增稀释,如此每递增稀释一次换一只1mL灭菌吸管。
4根据卫生标准要求或对样品污染情况的估计,选择2~3个适宜稀释度,分别在作10倍递增稀释的同时,用吸取该稀释度的吸管移1mL稀释液于灭菌平皿内,每个稀释度作2个平皿。
5.稀释液移入平皿后,应立即将冷至46℃左右营养琼脂培养基(可放置46℃水浴中保温)注入平皿约15mL,并转动平皿使混合均匀,同时将营养琼脂培养基倾入加有lmL灭菌稀释液的灭菌平皿内,作空白对照。
6.待琼脂凝固后,翻转平板,置37℃温箱内培养24±2h时(肉、水产、乳、蛋为48±2h)取出,计算平皿内菌落数,乘以稀释倍数,即得每g(mL)样品所含菌落总数。
(二)菌落计数方法
作平板菌落计数时,可用肉眼观察,必要时用放大镜观察,以防遗漏。
在记下各皿的菌落数后,求出同稀释度的各皿平均菌落数。
(三)菌落计数的报告包括三步。
1.平板菌落数的选择选取菌落数在30~300之间的平板作为菌落总数测定标准。
一个稀释度使用两个平板应采用两个平板平均数,其中一个平板有较大片状菌落生长时,则不宜采用,而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数,若片状菌落不到平板的一半,而其余一半中菌落分布又很均匀,即可计算半个平板后乘以2以代表全皿菌落数。
2.稀释度选择
(1)选择平均菌落数在30~300之间,乘稀释倍数。
(2)若两个稀释度,其菌落数均在30~300之间,则视二者之比来决定。
比值小于或等于2,应报告平均数,大于2则报告其较小的数字。
(3)若所有稀释度的平均菌落数均较大于300,则应按稀释度最高的平均数乘以稀释
倍数报告。
(4)若所有稀释度平均菌落数均小于30,则应按稀释度最低平均数乘以稀释倍数。
(5)若所有稀释度均无菌落的生长,则以小于(<)1乘以最低稀释倍数报告之。
(6)若所有稀释度的平均菌落数均不在30~300之间其中一部分大于300或小于30时,则以最接近30或300的平均菌落数乘以其稀释倍数。
3.菌落数的报告菌落数在100以内时,按其实有数报告,大于100时,采用二位有效数字,在两位有效数字后面的数值,以四舍五入方法计算,为缩短数字后面的零数也可用10的指数来表示,详见表2-1。
[思考题]
1菌落总数的食品卫生学意义?
2影响本实验结果的因素有哪些?
表2-1稀释度选择及菌落数报告方式
例稀释液及菌落数两稀释菌落总数报告方式
次101102103液之比(个/g或mL)(个/g或mL)
1多不可计16420—1640016000或1.6×104
2多不可计295461.63775038000或3.8×104
3多不可计271602.22710027000或2.7×104
4多不可计多不可计313—313000310000或3.1×105
527115—270270或2.7×102
6000—<1×10<10
7多不可计30512—3050031000或3.1×104
实验三大肠菌群数的测定
[目的与要求]
1.掌握大肠菌群MPN的测定原理与方法,及实验结果报告方式。
2.熟悉检验中各种培养基的配制。
3.了解大肠菌群的食品卫生学意义
[原理]
大肠菌群系指一群能发酵乳糖,产酸产气,需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。
该菌主要来源于人畜粪便,故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量,具有广泛的卫生学意义。
它反映了食品是否被粪便污染,同时间接地指出食品是否有肠道致病菌污染的可能性。
食品中大肠菌群数系以每100g(或ml)检样内大肠菌群最近似数(the most probable number-简称MPN)表示。
[实验器材及试剂]
样品:
乳、肉、禽蛋制品、饮料、糕点、发酵调味品或其他食品。
温箱、天平、灭菌试管、吸管、灭菌平皿、乳钵、剪子和镊子、稀释液、营养琼脂、显微镜、载玻片、革兰氏染色液、乳糖胆盐发酵管、伊红美兰琼脂、乳糖发酵管、DC半固体培养基、TTC乳糖培养基、灭菌中性定性滤纸片,等。
[实验内容]
一、常规检验法
1检样稀释及培养取样及稀释方法与菌落总数检验方法相同,做成1:
10的均匀稀释液为检样。
同一稀释度在做菌落总数的测定的同时接种乳糖胆盐发酵管,并且用大肠埃希氏菌、产气肠杆菌混合菌种作对照。
2乳糖发酵试验根据食品卫生要求或对检样污染程度的估计,选择三个稀释度,每个稀释度接种三管乳糖胆盐发酵管。
接种量在1ml以上者,用双料乳糖胆盐发酵管,1ml及1ml以下者,用单料乳糖胆盐发酵管,同时用大肠埃希氏菌和产气肠杆菌混合菌种混合接种于1支作单料乳糖胆盐发酵管对照。
置36±1℃温箱内,培养24±2小时,如所有发酵管都不产气,则可报告为大肠菌群阴性,如有产气者,则与对照的混合菌种一起按下列程序进行。
3分离培养将产气的发酵管分别在伊红美兰琼脂(EMB琼脂)平板上划线分离。
然后置36±1℃温箱内,培养18~24小时后取出, 观察菌落形态,并作革兰氏染色和证实试验。
4 证实试验在上述平板上,挑取可疑大肠菌落1~2个进行革兰氏染色,同时接种乳糖发酵管,置36±1℃温箱培养24±2小时,观察产气情况,凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌,即可报告为大肠菌群阳 性.
