一种从五味子果实中提取的免疫多糖.docx
- 文档编号:27033518
- 上传时间:2023-06-25
- 格式:DOCX
- 页数:12
- 大小:320.60KB
一种从五味子果实中提取的免疫多糖.docx
《一种从五味子果实中提取的免疫多糖.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《一种从五味子果实中提取的免疫多糖.docx(12页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
一种从五味子果实中提取的免疫多糖
一种从五味子果实中提取的免疫多糖(SCP-IIa)
摘要
一种被命名为SCP-IIa的水溶性多糖,通过乙醇沉淀,去蛋白,阴离子交换和凝胶渗透色谱的手段,能够从五味子果实的水提取物中分离出来。
SCP-IIa的分子量是通过高效液相色谱法确定的,免疫调节作用通过使用由环磷酰胺诱导的免疫抑制模型进行评估的。
SCP-IIa是一种结构均匀的多糖,平均分子量约为7700Da。
检测的参数显示,在免疫抑制小鼠方面,能够增加胸腺和脾脏的指数,以及小鼠腹腔巨噬细胞的胞饮活性。
脾细胞增殖实验表明,SCP-IIa与ConA或LPS结合,积极影响脾细胞增殖。
此外,多糖促进溶血素的形成。
结果表明,SCP-IIa参与免疫调节作用导致SCP-IIa乙酰水杨酸探索潜在的免疫增强剂。
关键词:
多糖;五味子;免疫调节作用;环磷酰胺
1.介绍
五味子(Turcz.)主要产于中国东北,在东方,它的果实(以下简称五味子)已被广泛用于传统医药和功能食品,长达几千年。
五味子有很多传统作用,如收集和阻止放电,补充益气,促进体液的生产,滋阴补肾,平静心态。
在中国药典上,它是一种名贵的有着22倍频率的中国传统药物【1】。
在过去的几十年里,研究人员对药用植物作为活性化合物的天然来源的兴趣显著增加,并且对亚洲各种传统的药品的多糖成分也给予了特别的关注【2-4】。
最近发现多糖具有多方面的药理行动,包括肝保护,抗氧化和抗
衰老和抗癌特性【5-7】。
在最近几年里,运用免疫调节剂来提高宿主防御反应,被认为是一个对于经典的抗生素治疗的最有前途的替代品【8】。
从各种传统药用植物中分离出的多糖已被证明,在体内和体外能够深刻地影响免疫系统,通过调节免疫功能的能力,包括细胞因子/趋化因子的生产,活性氧(ROS)的生产,细胞增殖【9】。
作为一种免疫调节剂,它具有良好的发展前景,因为它没有显着的副作用,这是一个与免疫调节的细菌多糖和合成化合物相关的重大问题【8,9,10】。
但是,关于五味子多糖(SCP-IIa)的纯化和它对免疫反应的影响相关的公布的数据却很少。
在本研究中,我们分离和纯化五味子多糖(SCP-IIa),并且调查五味子多糖(SCP-IIa)治疗小鼠的免疫状态。
由于暂时削弱免疫系统是用中草药免疫调节剂治疗的指标,因而我们调查五味子多糖(SCP-IIa)对巨噬细胞功能的影响。
用环磷酰胺(Cy)治疗免疫抑制小鼠方面的血清细胞因子和皮细胞增殖的水平是确定五味子多糖(SCP-IIa)是否通过全身的影响发挥其作用,并且探讨五味子多糖(SCP-IIa)在免疫抑制动物方面恢复偏离的免疫参数的程度。
2.材料和方法
2.1材料
五味子购买于潍坊奔曹戈的中国药品有限公司,并且由徐崇梅教授(制药和生物科学部门,潍坊,潍坊医科大学,中国)验证
SephacrylTMS-200HighResolutionandDEAE-cellulose-52购自AmershamBiosciences公司。
标准葡聚糖T-2000,T-110,T-70,T-40,T-10和循环,得到自Sigma公司(圣圣路易斯,密苏里州,美国)。
