山东农业大学《分子生物学》开卷复习资料docx.docx

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《分子生物学》

MolecularBiology

生命科学学院张杰道

E-mail:

jdzhang@

第一章绪论

•分子生物学

属于边缘学科，生物化学、生物物理学、遗传学、微生物学、计算机科学等学科相互渗透而发展起来的一门学科。

广义：

从分子水平研究生命现象的一门科学。

生物化学也可以划分为此范畴。

狭义：

在分子水平研究基因的结构及其活动的学科。

主要涉及遗传信息的储存、传递、表达及其调控等过程，也涉及蛋白质和酶的结构与功能。

分子生物学诞生的标志一DNA双螺旋模型的提岀（1953）JamesWatson&FrancisCrick

1.4分子生物学的研究内容

1.4.1生物大分子结构的研究

1949年，Chargaff,DNA中含有4种碱基，A=T;G=C;

1953年,Wilkins和Franklin利用X■衍射测定DNA双螺旋结构;

1955年，Sanger等人首先测出了牛胰岛素的氨基酸排列顺序；

1958年，Kendrew和Perutz用X—射线衍射技术，测定了肌红蛋白和血红蛋白的三维结构；

1.4.2结构与功能关系的研究

•DNA上贮存的各种信息的表达需要通过各种方式进行调节。

•顺式作用元件：

影响基因表达的DNA序列。

包括启动子、增强子和沉默子等，决定转录的起始和和效率。

反式作用因子（转录因子）：

与基因上游调控序列专一结合的蛋白。

保证目的基因以特定的强度在特定的时间与空间表达，其特定结构如亮氨酸拉链、锌指结构等，对其行使其特定功能具有重要意义。

1.4.3遗传信息的传递、表达与调控

•DNA—1=使RNA—蛋白质

•基因表达调控是分子生物学研究的前沿和核心内容。

•基因表达可在不同水平上进行调控。

1.4.4DNA重组技术

•1972年，美国科学家Berg首次将不同的DNA片段连接起来，并将其插入到细菌细胞中，使重组的DNA进行繁殖。

•大量生产某些在正常细胞代谢中产量很低的多肽，

•如激素、抗生素、抗体等，如治疗HIV的白细胞介素

•定向改造某些生物基因结构.以提高它们的特殊经济价值或功能，快速分解石油的超级细菌

用于基础理论研究。

顺式作用元件和转录因子

•基因工程（geneticengineering）有目的地把一个生物体中有用的基因转入另一个生物体中，使后者获得新的遗传性状或表达所需要的产物。

•重组DNA技术是基因工程的核心技术，包括了一系列的分子生物学操作步骤。

其重大突破带动了现代生物技术的兴起，并很快产生了许多高技术产业。

•基因组和基因

•DNA的复制

•转录与加工

•蛋白质的生物合成

•原核生物基因的表达调控

•真核生物基因的表达调控

主要内容

1基因组和基因

1.1原核细胞和真核细胞的特点

1.2染色体和基因

1.3原核生物的基因组和基因

1.4真核生物的基因组和基因

1.1原核细胞和真核细胞的特点

•原核细胞

（1）无核膜，不形成染色体结构。

（2）没有线粒体、内质网、高尔基体等细胞器，质膜具有这些细胞器类似的功能。

•真核细胞

（1）遗传物质是被核膜包围着的，形成细胞核。

（2）细胞质中含有细胞器，如线粒体、叶绿体、内质网等细胞核DNA与组蛋白结合形成染色体。

（3）存在细胞骨架系统，以维持不同细胞所特有的形状。

4.2基因（gene）和基因组（genome）

1.2.1染色体和基因

染色体：

包括DNA和蛋白质（组蛋白和非组蛋白）两大部分，同一物种每条染色体上所带DNA的量是一定的。

基因：