5 报告 根据证实大肠菌群的阳性管数,查MPN检索表(见附录)报告每100ml(克)食品中大肠菌群的最可能数.
二、快速检验法
(一)TTC(氯化三苯四氮唑)显色快速法样品处理同常规法。
具体操作步骤:
1.接种每份样品以无菌操作接种lmL、0.lmL、0.01mL各三管于TTC乳糖培养基中,如接种量为10mL,则用三倍TTC乳糖培养基。
2.培养接种后,置35-37℃温箱中培养18-24h。
3.结果判定观察TTC乳糖培养基呈色和产气情况。
按下列标准进行判定。
见表3-1,
表3-1显色法的大肠菌群结果判定
显色产气大肠菌群判定
紫红、深红、红色、浅红色、局部红色十阳性
紫红、深红、红色、浅红色、局部红色-阴性
小红点或局部浅红色+阳性
无色透明或有小红点,局部浅红色-阴性
不变红色+阴性
4.结果报告根据阳性管数查MPN检索表,得出结果并报告之。
5.注意事项观察产气时,如小导管内有肉眼可见气泡,均为产气阳性,另要注意导管有无被沉淀物堵塞,如轻轻振动试管,有小气泡上升者仍为阳性。
(二)DC(去氧胆酸钠)半固体试管快速法样品稀释同常规法,具体操作步骤:
1.接种液体样品选择原液、1:
10、l:
100三个稀释度的样品液,每个稀释度取三个1mL,分别放入灭菌试管中。
固体样品取1:
10稀释液三个10mL(1g)样品分别注入三个灭菌试管内,再取1:
10稀释液三个lmL和1:
100稀释液三个lmL分别加入灭菌试管内。
2.加入培养基并进行培养接种1mL样品的试管,注入已溶化并冷至50℃左右的DC半固体培养基3mL,接种10mL样品的试管加入三倍DC培养基5mL,立即将样品与培养基充分混合,待凝固后,置37℃温箱内培养18~24h。
取出观察结果。
3.结果判定和记录则分别按下述四种处理
(1)培养基变桔红色,有气泡产生或琼脂崩裂,记录为
。
(2)培养基为桔红色,或有桔红色菌落,无气泡或琼脂崩裂现象,记录为十。
(3)培养基为绿色,有黄色菌落无气泡和琼脂崩裂现象,记录为土。
(4)培养基为绿色,记录为-。
4.报告结果:
判定为
(1)和(4)反应结果,记录阳性管数。
查MPN检索表并报告之。
如遇
(2)、(3)项反应结果,可挑2~3个大肠菌群可疑菌落接种乳糖复发酵管,置
37℃温箱中培养18~24h。
时,根据产酸产气管数查MPN检索表并报告之。
(三)纸片快速法
1.制备纸片将中性定性滤纸裁成10×12cm,然后叠成5×6cm大小双层纸片,灭菌后用专用培养基浸渍,然后37~40℃烘干,以无菌操作放入塑料袋内备用(塑料袋为耐高温的聚丙塑料膜,以利消毒)。
2.接种样品样品稀释方法同前述液体和固体样品培养。
(1)液体样品:
取原液、1:
10、1:
100三个稀释度各三个1mL,分别涂布于9张纸片上。
(2)固体样品:
取原液、l:
10、1:
100三个稀释度各三个lmL,分别涂布于9张纸片上。
3.培养将上述纸片置37士1℃温箱中,培养15小时观察结果。
4.结果判定根据以下情况分别判定:
(1)纸片上出现紫红色菌落,其周围有黄圈者为阳性。
(2)纸片为一种颜色,无菌落生长者为阴性。
(3)纸片呈紫色,有紫红色菌落,其周围无黄圈者为阴性。
(4)酸性食品接种后,纸片变黄,经培养后无紫红色菌落为阴性。
(5)纸片变色呈现不典型菌落,结果可疑者,应做复发酵进行验证。
5.结果报告根据纸片的阳性片数,查大肠菌群MPN检索表并报告之。
6.注意事项有二。
(1)用培养基浸渍过的纸片,应避光保存,并注意防潮,可放冰箱中保存备用。
(2)如发现纸片变为粉红色即为失效。
[思考题]
1 大肠菌群检验中为什么首先要用乳糖胆盐发酵管?