伴刀豆球蛋白A(刀豆)和脂多糖(LPS)也从Sigma。
所有其他试剂均为最高的质量。
2.2一般方法
紫外-可见吸收光谱用UNICOUV-2000分光光度计记录。
总蛋白质浓度用Lowry等人提出的福林-酚通过法进行估计,用牛血清白蛋白作为标准【13】。
使用SPECTRA/POR透析管(截留分子量:
6000〜8000)进行了透析。
2.3多糖的分离和纯化
干五味子粉碎成颗粒(500g),用95%的乙醇脱脂,然后在100◦C用5L蒸馏水萃取2小时,并过滤。
将残余物用3L水进一步萃取2小时。
在减压下,于60◦C,用旋转蒸发器将结合水萃取液真空浓缩至500mL,然后过滤。
滤液用Sevag法【14】沉淀五次,并用蒸馏水透析2天。
将浓缩的暗棕色溶液通过加入4倍体积的95%乙醇沉淀,并在4◦C保持过夜。
离心(6000rpm,20分钟)后,将沉淀物,用无水乙醇洗涤,然后在40◦C真空干燥,以获得粗制的多糖(SCP,27.4g)。
溶解在蒸馏水中的SCP(5.0g),被施加到DEAEcellulose柱(2.6厘米×50厘米),并用水和氯化钠(0-0.3mol/L)洗脱。
在流速为0.8mL/min的条件下,收集馏分(4mL),并在490nm处使用苯酚-硫酸法【15】监测。
得到三种馏分(即SCP-I,SCP-II,和SCP-III),SCP-II占产品的53%。
SCP-II在SephacrylS-200HR柱(1.6cm×60cm)中进一步层析,并用0.1mol/L的NaCl洗脱。
在1.0mL/min的流速下,每次收集2mL的馏分,并按上面方法监测。
收集的级分进行透析,并冷冻干燥,得到SCP-IIa,在随后的研究中使用。
2.4同质化和分子量
SCP-IIa的同质性和分子量由水域高效液相色谱系统(1525HPLC泵)确定,该系统配有WatersUltrahydrogel250列(8.0mm×300mm)和水域2414微分折射计。
以0.1moL/L的NaCl作为流动相,以0.5moL/min的流速对样品溶液(0.1%的20uL)进行注射洗脱。
高效液相色谱系统预先用普鲁兰标准(P-82的Shodex标准,沃特世)进行校准。
商用标准(即葡聚糖T-2000,T-110,T-70,T-40和T-10)被用作标准的分子标记。
2.5免疫调节活性的测量
ICR雄性BALB/c小鼠(8周龄,体重20.0±2.0g)从中国济南的山东大学中国传统医学实验动物中心获得。
将动物在20◦C保持12小时黑暗/12小时光亮的周期。
在整个实验中,他们被允许自由使用标准实验室颗粒的饮食和水。
小鼠随机分为5组(每组10只),实验前1周,允许适应环境。
所有的动物接受循环腹膜内每三天一次的剂量为80mg/kg体重,建立的免疫抑制的动物模型。
对照组给予生理盐水。
不同组的动物通过口服分别给予50,100和200mg/kg的SCP-IIa,而正常对照组和模型组通过口服给予相同体积的生理盐水。
饲喂10天后处死动物。
最后一次给药的二十四小时后,动物称重并断头处死。
切除动物胸腺和脾脏,并立即称重。
胸腺和脾指数根据下面的公式计算:
胸腺或脾指数(mg/g)=(胸腺或脾脏的重量/体重)。
2.5.2腹腔巨噬细胞活性测定
最后一次给药的二十四小时后,小鼠腹腔注射0.5mL的5%的CRBC。
30分钟后,断头处死动物,并用2mL的汉斯平衡盐溶液进行腹腔灌洗。
涂抹细胞悬浮液,并于37◦C下在加湿的含有5%二氧化碳的培养箱中温育30分钟。
孵育后,通过洗涤除去非吞噬的鸡红细胞和其他细胞。
巨噬细胞用甲醇固定,并用Giemsa染色。
