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DAPI
DAPI
CAS#:
28718-90-3
中文名:
4',6-联脒-2-苯基吲哚二盐酸盐
英文名:
4',6-Diamidino-2-phenylindole,dihydrochloride
结构式:
分子式:
C16H17Cl2N5
分子量:
350.25
性质:
1.外观:
黄色粉末
2.纯度:
≥95%(HPLC)
3.产品描述:
DAPI是一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料。
和双链DNA结合后可以产生比DAPI自身强20多倍的荧光。
和EB(ethidiumbromide)相比,对双链DNA的染色灵敏度要高很多倍。
DAPI染色常用于细胞凋亡检测,染色后用荧光显微镜观察或流式细胞仪检测。
DAPI也常用于普通的细胞核染色以及某些特定情况下的双链DNA染色。
因为DAPI是含有特定AT序列DNA的一种嵌入剂,它能像Hoechst染料一样粘附在DNA双螺旋的小沟区。
尽管DAPI不能通过活细胞膜,但却能穿透扰乱的细胞膜而对核染色。
DAPI具有很高的光漂白承受水平,能用来检测酵母线粒体DNA,叶绿体DNA,病毒DNA,microplasmDNA以及染色体DNA。
DAPI-DNA复合物的激发和发射波长分别为360nm和460nm。
4.染色过程
(1)用1mLddH2O将DAPI溶解,制得2.9mM的DAPI溶液(1mgDAPI/1mLH2O)。
注:
DAPI不能直接用PBS等缓冲溶液溶解,需要先用水将其溶解。
(2)取适量DAPI水溶液加到PBS中,制备成10~50µM的DAPI溶液。
推荐以下PBS的配制方法:
将8.00gNaCl、0.20gKCl、2.9gNa2HPO4·12H2O、0.2gKH2PO4溶解于1L纯水中。
(3)将1/10培养基体积的DAPI溶液加入到细胞培养基中。
也可以用1/10浓度的DAPI缓冲液代替培养基。
(4)在37℃培养细胞10~20分钟。
(5)用PBS或合适的缓冲液洗细胞两次。
(6)用带有360nm激发波长,460nm发射波长的滤光片的荧光显微镜观察细胞。
储存条件:
-20℃,避光保存
注意事项:
DAPI对人体有一定刺激性,请注意适当防护。
荧光染料都存在淬灭的问题,建议染色后尽量当天完成检测。
为减缓荧光淬灭可以使用抗荧光淬灭封片液。
DAPI保存:
放在4℃保存。
DAPI配制:
使用无菌三蒸水溶解,可以将10mgDAPI溶解在10ml水中,使用冻存管分装,每一管1ml,-20℃冻存。
使用的时候,先取一管放在4℃。
染色:
把培养皿中的培养基换一次液,每一个皿中放4-8ml培养基,使用微量加样器加DAPI到培养皿中。
浓度50ug/ml,也就是4ml培养基对0.2mlDAPI工作液,注意避光,无菌操作。
移植前使用PBS洗6遍,使用DMEM混悬,每一皿细胞混悬在1mlDMEM中,放在1ml管中,备用。
染色可以2小时,或者移植前一天染色,都可以的。
以前整理的dapi染色相关资料,在dxy搜索。
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1.用1mlddH2O将DAPI溶解,制得2.9mM的DAPI溶液(1mgDAPI/1mlH2O)。
*
*DAPI不能直接用PBS等缓冲液溶解,需要先用水将其溶解。
2.取适量DAPI水溶液加到PBS*中,制备成10-50µM的DAPI溶液。
a)
*推荐以下PBS的配制方法:
NaCl:
8.00gKCl:
0.20gNa2HPO4.12H2O:
2.9gKH2PO4:
0.2g
以上试剂溶解于1000ml纯水中
3.将1/10培养基体积的DAPI溶液加入到细胞培养基中。
b)
4.在37℃培养细胞10-20分钟。
5.用PBS或合适的缓冲液洗细胞两次。
6.用带有360nm激发波长,460nm发射波长的滤光片的荧光显微镜观察细胞。
a)由于DAPI可能具有致癌性,请小心操作。
b)也可以用1/10浓度的DAPI缓冲液代替培养基。
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CM-Dil和DAPI的,因为者两种都是荧光染料,只不过CM-Dil是标记细胞膜的,而DAPI是标记细胞核的,但大家都认为用DAPI标记细胞,细胞死亡后DAPI会释放出来将周围为标记的细胞染上DAPI,那么CM-Dil是否也存在这样的问题呢?
