基因工程期末总攻略终止.docx
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基因工程期末总攻略终止
基因工程期末总攻略
转化:
重组质粒DNA分子通过与膜蛋白结合进入受体细胞内并稳定维持表达的过程。
转导:
通过入-噬菌体颗粒感染宿主细胞将外源DNA分子导入到受体细胞内并稳定遗传的过程
转染:
采用与质粒DNA转化受体细胞相似的方法,将重组入-噬菌体DNA分子直接导入受体细胞的过程。
克隆载体:
实际上是一种具有特定功能的DNA分子,它们将携带的外源DNA片段或基因进入受体细胞,并使其在受体细胞中维持稳定表达。
表达载体:
是在克隆型载体的基础上增加了表达元件构建而成的,在受体细胞内能稳定维持并表达外源目的基因
质粒:
是存在于细菌细胞内染色体外的双链DNA分子,一个质粒就是一个DNA分子,广泛存在于细菌细胞中,一般以超螺旋共价闭环DNA(ccc-DNA)分子的形式存在,体外成为开环DNAoc-DNA与线形DNA(l-DNA)
质粒的特点:
①染色体外的遗传因子;
②共价闭合环状的双链DNA;
③大小为1-200kb;
④常含对宿主有利的酶的基因,并使宿主具有以下表型:
a.产生抗性;b.产生抗素;c.降解有利物;d.生成大肠杆菌素;e.生成肠毒素;f.生成限制酶和修饰酶.
穿梭质粒载体:
指一类由人工构建的具有两种不同复制起点的选择标记,因而可在两种不同宿主细胞中存活和复制的质粒载体。
T载体:
聚合酶链反应产物的克隆运载体,线性化后两侧3′端各多出一个脱氧胸苷酸(T)。
由于PCR产物两侧3′端通常含单个脱氧腺苷酸(A),与T载体之间的A-T互补性可提高PCR产物克隆的效率。
(蓝白斑)
质粒不亲和性:
两种质粒在没有选择压力的情况下,同一宿主细胞中不能共存的特性称质粒不亲和,通常是由于亲缘关系过近,而被基因调节,阻碍复制。
(质粒具有不相容性,即在没有选择压力的条件下,两种不同的质粒不能稳定地共存于同一宿主细胞内.细胞增殖过程中会被逐渐排斥(稀释)掉。
属同一不相容群。
阻遏蛋白。
)
Cosmid:
由质粒与含有体外包装必须的COS位点的小入DNA片段所组装而成的一类新克隆载体称COSMID载体,能承载较大的外源DNA片段。
优点:
(1)被包装后能高效转化E.coli;
(2)容量大,可载35~45kb外源DNA;由质粒和噬菌体的cos区构建而成。
(3)因不含的基因,故不会裂解;
(4)带有抗性表记,易于选择阳性克隆;
(5)便于定向克隆。
缺点:
(1)可相互连接成单一的粘粒,可用5’脱磷法来避免;
(2)载体中可插入多个外源DNA片断,如这些片断原来不相邻即可引起混乱。
选用大片断(如真核基因)可避免;
(3)菌落数量大时筛选有困难。
采用高密度菌落筛选法或原位分子杂交可以解决。
YAC:
即酵母人工染色体,是最早构建成功的人工染色体载体,是将酵母染色体DNA的端粒,复制起点和着丝粒及选择标记基因克隆至大肠村菌质粒中获得的重组质粒
包含3个关键序列:
.自主复制DNA序列(autonomouslyreplicatingsequence,ARS)ARS的功能是确保染色体在细胞周期中能够自我复制
.着丝粒DNA序列(centromereDNAsequence,CEN)确保复制的染色体能够平均分配到子细胞中
.端粒DNA序列(telomereDNAsequence,TEL)与端粒酶结合,完成染色体的末端复制
4.选择性标记和克隆位点;
5.同时还含有大肠杆菌的复制起始点,可以在大肠杆菌中以环状质粒的形式存在。
2.优缺点:
优点:
克隆容量大
缺点:
.片段大,稳定性差,不便操作.文库中的嵌合现象严重嵌合现象(chimaerism)是指一个YAC克隆中的DNA片段来自两个或两个以上的染色体.YAC内部有重排现象.缺失,使文库不完整;.YAC转化酵母的转化率并不十分理想;.YAC的分子结构与酵母的天然染色体的分子结构有一定的相似性,故从转化细胞中分离YAC时,不易与酵母染色体分开