吞噬百分比是通过计数每100巨噬细胞中吞噬CRBC的巨噬细胞的数目来测量的。
吞噬指数是通过计数每100巨噬细胞吞噬CRBC的数目来测量的。
2.5.3脾细胞增值的测定
细胞增殖采用MTT比色法进行评估。
最后一次给药的二十四小时后,断头处死动物,无菌条件下摘除脾脏。
在无菌条件下,轻轻地将脾脏刚之灾RPMI-1640培养基中,在室温条件下,以2000rpm的速度离心10分钟。
用Gey的红细胞裂解液除去红血细胞。
洗涤两次后,将细胞重新悬浮在含有5%FBS的RMPI-1640的培养基中,细胞浓度调整到1×106cell/mL。
将细胞悬浮液种植在有或没有ConA(5.0g/mL)或LPS(20.0g/mL)的96孔培养板中。
37◦C下,在加湿的好友5%二氧化碳的培养箱中培养72小时后,在540nm条件下,用MTT法测定增殖细胞的数量。
2.5.4血清溶血素形成试验
给药的第五天,每只小鼠通过注射0.2mL的SPBC(109/mL)悬浮液进行免疫。
最后给药的二十四小时后,采集血样。
一小时后,将这些血液样品以2000r/min的速度离心10分钟,然后将20L的上清液血清用生理盐水稀释至500倍。
在装有1mL稀释后的血清样品的反应管中加入约0.5mL的10%绵羊红细胞和1mL的新鲜豚鼠血清(1:
10稀释)。
在37◦C下孵化1小时后,立即将反应管东东到冰浴中,并在相同条件下再次离心。
用约1mL上清液和3mL的Drabkin的溶液混合。
10分钟后,在540nm出测量吸光度。
2.5.5统计分析
定量数据以均数±标准差表示。
所有的统计比较使用Tukey检验单因素方差分析检验进行测定。
P-值小于0.05被认为有统计学意义,而P-值小于0.01被认为是非常显着性。
图1.五味子粗多糖的离子交换层析(DEAE-纤维素)。
多糖馏分被施加到含有水的柱上,并用0〜0.3mol/L的NaCl的线性梯度洗脱。
通过苯酚-硫酸反应测定馏分,以判断糖的含量(490nm)。
3结果
3.1SCP-IIa的分离和纯化
五味子通过热水提取,乙醇沉淀,去蛋白和透析获得SCP。
SCP的亮占干重的5.27%。
被提取的总SCP通过DEAE-纤维素-52柱分馏层析分为三部分:
SCP-I,SCP-II,and有17:
29:
9比特的SCP-III(图1)。
SCP-IIa是通过SCP-II凝胶过滤(SephachrylS-200)获得的。
冷冻干燥的SCP-IIA的作为浅黄色粉末出现,溶于水。
它对Lowey实验有否定的反应,在280和280nm处无吸收,表明没有蛋白质和核酸。
总糖含量用苯酚-硫酸法测定为98.4%。
GPC轮廓(图2)显示一个单一的和对称的尖锐的峰,表明SCP-IIa是一个同质多糖,它的平均分子量为7700Da。
3.2SCP-IIA对小鼠胸腺和脾脏指数的影响
表1表明,与对照组相比,以剂量80mg/kg用Cy处理过的动物的胸腺和脾脏指数显著下降。
这表明,用Cy按80mg/kg的剂量治疗的小鼠免疫抑制模型被成功构建。
SCP-IIa与不同浓度Cy相结合治疗动物组的胸腺指数表明没有显著差异,但SCP-IIa与Cy治疗组相结合的动物胸腺指数与仅仅用Cy治疗的模型相比较时有一定的差异。
以50,100,或者200mg/kg剂量的SCP-IIa与80mg/kg剂量的Cy相结合治疗的动物的脾脏指数比那些只用Cy治疗的显著增加。
研究表明:
PAP通过引起Cy克服了免疫抑制行为。
表1
SCP-IIA对免疫抑制小鼠的胸腺和脾脏指数的影响。
组胸腺指数(mg/g)脾脏指数(mg/g)
Control2.79±0.385.14±0.76
Cy1.38±0.29a3.02±0.24a
