保护皮肤对抗病原微生物的方法和手段的制作方法.docx
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保护皮肤对抗病原微生物的方法和手段的制作方法
保护皮肤对抗病原微生物的方法和手段的制作方法
专利名称保护皮肤对抗病原微生物的方法和手段的制作方法
技术领域本发明涉及微生物,其能够刺激固有皮肤^l生物菌群的生长,而不刺激暂居病原微生物菌群的生长。
本发明也涉及包含此类微生物的组合物,例如化妆品的或药物的组合物,而且涉及此类^:
生物在化妆品、预防或治疗应用中的用途。
背景技术人皮肤上定居着大量多样的微生物,其主要在相对稳定的组合物中作为共生体在皮肤表面生存(Roth和James,1988)。
此类正常的皮肤菌群被称为'固有皮肤菌群'。
人皮肤的主要功能是保护其下面的组织对抗环境影响(Feingold,1985)。
此类正常的皮肤菌群特别保护皮肤对抗可能的病原微生物入侵(Bisno,1984)。
某些微生物在固有菌群中占优势,大于卯%的固有微生物菌群为表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)(凝固酶阴性)、某种微球菌(Micrococcusspec.)、类白喉菌(Diphteroids)和丙酸杆菌propionibacteria)(Leyden等人,1987)。
因此,天然皮肤菌群的稳定支持皮肤的保护作用和预防病原入侵。
增强皮肤的健康。
在一些临床研究中已描述了天然皮肤菌群的重要性。
已显示在嬰儿出生后最初几天,这类皮肤菌群还未发展,因此金黄色葡萄球菌感染的危险非常高。
随着菌群的渐增发展,皮肤可防御病原微生物的定居(Hurst,1959)。
在另一个关于嬰儿的研究中,观察到用抗生素羟氨节青霉素处理以后,固有菌群被严重抑制(约50%)。
这导致致病酵母白色念珠菌(Candidaalbican)产生大于14倍的增加。
抗生素处理的终止会导致固有菌群恢复和白色念珠菌阻遏(Brook,2000)。
固有皮肤菌群的微生物通过竟争皮肤表面的附着位点和必需营养来防御病原微生物的定居(Sullivan等人2001)。
病原微生物能够通过特异结合蛋白质附着于表皮结构。
在本发明中已知不同的机制。
例如已知来自金黄色葡萄球菌的特异黏附素。
这些允许病原微生物附着于纤连蛋白结构。
病原体通常具有附着于宿主的较高可能性。
这说明了这些微生物的毒性(Gibbons和Houte,1975)的。
当皮肤表面有微小损伤或其它损坏时,特别当正常皮肤菌群被抗生素或过度洗涤而损害时,病原微生物定居的危险就会急剧增加(Elek,1956)。
然而,关于营养利用的方面,固有皮肤菌群能更好地适应于皮肤。
这是固有皮肤菌群的优势(Larson,2001)。
除此之外,固有皮肤菌群的有机体能够产生抵抗病原微生物的抗菌物质。
这也是固有微生物关于营养和能量来源方面的优势(Sehvyn和Ellis,1972;Milyani和Selwyn,1978)。
而且,皮肤分泌的物质,如复合脂(甘油三酯),被降解为抑制病原微生物的不饱和脂肪酸,其中病原微生物是例如致热链球菌(Streptococcuspyrogenes)或革兰氏阴性细菌和真菌(AIy等人,1972)。
微生物皮肤菌群影响几个化妆品相关的皮肤因素。
包括皮肤的pH值、屏障功能和脂类含量。
表皮葡萄球菌能够通过降低pH值(约4-6)而对抗病原微生物。
在降低的pH值条件下病原体不能生长(Korting等人,19卯;Lukas,1990;Korting,1992;Yosipovitch和Maibach,1996;Gfatter等人,1997)。
皮肤的水屏障功能和脂类含量依赖于角质层的神经酰胺含量(Imokawa等人,1986)。
神经酰胺含量降低会引起皮肤干燥和开裂。
对皮肤具有这些表现的遗传过敏性皮炎(atopicaldermatitis)患者的研究显示微生物皮肤菌群戏剧性地改变为金黄色葡萄球菌。
此类病原体的特征是有非常高的神经酰胺酶活性,而正常的固有皮肤菌群共生体则不具有此类活性。
在皮肤中产生释放神经酰胺的鞘磷脂酶活性在遗传过敏性皮炎患者的固有和病原菌群中是相似的(Ohnishi等人,1999)。