感受态:
指处于能吸收周围环境中DNA分子的生理状态的细胞
严格地说是指感受态的大肠杆菌细胞捕获和表达质粒载体DNA分子的生命过程
基因文库:
批贮存了某种生物全部基因信息的一个受体菌群体。
基因信息既可以是DNA序列,也可以是mRNA反转录成的cDNA序列。
(用重组DNA技术将某种生物细胞的总DNA或染色体DNA的所有片段随机地连接在载体上,然后转移到适当的宿主细胞中通过细胞增殖而构成各个片段的克隆。
当制备的克隆数目多到可以把某种生物的全部基因都包含在内的情况下,这一组克隆的总体就称为某种生物的基因文库。
)
cDNA文库:
某种生物材料的基因转录产物mRNA经逆转录形成不同的cDNA片段,与克隆载体重组后贮存在受体菌群体中。
(提取出组织细胞的全部mRNA,在体外反转录成cDNA,与适当的载体常用噬菌体或质粒载体连接后转化受体菌,则每个细菌含有一段cDNA,并能繁殖扩增,这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。
)
限制性核酸内切酶的星号活性:
某些限制性内切核酸酶在特定条件下,可以在不是原来的识别序列处切割DNA的现象称为STAR活性。
(1)甘油浓度过高
(2)离子强度不适合(3)阳性离子的变化
(4)溶液中pH的变化。
(5)有机溶剂残留的影响
同尾酶:
虽然识别序列不同,但切割DNA分子所得片段具相同黏性末站的限制性内切核对酸酶称为同尾酶。
5`-CAATTG-3`MunI
3`-GTTAAC-5`
5`-GAATTC-3`EcoRI
3`-CTTAAG-5`
同裂酶:
来源不同,但具相同识别序列的限制性内切酶。
同裂酶的切割位点可能不同,识别和切割位点都相同的叫同序同切,识别位点相同但切割位点不同的叫同序异切酶。
包涵体:
重组蛋白在胞内表达时,常常以不溶性蛋白聚集成的晶状物形式存在,这种晶状体即包涵体.
包涵体的形成是外源蛋白的高效表达时的普遍现象,这是由于肽链折叠过程中部分折叠的中间态发生了错误聚合,而不是形成成熟的天然态或完全解链的蛋白.
致密地集聚在细胞内,变性折叠,水不溶性蛋白
分泌蛋白:
指外源基因的表达产物通过运输或分泌的形式穿过细胞的外膜进入培养基中。
融合蛋白:
将外源蛋白基因与受体菌自身蛋白基因重组在一起,但不改变两个基因的ORF,以这种方式表达的蛋白。
P273
ORF:
一组连续的含有三连密码子的能够被翻译成多肽链的DNA序列。
由起始密码子开始到终止密码子结束。
MCS:
DNA载体序列上人工合成的一段序列,含有多个限制内切酶识别位点。
能为外源DNA提供多种可插入的位置或插入方案。
SD序列:
原核生物起始密码子AUG约10bp处有一富含嘌呤的保守序列区,mRNA中用于结合原核生物核糖体小亚基的序列
在大肠杆菌mRNA的核糖体结合位点上,含有一个转译起始密码子及同16S核糖体RNA3,末端碱基互补的序列,
核酸分子杂交:
具有一定同源性的两条核酸单链在适宜的的温度及离子强度等条件下,可按碱基互补配对原则高度特异地退火形成双链。
也称核酸印迹法,可用于于重组子的筛选鉴定。
另一种版本的:
具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下,按碱基配对原则形成双链的过程。
影响杂交的因素:
核酸分子的浓度和长度(浓度大,复性快;分子量大,复性慢)。
温度。
离子强度。
杂交液中的甲酰胺。
核酸分子的复杂性
鸟枪法:
使用限制内切酶将带目的基因的DNA链切成若干小段。
再使用DNA连接酶将其整合到载体的基因中,并使其表达。
基因定位克隆:
又称图位克隆,根据目的基因在基因组上的位置特性而不是其编码产物来进行基因克隆。
1.先将目的基因定位到染色体上,并在目的基因的两侧确定一对紧密连接的RFLP或RAPD分子标记;
2.利用最紧密连锁的一对两侧分子标记作探针,通过染色体步移技术将位于这两个分子标记之间的含目的基因组片断克隆并分离出来;
3.最后根据其同突变体发生遗传互补的能力从此克隆重鉴定出目的基因。
染色体步移:
一种利用已知基因或DNA分子标记来分离与其紧密连锁的未知基因的有效方法
这种技术通过逐一克隆来自染色体基因组DNA的彼此重叠的序列,而慢慢靠近目的基因,因此形象的称为染色体步移。
1.在基因组的不同位置上散布着重复的DNA序列,它们会扰乱步移的顺序性,因此,进行染色体步移的探针必须是唯一的序列的克隆。
2.在基因组DNA中存在着一些无法克隆的序列,因为当它们被克隆到所使用的克隆载体上时,会发生致死效应。
差别杂交:
适用于分离经特殊处理而被诱发表达的mRNA的cDNA克隆。
1.差别杂交要拥有两种细胞群体:
在一个细胞群体中目的基因正常表达,而另细胞群体中目的基因不表达。
2.制备两种不同的mRNA提取物。
一种含一定比例目的基因mRNA的总mRNA;另一种不含目的基因mRNA的总mRNA;
3.通过这两种总mRNA为探针的平行杂交对目的基因cDNA克隆文库进行筛选。
P184
•差减杂交的缺点:
(1)灵敏度低
(2)重复性差
(3)需用大量的杂交膜,工作量大,费时,费钱
原核表达系统:
指通过基因克隆技术,将外源目的基因,通过构建表达载体并导入表达菌株的方法,使其在特定原核生物或细胞内表达。
①原核生物大多数为单细胞异养,生长快,代谢易于控制,可通过发酵迅速获得大量基因表达产物。
②基因组结构简单,便于基因操作和分析。
③多数原核生物细胞内含有质粒或噬菌体,便于构建相应的表达载体。
④生理代谢途径及基因表达调控机制比较清楚。
⑤不具备真核生物的蛋白质加工系统,表达产物无特定的空间构象。
⑥内源蛋白酶会降解表达的外源蛋白,造成表达产物的不稳定性。
真核表达系统:
a真核生物基因表达调控过程更复杂;
b基因及基因组的结构特点不同,如真核生物基因具有内含子结构等;
c转录与翻译的间断性,原核生物转录与翻译同时进行,而真核生物该两过程发生在不同区域,具有间断性;
d转录后加工过程;
e正负调控机制;
fRNA聚合酶种类多。
问答题:
1、获得目的基因常用的几种方法?
基因文库分离法,PCR扩增法,差示分析法,DNA插入诱变法,基因定位克隆,标签测序法,化学合成法。
(基因组DNA及总RNA的提取、基因文库(cDNA文库、基因组文库)、PCR)
2、叙述构建基因文库、cDNA文库的原理和过程。
基因文库:
通过克隆方法保存在适当宿主中的某种生物,组织,器官或细胞类型的所有DNA片段而构成的克隆集合体.
cDNA文库是指某生物某发育时期所转录的全部mRNA经反转录形成的cDNA片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。
经典cDNA文库构建的基本原理是用Oligo(dT)作逆转录引物,或者用随机引物,给所合成的cDNA加上适当的连接接头,连接到适当的载体中获得文库。
其基本步骤包括:
RNA的提取,在获得高质量的mRNA后,用反转录酶Oligo(dT)引导下合成cDNA第1链,cDNA第2链的合成(用RNA酶H和大肠杆菌DNA聚合酶I,同时包括使用T4噬菌体多核苷酸酶和大肠杆菌DNA连接酶进行的修复反应),合成接头的加入、将双链DNA克隆到载体中去、分析cDNA插入片断,扩增cDNA文库、对建立的cDNA文库进行鉴定。
这里强调的是对载体的选择,常规用的是λ噬菌体,这是因为λDNA两端具有由12个核苷酸的粘性末端,这种质粒能容纳大片段的外源DNA
3、什么是α-互补筛选?