SCP-IIa(50)+Cy1.41±0.313.78±0.36b
SCP-IIa(100)+Cy1.99±0.25b4.22±0.18c
SCP-IIa(200)+Cy1.56±0.174.45±0.22c
Cy和SCP-IIa+Cy代表分别用Cy和SCP-IIa+Cy治疗的小鼠组。
对照组给予相同体积的生理盐水。
Cy的剂量是80mg/kg对于Cy和SCP-IIa+Cy。
报告数据以平均值±标准差组(n=10)。
使用学生的t检验确定意义。
a.P<0.01,与所匹配的对照组进行比较。
b.P<0.05,与只用Cy处理的模型组相比。
c.P<0.01,与只用Cy处理的模型组相比。
表2
SCP-IIa刺激免疫抑制小鼠时的巨噬细胞的吞噬作用和血清溶血形成
组吞噬(%)吞噬指数溶血空斑形成
空白41.12±2.310.79±0.120.318±0.016
Cy25.80±3.30a0.37±0.10a0.102±0.010a
SCP-IIa(50)+Cy27.07±2.040.39±0.120.124±0.014b
SCP-IIa(100)+Cy31.13±2.19b0.48±0.15b0.119±0.026b
SCP-IIa(200)+Cy35.08±0.43b0.4±0.08b0.247±0.019c
Cy和SCP-IIa+Cy代表分别用Cy和SCP-IIa+Cy治疗的小鼠组。
对照组给予相同体积的生理盐水。
Cy的剂量是80mg/kg对于Cy和SCP-IIa+Cy。
报告数据以平均值±标准差组(n=10)。
使用学生的t检验确定意义。
a.P<0.01,与所匹配的对照组进行比较。
b.P<0.05,与只用Cy处理的模型组相比。
c.P<0.01,与只用Cy处理的模型组相比。
3.3SCP-IIA对小鼠腹腔巨噬细胞的胞饮活动的影响
巨噬细胞活化的最显着的功能之一是胞饮活性增加。
SCP-IIA激活巨噬细胞的胞饮活动通过SRBC的吸收来表示。
结果(表2)表明用50-200mg/kg剂量的SCP-IIA治疗巨噬细胞时,胞饮轰动成剂量相关性增强。
吞噬百分比和指数在SCP-IIA的中等和高剂量治疗组显著比只用Cy治疗的高。
与观察的对照组相比较,SCP-IIA似乎主要是使巨噬细胞增强胞饮活动。
3.4SCP-IIA对脾细胞增殖的影响
只用Cy治疗动物的皮细胞增殖与正常对照组相比较明显下降。
与ConA或LPS结合,SCP-IIA能提高脾细胞的增殖。
50和100mg/L的SCP-IIa与ConA结合能显著促进和加强脾细胞的增殖。
200mg/L的SCP-IIa结合ConA促进脾细胞增殖更快。
100和200mg/L的SCP-IIa与LPS结合,为脾细胞增殖提供了明显的促进和加强。
与ConA或LPS结合后(图3),SCP-IIa表明一个明确和清晰的脾细胞增殖的协同效应。
3.5SCP-IIa对血清溶血素形成的影响
正如在表2中所示,仅用Cy处理的动物与空白对照组相比,所形成的血清溶血素显著下降。
用200mg/kgSCP-IIa与Cy相结合动物所形成的血清溶血素比仅用Cy的动物相比显著增加。
图2。
SCP-IIa的高效液相色谱档案。
样品用WatersUltrahydrogel250柱(8.0mm×300mm)进行分析,以0.5mL/min的流速,用0.1mol/LNaCl进行洗脱。
4讨论
五味子是一种名贵的中国传统药物。
在近年来,许多研究表明,五味子多糖有广泛的药理作用。
我们分离和纯化的SCP-IIa来自于五味子使用沸水提取,乙醇沉淀,离子交换色谱法和硅胶柱色谱法提取出来的。
SCP-IIa是一种结构均匀的多糖,平均分子量约为7700Da。
