高原鼢鼠肉木瓜蛋白酶酶解物对小鼠免疫功能的阻碍.docx
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高原鼢鼠肉木瓜蛋白酶酶解物对小鼠免疫功能的阻碍
高原鼢鼠肉木瓜蛋白酶酶解物对小鼠免疫功能的阻碍
潘明,赵弋清,侯假设彤,刘素君,杨志荣
【摘要】目的研究高原鼢鼠肉蛋白的木瓜蛋白酶酶解物生理活性功能,对酶解物进行了免疫活性实验。
方式通过MTT法和中性红比色法测定其对小鼠脾淋巴细胞增殖、腹腔巨噬细胞吞噬功能、网状内皮系统吞噬功能、NK细胞杀伤毒性,鼠抗体生成脾细胞数(IgMPFC)的阻碍。
结果酶解物高、中剂量与对照相较有显著不同,而其中以高剂量组的活性最明显,能够显著提高小鼠淋巴细胞的增殖能力;激活小鼠网状内皮系统,增强吞噬功能;增强NK细胞活性;增加小鼠脾脏的抗体生成细胞数。
结论高原鼢鼠肉蛋白的木瓜蛋白酶酶解物能明显提高正常小鼠细胞免疫、体液免疫及NK细胞杀伤毒性的能力。
【关键词】高原鼢鼠肉;木瓜蛋白酶;酶解;免疫功能
Abstract:
ObjectiveInordertoinvestigatethephysiologicalfuntionsofpapaindigestofMyospalaxbaileyifleshprotein,immuneactivityexperimentwasdonewiththedigest.MethodsMTTmethodandneutralredcolorimetricmethodwereappliedtomeasuretheeffectofthedigestontheproliferationofspleenlymphocyteofmice,thephagocyticfunctionofceliacmacrophageandreticuloendothelialsystem,thekillingtoxicityofNKcells,andthenumberofsplenocyteinducedbyratantibody(IgMPFC).ResultsThegroupswithhighandmiddledosagehavesignificantdifferencefromthecontrolgroup,withthehighdosagegroupshowingthemostobviousactivity.ConclusionThepapaindigestofMyospalaxbaileyifleshproteinhasasignificantpromotioneffectonthecellandhumoralimmunityofnormalrataswellasthekillingandtoxicityactivityofNKcells.
Keywords:
Myospalaxbaileyimeat;Papain;Hydrolysis;Immunefunction
高原鼢鼠Myospalaxbaileyi是栖息于青藏高原的一种危害草场和农田的数量庞大的地下啮齿动物。
据营养成份的分析结果(《四川动物》待发),高原鼢鼠肌肉除含有亚油酸等对人体有利的不饱和脂肪酸外,还有丰硕的蛋白质,钙、镁、铁、锌、磷等无机盐和烟酸、核黄素、视黄醇等维生素,是一种营养价值很高的蛋白质资源。
最近几年的研究说明,蛋白质水解为小肽后就能够够被人体吸收[1],而蛋白质水解产物具有蛋白质无法比拟的生理功能和营养价值。
近几年对高原鼢鼠肉的研究集中在脂溶性成份抗缺氧机制上[2~5],目前尚未见对高原鼢鼠肌肉蛋白酶解液免疫功能的相关研究报导。
为了综合开发利用高原鼢鼠资源,变害为宝,提高高原鼢鼠肉蛋白的营养和利用价值,本研究采纳酶法水解高原鼢鼠肉,对酶解液的氨基酸成份进行了分析,并针对免疫系统中T淋巴细胞、B淋巴细胞和NK细胞,进行了T淋巴细胞转化实验、小鼠抗体生成脾细胞数(IgM-PFC)、NK细胞杀伤毒性实验等免疫学实验,探讨高原鼢鼠肉酶解液对小鼠免疫功能的阻碍。