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比较认可的活细胞标记方法可采用PKH26染色,荧光可在体内存留一个月,并可进行核等的复染。
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但是DAPI染色进行的干细胞示踪的文章有些杂志主编不承认,主要是因为细胞破裂后释放出的DAPI会使周围的细胞都染色,尤其是血管内皮细胞。
我看到的文献说DAPI标记细胞以后,在体内是不会再使周围的细胞染色。
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我也是用DAPI标记骨髓间充质干细胞,DAPI的激发光波长为358nm,发射光波长为461nm,荧光激发下发蓝光,与细胞核DNA结合,染核。
它不会影响细胞生长、分裂、分化,并且可以通过细胞的有丝分裂使子代细胞核染色。
染色后,通过换液,可以除去培养基中残留的染色剂,避免非染色目的细胞染色,出现假阴性结果。
细胞经过DAPI染色后,不会出现染色剂脱落而使相邻细胞染色,所以不会影响其在实验中的示踪作用。
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我的同学做过,做大鼠的心脏可以在一个月以后检测到。
我的另一个朋友做兔子的膀胱肿瘤,他说在14天的时候很强,21天的时候比较弱,再长的时间就没有检测过。
我自己现在还没有对移植后的细胞检测。
文献上说50天以后还可以看到DAPI的标记。
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前一段时间做干细胞的DAPI染色,把自己收集的一些相关资料和自己的经验写在这里,希望能够给做DAPI染色的战友一点帮助。
将培养中的细胞进行DAPI染色,标记细胞核。
DAPI保存:
放在4℃保存。
DAPI配制:
使用无菌三蒸水溶解,可以将10mgDAPI溶解在10ml水中,使用冻存管分装,每一管1ml,-20℃冻存。
使用的时候,先取一管放在4℃。
染色:
把培养皿中的培养基换一次液,每一个皿中放4-8ml培养基,使用微量加样器加DAPI到培养皿中。
浓度50ug/ml,也就是4ml培养基对0.2mlDAPI工作液,注意避光,无菌操作。
移植前使用PBS洗6遍,使用DMEM混悬,每一皿细胞混悬在1mlDMEM中,放在1ml管中,备用。
染色可以2小时,或者移植前一天染色,都可以的。
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DAPI除与DNA双链结合外,还可与细胞浆中的微管蛋白结合,故胞浆也
着蓝色。
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一般用PBS缓冲液漂洗至少6次以洗掉未结合的DAPI,建议多洗几次
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DAPI可以用PBS\培养基来配制,这样可以在细胞培养时,直接进行染色。
但工作浓度一般较低的,约1~5μg/mL
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DAPI标记的原理,应用以及优缺点
一、DAPI的特性
DAPI荧光染料是由Dann等人于1971年合成的,共化学名称为4',6-diamidino-2-phenylindole,dihydrochloride(DAPI)的中文名称是4,6-联脒-2-苯基吲哚,其结构式为
是一种常用的荧光染料,分子量为350.3.这种二价阳离于的荧光染料是一种黄色晶体易镕于水,最大溶解度为2.5%.可按高浓度的两价或高价阴离于(硫酸盐离子和磷酸盐离子)所沉淀,其作用机理与溴化乙锭等染色剂的机理类似:
DAPI具有与各种来源的、富古A—T碱基对的DNA专一结合的特点.DAPI与DNA形成的复合物发出志强度的浅蓝色荧光.共最大的激发波长为372nm,最大的发射波长为454nm,其荧光可按适当浓度的SO42-加强.DAPI最初是作为一种杀锥虫剂合成的,以后用于DNA的检测.Brunk等和Coleman等人证明了DAPI荧光强度与细胞内的DNA含量呈正比,并指出,在pH4—8范围内,DAPI-DNA复合物的荧光强度不受pH变化的影响.用DAPI染色法可以测出2x10-16gDNA。
近年来,DAPI多用于细胞生物学和细胞遗传学的研究,由于死、活细胞的细胞膜对DAPI的通透性不同,极低浓度(0.5ug/ml)的DAPI就可与死亡细胞的DNA结合,产生明亮而稳定的荧光,所以人们开始把这一理想的话体荧光染科用于微生物、植物和动物细胞的细胞生物学和生物化学的研究。
作为一种新型的DNA荧光染科,它具有专一性强、灵敏度高、稳定性好等特点,而且迄今尚来见到DAPI致癌。
致畸等毒性报告.有文献称之为无毒性荧光染料(Renard,1982).
利用DAPI能与细胞DNA稳定结合这一特性,最近被人们用于干细胞的体内示踪。
如造血干细胞和间充质干细胞的体内移植。
Ssx
DAPI是一种标记细胞核的荧光染料,因其与dsDNA有高度的亲和力,与DNA结合后会发出强烈的荧光。
DAPI对活细胞无毒性,不改变细胞器的超微结构,荧光保持时间较长。
文献显示DAPI标记的肌卫星细胞移植到宿主心肌2月后仍然可以看到。
但DAPI在电镜下没有显示,若进行超微结构追踪观察需结合其它特殊的抗体标记。
二、方法
Cells主任介绍了利用DAPI染色标记细胞核的方法:
实验用具及材料
试剂:
PBS,胎牛血清(FBS),固定液,DAPI染色液,DMEM培养基,胰酶(Trypsin)
器材:
培养皿,15ml离心管,试剂瓶,微量移液器,脱色摇床,锡箔,荧光显微镜和CCD
溶液配制
(1)固定液:
将4g多聚甲醛加入80mlPBS中,搅拌过夜或者搅拌过程中微热直至固体全部溶解,定容至100ml就成为4%的多聚甲醛固定液。
(2)DAPI染色液:
在500ml水中加入8.5gNaCl和1.2gTris碱,用盐酸调pH值至7.4,再加入4ml500mM的CaCl2和44ml500mM的MgCl2以及0.05g的BSA;最后加入10mg的DAPI和100ml的DMSO,定容至1L,4度保存。
实验步骤
(1)转染两天后的细胞吸取培养基后,PBS洗一次。
(2)用4%的多聚甲醛P
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