P144
质粒载体具有β-半乳糖苷酶基因(lacZ),当外源DNA插入到它的lacZ,可造成表达后的β-半乳糖苷酶失活,利用这一点就可以通过大肠杆菌转化子菌落在添加有X-gal-IPTG培养基中的颜色变化鉴别出重组子和非重组子。
有些大肠杆菌上带有lacZ基因的部分编码序列,质粒载体中含有别一部分编码序列,当质粒转入载体后,可形成具有酶活性的蛋白质。
这种lacZ基因上缺失了一部分编码序列的突变体与带有这一部分编码序列的突变体之间实现互补的现象叫α互补。
4、基因工程中常用的酶有哪几类?
每一类中主要酶的特性和功能?
限制性内切酶(123型的特性参阅P66页表格),
连接酶,(T4与Ecoil酶特性80页)
核酸聚合酶(87页,耐热,Ecoil1,Klenow,T4,逆转录),
修饰酶(脱氧核酸,核糖核酸,外切核酸,末端脱氧核对甘酸转移)
细胞裂解(溶菌,蛋白K,纤维素酶,)列举少部分:
依酶催化反应的类型分为4大类:
(一)核酸酶:
用于切割或降解核酸分子。
核酸酶又分为:
1.核糖核酸酶:
降解RNA分子成核苷酸,用于清除DNA制备物中的污染的RNA分子,如RNaseA,B
2.脱氧核糖核酸酶:
又分为
(1)核酸外切酶:
从DNA分子外部降解DNA分子成核苷酸
(2)核酸内切酶:
从DNA分子内部切割DNA分子。
核酸内切酶又分为:
①非限制性核酸内切酶:
在DNA分子内部、不识别特定的序列、任意位置、随即切割。
②限制性核酸内切酶:
具有识别特定DNA序列的特性。
限制性内切酶又分为三类:
类型I:
识别的DNA序列长约十几个bp,酶切位点在识别位点1000kb左右,非特异性;
类型II:
识别位点和酶切位点一致,具特异性。
是基因操作中最常用的酶。
类型Ⅲ:
酶切位点在识别位点附近或相邻位置,非特异性。
(二)连接酶:
用于连接核酸分子。
E.coliDNAligase:
连接粘端、缺刻。
T4DNAligase:
连接粘端和平端,缺刻,但二者不连接单链。
T4RNAligase:
作用于单链的RNA之间、单链的DNA之间、单链的RNA和DNA之间的连接。
(三)聚合酶:
用于合成核酸分子。
分为DNA聚合酶和RNA聚合酶。
1.DNA聚合酶:
又分为
①以DNA为模板,催化合成互补的新链。
常用的有TaqDNA聚合酶和Pfu高保真DNA聚合酶,用来扩增目的基因序列。
②逆转录酶:
以RNA为模板,催化合成互补的新链。
常用的有AMV和M-MLV。
2.RNA聚合酶:
体外合成RNA,用作探针,进行Northern杂交
(四)修饰酶:
用于给核酸分子加上或减去某些化学基团或核苷酸
1.碱性磷酸酶:
功能:
催化RNA、DNA5’端游离磷酸基团水解脱落。
用途:
去5’端磷酸基团,防止基因重组时相同末端连接,尤其用于防止载体自环化。
2.端脱氧核苷转移酶:
同聚物加尾,用于基因重组时产生粘性末端。
3.甲基化酶:
对DNA甲基化
4.RNaseH:
特异性地降解RNA:
DNA杂交链中的RNA分子。
5.S1核酸酶:
切割单链DNA成单个寡核苷酸。
切双链DNA分子中的发夹结构。
6.拓扑异构酶:
在DNA上产生一个缺刻,使DNA解螺旋后再封闭。
大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ:
.具有依赖于DNA的5′-3′方向的DNA聚合酶活性
.具有5′-3′的外切酶活性,能从5′末端降解双链DNA,该酶还能降解RNA-DNA杂合体中的RNA
.具有3′-5′方向的外切酶活性在dNTPs存在的情况下,该活性被抑制
20.klenow片段:
大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ,经枯草杆菌蛋白酶处理后,分割成两个片段,其中大片段称为~。