我们的研究结果为进一步研究五味子多糖的生物活性机制提供了依据。
人体的免疫功能包括非特异性和特异性的机制。
非特异性免疫是指具有一定程度的抵抗各种病原微生物的防御。
它没有特殊的选择性,也被称为作为自然或先天免疫。
特异性免疫保护身体免受一种微生物或其产物影响,包括体液免疫和细胞机制。
为了创建一个免疫力下降的模型,我们用Cy治疗小鼠,这是一种用于癌症的化疗药物,对正常细胞的DNA有伤害的副作用。
在我们的模型中,我们通过见害臊脾脏和胸腺指数来证明Cy的影响,因为Cy处理能够降低免疫系统的容量。
与正常小鼠相比,用Cy治疗的小鼠具有更低的脾脏和胸腺指数,表明Cy具有免疫抑制作用。
胸腺和脾脏是重要的免疫器官。
它们的体重是有机体的非特异性免疫重要和直观的指标。
免疫增强剂可以增加胸腺和脾脏的重量。
SCP-IIa测试组相对脾和胸腺重量的均显着高于模型组。
SCP-IIA明显增加脾指数以剂量依赖的方式。
图3SCP-IIA刺激丝裂原诱导的脾淋巴细胞的增殖。
报告数据以平均值±标准差组(n=10)。
测定显着利用学生的t-检验。
a.P<0.01,与所匹配的对照组进行比较。
b.P<0.05,与只用Cy处理的模型组相比。
c.P<0.01,与只用Cy处理的模型组相比。
巨噬细胞在所有多细胞生物的进化上,是古老的和保守的细胞。
与中性粒细胞一起,它们组成宿主防御的第一道屏障,第二道是上皮屏障。
巨噬细胞可以作为抗原呈递细胞,并可以与T淋巴细胞调节适应性免疫反应【19】。
此外,巨噬细胞在胚胎发育时参与了组织重构,创伤修复,凋亡细胞的清除,和造血【20,21】。
活化的巨噬细胞不仅参与特定及非特异性免疫反应,而且是这两个免疫反应的“桥细胞”【22】。
本研究探讨腹腔吞噬细胞的吞噬活性。
SCP-IIa预处理的小鼠的吞噬率与用Cy诱导的小鼠一样减少。
200mg/kgSCP-IIa组显示吞噬功能增幅最大。
这些表明,SCP-IIA的管理显着增加腹腔巨噬细胞的吞噬能力,以剂量依赖的方式。
淋巴细胞增殖在细胞免疫和体液免疫反应上都是一个至关重要的事情【23】。
在体外由ConA引起的淋巴细胞可以用来作为评估T淋巴细胞的活性一种方法,而LPS诱导可用于评价B淋巴细胞活性【24】。
本研究中发现诱导的Cy能抑制ConA诱导的T淋巴细胞增殖和LPS诱导的B-淋巴细胞的增殖。
SCP-IIa对于脾细胞的T细胞比B细胞出现更好的灵敏度,这导致T细胞接到更好的免疫刺激作用。
血清溶血素的形成与SRBC免疫反映体液免疫功能【25】。
我们的研究结果表明,SCP-IIa显着增加Cy免疫抑制小鼠血清溶血素形成。
这些表明,SCP-IIa能增强体液免疫活动。
5结论
总之,SCP-IIa表现出强效的免疫反应的特性,如改善免疫器官的重量,提高小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力,促进溶血素形成,提高淋巴细胞转化。
我们的研究表明,SCP-IIa在体内参与免疫调节作用。
这项研究可能为SCP-IIa作为一种有效的辅助免疫增强剂的使用提供了一个基础,并应探讨作为一个强大的潜在的免疫增强剂而用于食品和药品。
因此,从五味子中提出出来的多糖具有显著的治疗潜力,能够代表未来发现和开发具有医疗价值的新的呼和无的丰富来源,当然,这需要我们采取更多的关注。
致谢
致谢
这项研究是由以下基金支持:
山东省自然科学基金(ZR2011HQ044);
潍坊科技发展部门(201101178);
中国潍坊传统医学科技项目卫生局(2009016)。
参考文献
[1]W.YWang,J.G.Chen,J.BeihuaUniv.(Nat.Sci.)8(2007)128–133.