1材料与方式
材料与试剂
材料
高原鼢鼠Myospalaxbaileyi:
捕于四川省阿坝州假设尔盖县。
试剂
木瓜蛋白酶×105U/g,美国Sigma公司产品;RIMP1640培育基,美国GIBCO公司产品;MTT,ConA,LPS;Alsever溶液;Hank's溶液;%戊二醛溶液;%绵羊红细胞悬液。
其它试剂:
市售,均为分析纯。
动物
昆明种健康成年小鼠,雌雄各半,体重20~22g,由四川大学华西实验动物中心提供。
仪器与设备
DS1高速捣碎机(上海标本模型厂);KMTD500型电热恒温震荡水槽(上海益恒实验仪器);LD510型离心机(北京医学仪器厂);KQ400超声波发生仪(昆山市超声仪器);Phs2c型pH计(上海虹益仪器厂);751G型紫外光栅可见分光光度计(上海分析仪器厂)等。
方式
酶解液制备[6]高原鼢鼠Myospalaxbaileyi肉木瓜蛋白酶解液,酶解液100℃煮沸10min,冷却至室温,以10000r/min,离心5min,搜集上清液。
残渣再重复提取两次,归并3次的上清液,静置,分去油脂后真空浓缩,真空干燥得酶解高原鼢鼠肉蛋白,密封冷藏。
酶解液氨基酸分析
采纳日立83550型氨基酸分析仪进行测定。
脾细胞悬液的制备将上述昆明小鼠40只,随机分为正常组、酶解物大、中、小剂量组,每组10只,持续灌胃7d,颈椎脱臼处死小鼠,无菌条件下取脾,置于盛有无菌Hank’s液的小平皿中撕碎,在200目不锈钢筛上轻轻研磨过网,用无菌Hank's液洗3次,离心10min/次(1000r/min)。
将细胞悬浮于2mlRIMP1640培育液中,用台盼兰染色检查细胞成活情形,选择成活细胞在95%以上者进行实验。
调整细胞浓度为2×105个/L。
T淋巴细胞转化实验[7]将细胞悬液分两孔加至24孔培育板中,1ml/孔,一孔加ConA液50μl(相当于5mg/ml),另一孔作为对照,置5%CO2,37℃条件下培育72h。
培育终止前4h,每孔吸去上清液ml,加入不含小牛血清的RPMI1640培育液,同时加入MTT50μl/孔(5mg/ml),继续培育4h。
培育终止后,每孔加入1ml酸性异丙醇,吹打均匀,使紫色结晶完全溶解,然后分装到96孔培育板中,每一个孔分装3孔作为平行样,用酶联免疫检测仪,在波长570nm处测定吸收度。
对小鼠抗体生成脾细胞数(IgMPFC)的阻碍:
给药途径、剂量及方式同项。
处死前5d,每只小鼠腹腔注射生理盐水配制成的20ml/LSRBCml(约2×108个)。
将经SRBC免疫5d的小鼠处死,掏出脾,放在盛有HankS液的小平皿内,轻轻撕碎脾,制成细胞悬液,经200目筛网过滤,离心洗净,将细胞悬浮在5mlRIMP1640培育液中,调剂至细胞浓度为5×106个/ml,取20μl脾细胞悬液、50μl含100ml/LSRBC的SA液及ml处置的表层琼脂糖培育液,混匀,倾倒于已刷琼脂糖薄层的玻片上,待琼脂凝固后,将玻片水平扣放在片架上,放入CO2培育箱温育~h,然后将SA缓冲液稀释的补体(1∶10)加入到玻片架的凹槽内,继续温育~h,形成肉眼可见的空斑后计数溶血空斑数。
测定每5×106个脾细胞产生的空斑数。
NK细胞杀伤毒性实验[8]
用含10%小牛血清的RIMP1640培育液脾细胞悬液配成1×107/ml浓度作为效应细胞;传代培育的L929细胞在实验前1d换液,实验时用%胰蛋白酶1~2ml消化1~2min,加完全RIMP1640培育液,吹打使其完全从壁上脱落,离心去上清,加含小牛血清的培育液,调至浓度为2×105/ml,作为靶细胞;在96孔板内加入靶细胞悬液,每孔ml,放入37℃,5%CO2孵箱中培育1h,使其贴壁成单层细胞,然后实验孔加入ml效应细胞悬液,做4个复孔,靶细胞对照孔加完全RIMP1640培育液ml;然后将96孔板放在37℃,5%CO2孵箱中孵育20h,去上清用生理盐水轻轻注满各孔,反复3次,以除去效应细胞和被杀伤脱落的靶细胞,在滤纸上吸干孔内水分;每孔加入ml的%中性红染液,孵育30min,弃去染液,用生理盐水洗3遍,每孔加ml细胞溶解液,使含有中性红的靶细胞溶解,摇匀,用酶标仪测OD值,波长450nm,用以下公式计算杀伤率。