具有5′-3′聚合酶和3′-5′外切酶活性
用途:
1)填充和补平限制性内切酶切割后产生的凹陷的3′末端2)标记DNA片段的末端3)催化cDNA第二链的合成4)用于DNA的序列分析5)催化与单链配对的寡核苷酸引物的延伸,合成杂交探针
21.T4DNA聚合酶
具有依赖于DNA的5′-3′聚合酶活性及单链和双链的3′-5′外切酶活性,且3′-5′外切酶活性非常强,是Klenow片段的200倍,缺乏5′-3′外切酶活性
用途:
不论是凸出的5′端还是3′端,只要满足高浓度dNTPs的要求,该酶都能将末端补平,使DNA便于与街头连接.;可用于3′端凸出DNA的末端标记;3′凹陷末端同位素标记
22.天然的T7DNA聚合酶:
用途:
(1)该酶具有极强的持续聚合能力,可用于引物长距离的延伸;
(2)用于定点诱变中的互补链的合成;(3)3′末端的标记
23.修饰的T7DNA聚合酶该酶的3-5外切酶活性被化学反应选择性地降低或被遗传修饰的方法完全抑制。
用途:
a)作为一种DNA序列分析的工具酶,修饰的T7DNA聚合b)酶具有一系列的理想特性:
加工性能高,无3′-5′外切酶活性,催化脱氧核苷酸类食物(双脱氧核苷酸)的聚合能力同催化正常核苷酸的聚合能力完全一样。
c)能有效地催化低水平的dNTPs,可用来制备标记的底物d)具有很高的比活性,且有失去了3′-5′外切酶活性,因此,可以有效地填补和标记具有5凸出末端的DNA片段之3′末端
24.依赖于DNA的RNA聚合酶
用途:
#.合成单链RNA,用作杂交探针,或在体外翻译系统中用作mRNA
#利用T7RNA聚合酶及其表达系统,能够使外源基因在细菌和酵母中得到表达。
25.末端脱氧核苷酸转移酶,简称末端转移酶,从小牛胸腺中分离出来。
.可以将dNTPs逐个地加到线性DNA分子的3′末端
.底物可以是单链DNA、也可以是具有3′末端凸出的双链DNA
.平末端双链DNA分子不是该没的有效底物,但如果用Co2+离子代替Mg2+离子,也可以成为有效底物
用途:
催化[α-32P]-3′-脱氧核苷酸标记DNA片段的3′末端
.催化非放射性的标记物参入到DNA片段的3′末端
.按照模板,合成多聚脱氧核苷酸的同聚物
26.核酸外切酶是一类从多核苷酸链的一头开始按顺序降解核苷酸的酶。
.核酸外切酶Ⅶ:
大肠杆菌核酸外切酶Ⅶ由两个亚基组成,分别为xseA和xseB基因编码
核酸外切酶Ⅶ是一种单链核酸外切酶,能从5′或3′末端降解DNA分子,不需要Mg2+
27.核酸外切酶Ⅲ:
由大肠杆菌xthA基因编码,降解DNA的速度取决于DNA分子的碱基成分,C≥A~T≥G
主要活性:
从3′-5′的方向催化双链DNA的降解
其他活性:
无嘌呤无嘧啶位点特异的核酸内切酶活性,3-磷酸酶活性和RnaseH酶的活性
主要应用是通过3′-5′活性,使双链DNA分子产生单链区,经过如此修饰的DNA,配合使用Klenow酶,可作为标记DNA的底物,制备探针。
3′隐蔽端与5′隐蔽端相比,优先降解3隐蔽端的双链DNA分子。
27.λ核酸外切酶催化双链DNA分子自5′-p末端进行逐步的加工和水解,但不能降解5′-oH末端
用途:
将双链DNA转变成单链的DNA,供按双脱氧法进行DNA序列分析;从双链DNA分子中移除5′突出末端,以便用末端转移酶进行加尾
28.单链核酸内切酶a)主要功能是催化RNA和单链DNA分子的降解,也可作用于双链核酸分子的单链区,这种单链区可以小到1个碱基。
b)可以测定杂交核酸分子(DNA/DNA或RNA/DNA的杂交程度c)给RNA分子定位.d)测定真核生物中内含子的位置e)探测双螺旋的DNA区域f)移除双链中突出的序列g)打开双链cDNA合成期间形成的发荚环结构
5、简述酶切反应体系及反应条件?