编码一条多肽链或功能RNA（tRNA、rRNA、snRNA等）所必需的全部核昔酸序列。

基因还包括转录所必需的调控序列及位于编码区上游和下游的非编码序列及内含子序列。

染色质的基本结构单位■—核小体

核小体：

DNA（200bp±）

组蛋白八聚体：

2XH2A、H2B、H3和H4

组蛋白H1和连接DNA

1.2.2基因组与C值矛盾

1.2.2.1基因组

定义：

某一特定生物单倍体的染色体数目及其所携带的全部基因。

每个生物都具有基因组,携带构成和维持该生物体生命形式所必需的所有生物信息。

基因组分类

1）原核生物基因组

2）真核生物基因组：

核基因组

细胞器基因组：

线粒体基因组、叶绿体基因组

•原核生物基因组：

一般只有一个染色体，单倍体，基因组就是它的整个染色体。

•真核生物基因组：

多为二倍体，能维持配子或配子体正常功能的最低数目的一套染色体构成一个基因组。

1.2.2C值矛盾

C值:

一个单倍体基因组的DNA含量总是恒定的，称为该物种DNA的C值。

10470"。

影响C值的因素：

高度重复序列的多少、内含子、转座子、基因的缺失或重复等。

C值矛盾：

种系进化程度、形态学的复杂程度与C值（单倍体基因组总DNA的含量）大小不一致的现象称C值矛盾。

生物体的结构与功能越复杂，其C值就越大。

但在结构功能相似的同一类生物中C值可以相差数十倍，乃至上百倍。

如两栖动物109-1011bp,哺乳动物109bp

1）生物体进化程度高低与大C值不成明显相关

2）亲缘关系相近的生物C值相差较大

1.3原核生物基因组特点

（1）结构简练。

一般只有一条染色体，大多数为环状结构。

基因多单拷贝，重复序列和非编码序列很少。

（2）存在转录单元。

功能相关基因常以多顺反子形式表达

（3）有基因重叠现象。

（4）操纵子调节。

功能相关的几个基因与共有的调控序列组成操纵子。

如大肠杆菌DNA分子量仅为2.4x109,含基因3,000-4,000个。

最小的病毒如双链DNA病毒SV40,其DNA分子量只有3x106,含5个基因。

基因重叠：

1一个基因完全在另一个基因里面

2部分重叠

3两个基因只有一个碱基对的重叠

1.4真核生物基因组的结构特点

•基因组很大：

107-1011多个复制子

•有大量重复序列：

两栖动物基因组DNA中90%为重复序列

•有断裂基因：

大多数真核生物的基因有外显子和内含子区，将一个基因的编码序列分割成不连续的若干区段

•形成簇的基因家族：

真核生物的基因组中有许多来源相同、结构相似、功能相关的基因，这样的一组基因称为基因家族

•DNA上有很多不编码序列：

如哺乳动物的DNA中，大约只有2%是用来编码蛋白质，其余大多数在基因表达调控中起作用

真核生物DNA序列可以分为：

1单一序列：

在一个单倍体基因组中只含1个拷贝。

2轻度重复序列：

在一个基因组中一般有2-10个拷贝，如组蛋白基因。

3中度重复序列：

含10■几百个拷贝，一般是不编码序列，主要起基因调控作用。

4高度重复序列：

含几百个到几百万个拷贝，多数是长度小于10bp的短序列，为不编码序列。

断裂基因：

内含子+外显子（核不均一RNA）

内含子究竟有什么功能呢？

1对转录起调控作用通过启动子、起始位点的精确碱基配对，起着减弱甚至阻止或増强RNA聚合酶活性的作用。

2扩大表达信息量内含子具有各种剪接信号，对外显子进行选择性拼接，形成不同的成熟mRNA,从而扩大表达信息量。

3一个基因的内含子可能是另一个基因的外显子。

假基因：

与一般编码基因在结构上相似，但并不表达的基因。

是基因组中基因突变而失活的基因，无蛋白质产物，一般是启动子出现问题。

（1）缺少内含子；

（2）在假基因的末端连接着许多dAMP;