2 作空白对照实验的目的?
3 为什么大肠菌群的检验要经过复发酵才能证实?
4 复发酵时为什么使用乳糖发酵管但不需加胆盐?
表3-2 大肠菌群最可能数(MPN)检索表
阳 性 管 数
MPN
100ml(g)
95%可信限
1ml(g)×3
0.1ml(g)×3
0.01ml(g)×3
下限
上限
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
2
3
<30
30
60
90
<5
90
0
0
0
0
1
1
1
1
0
1
2
3
30
60
90
120
<5
130
0
0
0
0
2
2
2
2
0
1
2
3
60
90
120
160
<5
200
0
0
0
0
3
3
3
3
0
1
2
3
90
130
160
190
10
210
1
1
1
1
0
0
0
0
0
1
2
3
40
70
110
150
10
230
1
1
1
1
1
1
1
1
0
1
2
3
70
110
150
190
30
360
1
1
1
1
2
2
2
2
0
1
2
3
110
150
200
240
30
360
1
1
1
1
3
3
3
3
0
1
2
3
160
200
240
290
30
360
2
2
2
2
0
0
0
0
0
1
2
3
90
140
200
260
10
370
2
2
2
2
1
1
1
1
0
1
2
3
150
200
270
340
30
440
2
2
2
2
2
2
2
2
0
1
2
3
210
280
350
420
70
70
390
470
2
2
2
2
3
3
3
3
0
1
2
3
290
360
440
530
100
1500
3
3
3
3
0
0
0
0
0
1
2
3
230
390
640
950
40
70
150
1200
1300
1800
3
3
3
3
1
1
1
1
0
1
2
3
430
750
1200
1600
70
140
300
2100
2300
3800
3
3
3
3
2
2
2
2
0
1
2
3
930
1500
2100
2900
150
300
350
3800
4400
4700
3
3
3
3
3
3
3
3
0
1
2
3
2400
4600
11000
≥24000
360
710
1500
13000
24000
48000
注:
①表采用3个稀释度[1mL(g)、0.1mL(g)和0.01mL(g)],每稀释度3管。
②内所列检样量如改用10mL(g)、1mL(g)和0.1mL(g)时,表内数字相应降低10倍;如改用0.1mL(g)、0.01mL(g)和0.001mL(g)时,则表内数字应相应增加10倍。
其余可类推。
实验四食品中蜡样芽胞杆菌的检验
[目的与要求]
通过本实验要求了解蜡样芽胞杆菌的主要生化特性、毒力测定与类似菌鉴别;掌握本菌的形态特征,选择培养基的菌落特点。
[实验器材及试剂]
温箱、营养琼脂、显微镜、载玻片、革兰氏染色液、硝酸盐培养基、酪蛋白琼脂、10%卵黄琼脂、酚红葡萄糖肉汤,等。
[实验内容]
一、活菌计数:
活菌计数是取样品25g(或25mL),用灭菌生理盐水(或磷酸盐缓冲液PH7.0)225mL稀释(固体样品如肉或肉制品等,应无菌研磨制成匀浆后稀释),稀释度为1:
10,再将此稀释液作1:
10(样品的实际稀释度为1:
100,以下各稀释度类推)、1:
100、1:
1000和1:
10000稀释,取各稀释度0.1mL,接种在10%卵黄琼脂或MYP(甘露醇卵黄多粘菌素)琼脂上涂匀后,置37℃温箱中培养12~20h,选取菌落数在30个左右者计数,蜡样芽胞杆菌的菌落在卵黄琼脂上呈粉红色,周围呈乳白色混浊环,在MYP琼脂上呈灰白色或微带红色,并且在粉红色(表示不发酵甘露醇)的背景中环绕白色至淡红色的晕(表示产生卵磷脂酶)。
计数后,从中挑取5个典型菌落作证实试验,根据证实为蜡样芽胞杆菌的菌落,计算出该皿内的蜡样芽胞杆菌数,然后乘其稀释倍数,即得每g(或mL)样品中所含蜡样芽胞杆菌数,例如,将固定检样1:
10000的稀释液0.lmL涂布于甘露醇卵黄多粘菌素琼脂平板上,生成的可疑菌落为25个,取5个鉴定,证实为蜡样芽胞杆菌的是4个,则1g检样中蜡样芽胞杆菌数为:
25×4/5×104×10=2×106
二、细菌培养:
将检样或其稀释液接种于血琼脂或MYP琼脂平板,置37℃温箱内培养12~20h,挑取可疑菌落接种于肉汤和营养琼脂做成纯培养,以备证实试验用。
三、证实试验
1.形态观察:
革兰氏染色法镜检,芽胞卵圆形,芽胞较菌体小,位于中央或稍偏一端。
2.培养特性:
蜡样芽胞杆菌在肉汤中呈混浊生长,常微有菌膜或壁环,振荡易乳化。
营养琼脂上呈不透明、表面粗糙、似毛玻璃或融蜡状,边缘似齿轮状。
3.生化特性:
蜡样芽胞杆菌有动力,还原硝酸盐,接触酶阳性,溶血,不发酵甘露醇和木糖,常能液化明胶和溶菌酶试验阳性,淀粉酶试验阳性,厌氧条件下能发酵葡萄糖。
1)硝酸盐试验:
将纯培养的细菌穿刺接种于硝酸盐培养基中,培养18~24h后,
取出检查,有动力的细菌,可由穿刺线向四周扩散生长,使周围的培养基变混浊,无动力的细菌仅能沿穿刺线生长,周围的培养基仍然保持透明,然后沿管壁加入硝酸盐还原指示剂甲液和乙液各二滴,能还原硝酸盐的细菌立即呈红色。
2)酪蛋白琼脂:
划线后于37℃培养48h,观察菌落周围培养基,如透明表示酪氨酸蛋白酶阳性。
3)卵磷脂酶试验:
取肉汤培养物点种于10%卵黄琼脂平板上,置37℃培养3h,蜡样芽胞杆菌产生混浊环,6h后混浊环扩散至5~6mm。
4)厌氧发酵葡萄糖试验:
取1环肉汤培养物接种于3mL酚红葡萄糖肉场内,置厌氧罐中,37℃培养24h,观察培养基颜色是否由红变黄,如果变黄,为厌氧条件下利用葡萄糖产酸阳性。
[思考题]
1为什么在检验食品中的蜡样芽胞杆菌时要进行活菌计数?
2蜡样芽胞杆菌的主要生化特性?
实验五致病性球菌的检验
[目的与要求]
1.掌握葡萄球菌和溶血性链球菌的常规检验方法。
2.认识葡萄球菌和溶血性链球菌的形态、培养和生化特性。
[实验器材及试剂]
温箱、营养琼脂、显微镜、载玻片、革兰氏染色液、健康人血浆、新鲜兔血浆、血琼脂平板、杆菌肽药敏纸片等。
[实验内容]
一、葡萄球菌的检验
金黄色葡萄球菌能产生凝固酶,并使血浆纤维蛋白发生凝固,呈现阳性反应。
一)检样的采集与处理取25g检样加入225mL灭菌生理盐水内制成混悬液。
二)细菌的形态与培养观察
1.吸取混悬液5mL接种7.5%氯化钠肉场50mL,同时挑取混悬液接种血平板及Baird-Parker氏培养基,置36士1℃温箱培养24h。
如果血平板上菌落呈金黄、大而突起、圆形、不透明、表面光滑、周围有溶血圈。
Baird—Parker氏培养基上为圆形、光滑、突起、湿润,颜色从灰色到黑色,边缘为淡色,周围为混浊带和透明带时,则初步判断为金黄色葡葡球菌。
2.挑取可疑菌落进行革兰氏染色镜检,如见到革兰氏阳性球菌,呈葡萄状排列,无芽胞、无荚膜的细菌,则可认为是该菌。
三)血浆凝固酶试验吸取1:
4新鲜兔血浆0.5mL于小试管中,加入葡萄球菌肉场培养物0.5mL,振荡摇匀,放36土l℃温箱或水浴内,每小时观察一次,观察6h,出现凝固即为阳性。
同时取已知阳性和阴性菌株及肉汤作对照。
二、溶血性链球菌
A群链球菌能产生一种激活酶,此酶能激活血液中的溶纤维蛋白酶原(亦称胞浆原),使之变为有活性的溶纤维蛋白酶,以溶解纤维蛋白。
产生链激酶的细菌除A群链球菌外,还有C和G等群键球菌。
一)检样的采集与处理取25g检样加入225mL灭菌生理盐水内制成混悬液。
二)细菌的形态与培养
1.取混悬液接种于血平板上,并吸5mL接种于50mL葡萄糖肉浸液肉场内。
如检样污染严重另取5mL接种匹克氏肉场,培养24h。
挑取乙型溶血、圆形突起的细小菌落,接种血平板(纯精养)。
如菌落呈灰白色、半透明或不透明,表面光滑、有浮光、圆形突起的细小菌落,周围有2~4mm无色透明的溶血环,可初步认为是溶血性链球菌。
2.批取菌落作革兰氏染色镜检,如见到革兰氏阳性球菌,不形成芽胞,无鞭毛,链状排列时可判定为该菌。
三)链激酶试验
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