实验数据采纳方差分析查验。
杀伤率(%)=(靶细胞OD值-实验组OD值)靶细胞OD值×100%
2结果
水解液的成份分析在以上确信的最正确条件下水解取得的水解液呈淡黄色透明状态,氨基酸分析结果见表1。
表1水解液的游离氨基酸和总氨基酸的分析(略)
T淋巴细胞转化实验结果见图1。
结果显示,与对照组相较,不同剂量组酶解产物对小鼠脾T淋巴细胞增殖活性均有必然阻碍,存在明显的剂量依托关系,其中在浓度较低(低剂量组)时,对淋巴细胞增殖活性的调剂作用很小,随着添加浓度的增大,作用慢慢明显,当浓度为g/kg(高剂量组)时,增殖作用达到最大,与正常对照组比较,不同有显著意义(P<)。
从表1可见,高原鼢鼠肉蛋白水解液含8种必需氨基酸在内的17种氨基酸,且必需氨基酸占总氨基酸量的%,说明高原鼢鼠肉水解后其必需氨基酸数量充沛,组成比例较为合理,符合FAO/WHO建议的人体必需氨基酸模式;E/N=,大于FAO/WHO推荐的;高原鼢鼠水解液中含有较高量婴幼儿所需的组氨酸和精氨酸,因此高原鼢鼠肉水解液是一种优质蛋白液;由于其中氨基酸(谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸和丙氨酸等)的含量较高,占氨基酸总量的%,故水解液味道超级鲜美。
酶解液对小鼠抗体生成脾细胞数(IgM-PFC)的阻碍图2显示,各组小鼠脾脏的抗体生成细胞数依次升高,其中,酶解液高剂量组、中剂量组与对照组比较,不同具有显著性意义(P<,说明酶解液具有增强小鼠特异性体液免疫的功能。
图3显示,酶解液低剂量组、酶解液中剂量组、酶解液高剂量组与生理盐水组比较,NK杀伤率均有提高;其中,酶解液低剂量组、酶解液中剂量组、与生理盐水组比较,不同具有显著性意义(P<;酶解液高剂量组与生理盐水组比较,不同具有极显著性意义(P<,说明高原鼢鼠肉木瓜蛋白酶解液能提高机体免疫力。
3讨论
高原鼢鼠肉木瓜蛋白酶解产物是氨基酸与多肽的混合物,酶解能改变蛋白质的功能特性,如酶解能大大提高其溶解性;必然程度的水解也能提高其乳化性等,肽作为动物消化道蛋白质的酶解产物,是被迅速吸收的氨基酸供体,能够调剂动物体消化、神经、内分泌和免疫等系统的生命活动,这种物质被称为腔内信号分子,随着肽吸收理论为愈来愈多的人们同意,活性肽在动物蛋白质营养中的作用愈发受到关注,因此有人提出蛋白质的营养是肽的营养。
机体免疫功能专门是细胞免疫功能下降,是致使细菌和病毒感染等发病率高的要紧因素,体外淋巴细胞转化实验是目前测定机体细胞免疫功能状态的一种较好的方式[9]。
自然杀伤细胞(NK细胞)是一类重要的免疫调剂细胞,是机体细胞免疫功能的组成部份,能非特异性地杀伤靶细胞,参与细胞免疫,在肿瘤免疫、抗病毒感染中也具有重要作用,其介导的细胞毒性作用是肿瘤细胞免疫监视的第一道防线,因此,NK细胞在肿瘤免疫中的作用愈来愈受到重视,是目前已被公认的免疫监视中最重要的效应细胞。
因此,研究生物活性物质对NK细胞杀伤活性的阻碍有重要意义。
对T-细胞依托的抗原SRBC的抗体反映是体液免疫能力的表现,它是免疫力分析中最灵敏和最优先的参数[10],体内对SRBC的抗体反映,是反映了增加抗原细胞、T-细胞、B-细胞之间协同能力的免疫反映。
本实验为了综合开发利用高原鼢鼠资源,探讨高原鼢鼠肉酶解液对小鼠免疫功能的阻碍,变害为宝,提高高原鼢鼠肉蛋白的营养和利用价值,采纳酶法水解高原鼢鼠肉取得的酶解物,针对免疫系统中T淋巴细胞、B淋巴细胞和NK细胞的免疫学实验。
实验说明酶解物具有增强细胞免疫活性、体液免疫活性及NK细胞杀伤毒性的能力。
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