（3）两端有顺向重复序列。

如：

人a■及B■珠蛋白基因簇

1.4.2细胞器基因组

•在真核细胞器中，有两种细胞器能够携带遗传物质，即线粒体（mitochondria）和叶绿体（chloroplast\

•细胞器基因组大多是以环状双链DNA分子的形式存在，线粒体DNA以mtDNA表示，叶绿体DNA以ctDNA表示。

•细胞器基因组本身是单一序列，但是在每个细胞器中一般有数拷贝的基因组。

1.5基因组学研究进展

•人类基因组计划

•1988年，美国国家卫生院和能源部迄今为止在生命科学领域最宏大的研究计划一人类基因组计划

•主要内容是完成人体23对染色体的全部基因的遗传作图和物理作图，完成23对染色体上30亿个碱基的序列测定

•以美国为主、包括英国、法国、日本和中国多国科学家参加的国际合作计划，我国占据了1%的份额

•2001年2月12日美、英、日、法、德、中六国科学家，以及Celera公司联合公布人类基因组图谱，及初步分析结果

1.5.1后基因组时代

人类基因组计划的完成标志着一个以基因组功能研究为主要内容的“后基因组时代”已经到来。

•生物信息学（Bioinformatics）是将生物遗传密码与电脑信息相结合，揭示遗传信息，并通过查询、搜索、比较、分析生物信息，理解生物大分子信息的生物学意义。

•如将DNA芯片以及蛋白质双向电泳结果转变成为可读的遗传学信息。

生物软件、数据库

•功能基因组学（functionalgenomics）从整体水平研究基因及其产物在不同时间、空间、条件下的结构与功能的关系及活动规律的学科。

蛋白质组学（proteomics）是研究细胞内全部蛋白质的存在及其活动方式的一门科学，从研究单个蛋白质分子结构与功能进入到研究蛋白质群体的结构与功能。

第二章DNA复制

1.DNA复制机理

2.DNA复制酶学

3.DNA复制过程

4.真核生物DNA复制

第一节DNA复制机制

•Semi-conservativemechanism半保留机制

•Semi-discontinuousreplication半不连续复制

•RNAprimingRNA引导

•Replicons,origins,andtermini复制子，起始点，终点

1.DNA的半保留复制

（a）Conservative（b）Semiconservation（c）Dispersive

半保留复制特点

（1）DNA的复制总是由5J3'方向进行。

（2）每个子代DNA分子中都包含有一条新合成的链和来自亲代的一条链，因此称之为半保留复制。

（3）DNA的半保留复制保证了所有的体细胞都携带相同的遗传信息，并可以将遗传信息稳定地传递给下一代。

（4）所有细胞生物DNA都以半保留方式进行复制。

2.DNA的半不连续复制

沿3J5'走向摸板合成互补链一前导链是连续的，沿5=3'走向摸板合成互补链一后随链先合成冈崎片段，再连接成完整的互补链。

DNA复制发生在细胞周期的S期

细胞周期：

G1:

DNA的复制准备

S:

DNA合成

G2:

细胞分裂准备

M:

细胞分裂（mitosis）

（GO:

静止期）

复制子:

能够独立复制的基因组单位称为复制子。

每个复制子都含有控制复制起始的起点，可能还有终止复制的终点。

复制叉：

在解旋酶的作用下，首先双螺旋的DNA可以同时在许多DNA复制的起始位点局部解螺旋并拆开为两条单链，如此在一条双链上可形成许多“复制泡”，解链的叉口处称为复制叉。

2.DNA的复制方式2.1双链环状DNA的复制

（1）e形复制（细菌、病毒）

（2）滚环式复制（入噬菌体）

（3）D■环形复制（线粒体、叶绿体）

2.2线性双链DNA的复制

2.1双链环状DNA的复制

（1）e形复制（细菌、病毒）

双向、单向

环形DNA的双向等速复制

a.所有原核生物、一些细菌病毒及病毒DNA分子的染色体都是环形，只有一个复制子。

b.线性病毒DNA分子只有一个复制子。

c.真核染色体包含许多复制子，每个复制子都有自己的复制起点。

典型哺乳动物细胞含有50000-100000个复制子。

（2）滚环式复制

1.0复制（入噬菌体）

2.噜噗滚环式复制（loopedrollingcirclereplication）

a.噬菌体q）X174的环状单链先复制成双链环形，再滚环复制。

b.被置换的链是一个分子长度。

（3）D-环形（D-loop）复制

线粒体■双链复制原点位置不同，起始不同步

叶绿体■双链复制原点位置不同，起始同步

2.2线性双链DNA复制的几种形式：

（1）单起点单向（腺病毒）

（2）单起点双向（T7噬菌体）

（3）多起点双向（真核生物）如：

真核生物的多复制子

第二节原核细胞DNA复制的酶学

合成方向：

DNA/RNA:

5*-3*

Protein:

N->C

合成原料：

四种脱氧核昔三磷酸

dNTPs（dATP,dGTP,dCTP&TTP）

PPi（pyrophosphate）

底物（dNTP（dATPdGTPdCTPdTTP）

DNA聚合酶（polymerase）

模板（template）

引物（primer）

连接酶，解旋酶及单链DNA结合蛋白等。

1.DNA聚合酶

催化dNTP聚合到核酸链上，是DNA复制的主要酶。

全称:

依赖DNA的DNA聚合酶（DNAdependentDNApolymerase）或DNA指导的DNA聚合萌（DNA-directedDNApolymerase）,均缩写为DDDPo

1.1DNA聚合85催化的反应

5'至3’的聚合活性

催化四种dNTP一个一个地接到DNA链上去。

（dNMP）n+dNTP-（dNMP）n+1+ppi

聚合反应的特点：

（1）以单链DNA为模板

（2）以dNTP为原料（3）引物提供3'・0H⑷聚合方向为5'~>3'

核酸外切酶活性

5J3'外切酶活性：

切除引物；

切除突变的片段；

损伤修复；

3J5'外切酶活性：

切除错配的核昔酸；

校对；

1.2DNA聚合BS的种类

原核生物的DNA聚合酶

pol-l

pol-ll

pol-lII

5'-3'聚合酶活性

+

+

+

3J5'外切酶活性

+

+

+

5-3*外切酶活性

+

-

-

功能

切除引物

不清

复制的主要酶

填补空隙

修复合成

大肠杆菌DNA・polI（ArthurKornberg,1956）

单一肽链的大分子

可被水解成两个片段：

（1）小片段（N端）:

具有5't3'外切酶活性；

（2）大片段（C端）：

具有聚合活性和3=5’外切酶活性，也称为Klenow片段，是常用的工具酶。

大肠杆菌DNA・polII（ThomasKornberg&MalcolmGetter,1971）

•多亚基，分子量120kD,这个酶的活性很低，只有DNA聚合酶I的5%o

•具有DNA聚合酶活性：

5'~>3'方向合成DNA需要Mg+、NH4+激活

•具有3J5'外切酶活性

•在DNA损伤修复中起一定作用

大肠杆菌DNA-polIII（ThomasKornberg&MalcolmGetter,1972）

•全酶是a、队Y、&、&、£、8、t、x、屮10种亚基组成的聚合体。

•含锌原子

•复制的主要酶

•催化效率最高

A:

阿尔法Alpha、0:

贝塔Beta、丫：

伽玛Gamma、德尔塔Delte、£:

艾普西龙Epsilon、6:

西塔Theta、T：

套Tau、x：

器Chi、屮:

普赛

Psi

KornbergT,GefterML（10September1972）."Deoxyribonucleicacidsynthesisincell-freeextracts.IV.Purificationandcatalytic

propertiesofdeoxyribonucleicacidpolymeraseIII".J.Biol.Chem.247（17）:

5369-75

DNA聚合酶III全酶的亚基及其组装层次

•主要起DNA错误倾向修复的作用（SOS）o

•当DNA受到严重损伤时，即可诱导产生这两个酶，而正常的DNA聚合酶会在此部位因不能形成正确的碱基配对而停止复制。

•复制的保真性（fidelity）

至少依赖三种机制：

1.遵守严格的碱基配对规律；

2.聚合酶在复制延长中对碱基的选择功能；

3.复制中的即时校读功能（损伤修复）。

例:

大肠杆菌碱基错配概率:

10-9-10-10,实际突变概率更小

2.解旋解链爾类

解开并理顺DNA双链，维持DNA处于单链状态。

•解螺旋酶（helicase）

一类通过水解ATP获得能量来打断氢键从而解开DNA双螺旋的酶。

解旋相关蛋白：

dnaA、dnaB、dnaCdnaX

解旋W:

DnaB.rep蛋白、PriA（w蛋白）、TraY/l等

（参与复制、转录、修复、重组）

DnaA:

辨认复制起始位点

DnaB:

解螺旋酶

DnaC:

辅助解螺旋酶使其在起始点上结合

•单链DNA结合蛋白（single-strandDNAbindingprotein,SSB）

功能：

SSB与解开的DNA单链紧密结合，防止重新形成双链，在复制中维持模板处于单链状态；并免受核酸酶降解。

在大肠杆菌细胞中主要SSBP是四聚体，可以和单链DNA上相邻32nt结合。

一个SSBP四聚体结合于单链DNA上可以促进其他四聚体与单链DNA结合，称为协同结合（cooperativebinding）,真核生物SSB没有协同效应。

SSBP可重复使用,当新生的DNA链合成到某一位置时，该处的SSBP便会脱落并被重复利用。

•DNA拓扑异构酶（topoisomerase）

拓扑：

是指物体或图像作弹性移位而又保持物体不变的性质。

拓扑异构酶

一类可改变DNA拓扑性质的酚。

既能水解、又能连接磷酸二酯键。

可松弛DNA超螺旋，有利于DNA解链。

（1）复制时，复制叉行进的前方DNA分子产生正超螺旋，DNA拓扑异构酶可以引入负超螺旋（水解、连接），松解超螺旋，有利于复制叉的行进及DNA的合成。

（2）复制结束时，拓扑异构酶又可向DNA分子引入超螺旋，有利于DNA缠绕、折叠、压缩以形成染色质。

拓扑异构酶I

在原核生物曾被称为・蛋白。

主要作用是切开DNA双链中的一股，DNA变为松弛状态再封闭切口。

能够消除负超螺旋，对正超螺旋无作用。

拓扑异构酶II

在原核生物又叫旋转酶（gyrase）o能切断DNA双链再连接断端。

在ATP参与下，向松弛的DNA引入负超螺旋（快），无ATP时只能

松弛负超螺旋（慢）0

3.引物酶和引发体

引物酶（primase）:

依赖DNA的RNA聚合酶。

催化RNA引物的合成。

大肠杆菌中，引物酶是dnaG基因的产物。

RNA引物：

在DNA模板的复制起始部位由引物酶催化NTP的聚合，形成短片段的RNA,为DNA聚合提供3'・0H末端。

引发体（primosome）:

是由DnaB、DnaA、DnaC以及其他复制因子一起形成复合体，再结合引物酶形成较大的聚合体，结合到模板DNA上。

复制开始时，在引发体的下游解开双链，再由引物酶催化引物的合成。

4.DNA连接酶（DNAligase）

•连接DNA链3-OH末端和相邻DNA链5・P末端，形成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连接起来，反应需要ATP。