[2]H.Kiyohara,T.Matsumoto,N.Takemoto,H.Kawamura,Y.Komatsu,H.Yamada,
PlantaMed.61(1995)429–434.
[3]Y.W.Zhang,H.Kiyohara,T.Matsumoto,H.Yamada,PlantaMed.63(1997)
393–399.
[4]T.Matsumoto,X.B.Sun,T.Hanawa,H.Kodaira,K.Ishii,H.Yamada,Phytother.
Res.16(2002)91–93.
[5]P.J.Gao,Y.F.Pu,X.L.Guo,D.Y.Ju,B.Ren,J.NormanBethuneUni.Med.Sci.22
(1996)23–24.
[6]M.Miao,ChinaJ.Tradit.Chin.Med.Pharm.17(2002)187–188.
[7]L.Huang,L.Chen,Z.L.Zhang,ZhongCaoYao27(2004)202–203.
[8]A.O.Tzianabos,Clin.Microbiol.Rev.13(2000)523–533.
[9]A.I.Schepetkin,M.T.Quinn,Int.Immunopharmacol.6(2006)317–333.
[10]Y.J.Jeon,S.B.Han,K.S.Ahn,H.M.Kim,Immunopharmacology43(1999)1–9.
[11]K.Y.Lee,Y.J.Jeon,Int.Immunopharmacol.3(2003)1353–1362.
[12]C.Bodinet,U.Lindequist,E.Teuscher,J.Freudenstein,Phytomedicine9(2002)
606–613.
[13]O.H.Lowry,N.J.Rosebrough,A.L.Farr,R.J.Randall,J.Biol.Chem.193(1951)
265–275.
[14]M.G.Sevag,D.B.Lackman,J.J.Smolens,Biol.Chem.124(1938)425–436.
[15]M.Dubois,K.A.Gilles,J.K.Hamilton,P.A.Rebers,F.Smith,Anal.Chem.28(1956)
350–356.
[16]X.Li,L.L.Jiao,X.Zhang,W.M.Tian,S.Chen,L.P.Zhang,Int.Immunopharmacol.
8(2008)909–915.
[17]X.F.Du,C.Z.Jiang,C.F.Wu,E.K.Won,S.Y.Choung,Arch.Pharm.Res.31(2008)
1153–1159.
[18]R.M.Yu,L.Y.Song,Y.Zhao,W.Bin,L.Wang,H.Zhang,Y.H.Wu,W.C.Ye,X.S.
Yao,Fitoterapia75(2004)465–472.
[19]R.W.Birk,A.Gratchev,N.Hakiy,O.Politz,K.Schledzewski,P.Guillot,C.E.
Orfanos,S.Goerdt,Hautarzt52(2001)193–200.
[20]M.W.Lingen,Arch.Pathol.Lab.Med.125(2001)67–71.
[21]A.H.Klimp,E.G.E.deVries,G.L.Scherphof,T.Daemen,Crit.Rev.Oncol.Hematol.
44(2002)143–161.
[22]W.X.Chen,W.Y.Zhang,W.B.Shen,K.C.Wang,Cell.Immunol.262(2010)69–74.
[23]C.Zhao,M.Li,Y.F.Lu,W.K.Wu,Carbohydr.Res.341(2006)485–491.
[24]F.Cerqueira,A.Cordeiro-Da-Silva,C.Gaspar-Marques,F.Simoes,M.M.Pinto,
M.S.Nascimento,Bioorg.Med.Chem.12(2004)217–223.
[25]H.Y.Liu,J.Chang,K.Gao,H.Y.Wang,L.Wu,Y.H.Xue,ChinaDairyInd.34(2006)
37–39.
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 一种 五味子 果实 提取 免疫 多糖