PCR反应系统应包括:
①耐热DNA聚合酶(Taq酶):
②模板DNA:
即待分析的目的DNA,
③两种引物:
需要两种引物,分别位于两条互补模板DNA链的3`-端。
④四种脱氧核糖核苷酸
⑤缓冲溶液;
⑥Mg2+;
⑦超纯水或双蒸水;
反应体系
总体积50-100l
Buffer缓冲液
dNTP原料
Primer引物
DNA分子模板
Taq酶DNA聚合酶
反应时间
•标准一小时。
•可加入过量的酶以缩短反应时间,或者使用能够快速酶切的内切酶。
•对于许多酶,都可以用更少单位的酶消化16小时。
终止反应
若消化后的DNA不需要进行后续的实验操作:
•用终止液终止反应【50%甘油、50mMEDTA(pH8.0)和0.05%溴酚蓝(NEB#B7021)】。
按每50μl反应体系中加入10μl的比例进行。
•在任何情况下,都应尽可能的避免将酶置于高于-20℃的温度下。
反应条件
(1)模板
单、双链DNA均可。
不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。
一般100ngDNA模板/100L。
模板浓度过高会导致反应的非特异性增加
2)引物浓度
0.1-0.5mol/L浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。
3)TaqDNA聚合酶(thermusaquaticus)
0.5-2.5U/50l酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。
4)dNTPdNTP浓度取决于扩增片段的长度
四种dNTP浓度应相等浓度过高易产生错误碱基的掺入,浓度过低则降低反应产量dNTP可与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度下降,影响DNA聚合酶的活性。
5)Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。
0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。
Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降;Mg2+过高影响反应特异性。
Mg2+可与负离子结合,所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。
循环参数
(1)变性使双链DNA解链为单链94oC20-30秒
(2)退火温度由引物长度和GC含量决定。
增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。
(3)延伸70-75℃,一般为72℃延伸时间由扩增片段长度决定(4)循环次数主要取决于模版DNA的浓度一般为25-35次次数过多:
扩增效率降低错误掺入率增加
6、核酸操作的基本技术有哪些?
核酸提取与纯化,核酸检测与保存,核酸凝胶电泳,核酸的分子杂交
7、限制性核酸内切酶有几种类型?
常用是哪种类型并简述其特性。
参阅P66页表格
②限制性核酸内切酶:
具有识别特定DNA序列的特性。
限制性内切酶又分为三类:
类型I:
识别的DNA序列长约十几个bp,酶切位点在识别位点1000kb左右,非特异性;
类型II:
识别位点和酶切位点一致,具特异性。
是基因操作中最常用的酶。
类型Ⅲ:
酶切位点在识别位点附近或相邻位置,非特异性。
I和III型酶识别序列特点:
一般只具有内切酶和甲基化酶的活性,
且识别位点的不恒定等,
不具备用来做工具酶,
II型酶识别序列特点
均有严格的识别特定核苷酸的序列,
识别的核苷酸序列一般在4-8个碱基对
大多数识别位点具有180度旋转对称的结构形式
原核细胞中限制和修饰系统
I类酶酶分子:
三亚基双功能;识别位点:
二分非对称序列;切割位点:
距识别位点1000bp;限制性反应与甲基化反应:
互斥;限制作用需要ATP:
需要
II类酶酶分子:
内切酶与甲基化酶分离;识别位点:
4-6bp序列,回文结构;切割位点:
在识别位点中或靠识别位点;限制性反应与甲基化反应:
分开反应;限制作用需要ATP:
需要
III类酶酶分子:
二亚基双能;识别位点:
5-7bp非对称序列;切割位点:
在识别位点下游24-26bp;限制性反应与甲基化反应:
同时竟争;限制作用需要ATP:
不需要
8、限制性核酸内切酶的活性受哪些因素影响?
daa⑴酶的纯度。
⑵DNA样品的纯度。
⑶DNA的甲基化程度。
⑷酶切反应的温度与时间。
⑸DNA分子的构型。
⑹限制性核酸内切酶的反应缓冲液。
.DNA纯度DNA纯度低,蛋白质含量高,影响酶切效果
.DNA的甲基化程度
.酶切反应的温度;反应温度一般是37度
.DNA的分子构型:
线性DNA容易切割,超螺旋较难
.缓冲液:
不同的酶,其buffer是不同的
DNA基质的纯度和物理特征的影响①适当增加限制性核酸内切酶的量,每微克DNA基质由1单
位提高到5-10倍。
当然由于酶价较昂贵,从这种角度讲
也是一种损失,在实验设计时要权衡考虑。
②适当扩大反应体积,以让污染物相应得到稀释。
③适当延长酶解的反应时间,
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