•DNA连接酶在复制、DNA修复、重组、剪接中均起缝合缺口作用。

是重要的工具酶之一。

能源：

细菌的DNA连接酶以NAD+作为能量来源，动物细胞和噬菌体的连接酶以ATP作为能量来源。

第三节原核细胞DNA复制的过程

复制过程

•亲代DNA分子超螺旋构象的松弛和螺旋的解旋，复制模板展露；

•复制的引发（priming）,引物的合成；

•DNA链的延伸（elongation）DNA链5'・3'的合成；

•终止（termination）复制进行到终点位置，ter、Tus蛋白因子参与，复制终止。

1•复制的起点和方向

复制起点（oriC）

E.Coli:

245bp

1一般都是双螺旋DNA呼吸作用强烈的区段，富含A、To

2含有多个短重复序列，如3个13bp.4个9bp重复序列。

3有复制起始蛋白识别的特异起始序列。

大肠杆菌在oriC处的起始复制，要依赖于DnaA蛋白结合9bp重复区并诱导邻近的富含A/T区段的解链。

复制方向

•大多数生物为双向等速复制，即两个复制叉的移动速度是相等的。

E.coliDNA的复制只有一个起始位点，并且是双向进行的。

•也有少数为双向不等速复制。

如枯草杆菌，其复制是从DNA上的特定点开始双向进行的，但是两个复制叉的移动是不对成称的。

•某些病毒和细菌DNA的复制是单向进行的，即只有一个复制叉移动走完全程。

2•复制的引物

•引物多为一段RNA,约为5-30个核昔酸，在引物的5'■端含三个磷酸基团，3'•端为游离轻基。

•复制引物RNA并不与模板分离，而是以氢键与模板结合。

但转录产物RNA随着转录与DNA模板分离，其RNA/DNA杂交段只有十几个核昔酸。

4.复制的起始

大肠杆菌复制起始有关的酶和辅助因子

DnaA

52000

1

识别起点序列并与特定位点结合

DnaB

300000

6

解开双螺旋（解旋酶）

DnaC

29000

1

辅助DnaB与起点结合

HU

19000

2

结合DNA促其变构引起3X13bp区变性

DnaG

60000

1

合成引物（引物酶）

SSB

75600

4

结合单链DNA

RNApol

454000

5

促进DnaA活性（RNA聚合酶）

Topoll

400000

4

释放DNA解链过程中产生的扭曲张力

Dam甲基化酶

32000

2

GATC序列的A甲基化

1转录激活：

经由RNA聚合酶催化的转录过程合成一小段RNA转录激活后，E.coli编码的DnaA蛋白即作用于oriC而引发复制的起始。

2预引发体形成：

DnaB蛋白和DnaC蛋白在DnaA蛋白的作用下进入熔解区，并与之形成复合物。

DnaB为解螺旋酶，借助水解ATP产生的能量，促进大范围的解链。

它使DNA双向熔解形成两个复制叉。

3引发体形成：

预引发体的形成促进引发酶进入并形成引发体，合成与模板链互补的RNA片段。

4DNA的合成：

RNA引物的3*-0H末端依次添加新的dNTP,新生的DNA链按5,-3,方向不断延伸。

转录激活:

DNA复制起始位点的核昔酸序列被转录成短的RNA,这些短的RNA链不作为引物，而是影响起点

的结构，有利于引发体的装配识别，进而合成RNA引物，这种作用称为转录激活。

5.复制的延伸・DNA半不连续复制

1）后随链的合成是不连续的

2）前导链的合成是连续的

6.复制的终止

切除RNA引物：

RNaseH水解杂交链中的RNA,原核生物体内RNA引物的去除还需要DNA聚合酶I来完成，该酶具有5'・3'外切酹活性。

空缺补满：

DNA聚合萌I利用四种脱氧核糖核苜三磷酸为原料，按照模板的要求将空缺补满。

将相邻的两个核昔酸连接起来（DNA连接酶,磷酸二酯键）,DNA完成一轮复制。

（4）环形DNA复制的终止

单向复制的环形DNA分子中复制的终点就是复制原点。

双向复制的环形DNA分子中