因此,需要保护皮肤(特别是人皮肤)对抗病原微生物的手段和方法。
发明内容
本发明阐述这种需要,并且提供保护皮肤对抗病原微生物定居的微生物和方法。
特別提供在权利要求中被表征的实施方案。
因此,本发明的第一方面涉及能够刺激一种或多种固有皮肤微生物菌群生长的微生物,其不刺激暂居病原微生物菌群生长。
发明人令人惊讶地发现,可以通过将上述微生物或其无活性形式向皮肤给药来实现皮肤对抗病原微生物定居的有效保护。
发明者首次鉴定了相应的微生物和提供了它们的鉴定方法。
这些微生物由于特异性刺激固有皮肤微生物菌群的生长,因而能够再生和稳定天然皮肤菌群。
这样使病原微生物的生长受到抑制。
此外,可以防护病原微生物进入皮肤菌群。
当在皮肤较上层的微生物通过洗涤被除去时,本发明的孩i生物允许例如刺激在皮肤更深的角质层的固有菌群。
在皮肤上存在着许多不同的微生物。
一些属于皮肤正常(固有)菌群,是无害共生体,而一些是可能的病原体。
基本上,皮肤上的有机体可以分为两类1.固有有机体固有有机体永久定居于皮肤上,其定居在皮肤表面、角质层和表皮外层及皮肤和毛嚢的深缝中。
这些固有皮肤菌群的微生物能够在皮肤上生长和繁殖,不侵入或破坏皮肤组织。
较深皮肤区域中的这些有机体并不能通过洗涤轻易除去。
固有微生物是无害共生体。
2.暂居有机体暂居有机体是置于皮肤上、但是不在那里繁殖的微生物,或者在皮肤上繁殖和短期存在的污染物。
它们不能永久存在于健康皮肤上,健康皮肤的微环境主要由固有菌群所决定。
暂居有机体是可能的病原体。
因此,术语'固有皮肤菌群'指能够在健康皮肤上发现的微生物,优选人皮肤,并且其组成多数的皮肤上发现的微生物。
具体地,术语'固有皮肤菌群'指永久定居在皮肤表面、角质层和表皮外层及皮肤和毛嚢的深缝中的微生物。
这些微生物的特征在于它们能在皮肤上生长和繁殖,不侵入或破坏皮肤组织。
这些孩i生物的一个特征是在较深皮肤区域中不能通过洗涤轻易除去。
固有皮肤菌群的微生物是无害共生体。
术语'固有皮肤菌群'优选指在皮肤上(优选人皮肤)发现的需氧和厌氧微生物菌群。
更优选地,其指由表皮葡萄球菌(凝固酶阴性)、某种微球菌、类白喉菌和丙酸杆菌组成的微生物菌群。
通常,约卯%的需氧固有皮肤菌群由表皮葡萄球菌组成。
剩余的约10%主要由某种微球菌(80%藤黄微球菌(ikficwcoccws/wte附))和类白喉菌(13%)组成。
术语'类白喉菌'指广范围的属于才奉杆菌(0fy'e6ffcteW'附)属的细菌。
出于方4更,表皮类白喉菌分为如下4组亲脂或非亲脂的类白喉菌;厌氧的类白喉菌;产卟啉的类白喉菌。
厌氧皮肤菌群的主要代表(90%)是丙酸杆菌;特别疮疱丙酸杆菌(Propionibacteriumacnes)、茅贞沭立丙酸杆菌(P.granulosum)和贪婪丙酸杆菌(P.avidum)可以从皮肤中分离出来。
厌氧菌群占整个固有皮肤菌群的大约4%。
更优选地,大于卯%的微生物菌群属于表皮葡萄球菌、某种微球菌、类白喉菌和丙酸杆菌。
甚至更优选地,固有皮肤菌群的特征在于其主要成分是表皮葡萄球菌。
微生物皮肤菌群的成分和组分可以通过例如用苏格兰胶带剥离上层皮肤来定量和定性地确定。
固有皮肤菌群的微生物可以通过例如用苏格兰胶带剥离的IO层以内上层皮肤来鉴定。
可作为范例的,将6个2cir^的苏格兰胶带分别按在皮肤的确定区域(优选在前臂上)来分离这些微生物,然后每个胶带的剥离物从皮肤转移到用于革兰氏阳性(例如BHI,DifcoInc.)或者革兰氏阴性细菌的选择性琼脂培养平板上(例如麦康基琼脂,DifcoInc.),或者转移到酵母和真菌的选择性琼脂培养基上(例如平板计数琼脂,DifcoInc.)。
之后从皮肤转移到琼脂培养平板上的微生物在30。
C和37。
C、需氧和厌氧条件下培养约24小时。
通过形态学和生物化学方法进行定性分析和定量计数来确定菌落形成单位。
确定相对的组合物和总细胞计数。
本领域技术人员能够通过本领域内已知的方法确定如上所述分离的固有皮肤微生物菌群的属和/或种。
例如,本领域内技术人员可以通过代谢足迹法、脂肪酸
组合物和细胞壁组成等等来鉴定所述微生物。
术语'皮肤'指身体的外罩,其为本领域技术人员公知的。
优选地,该术语指三层表皮、真皮和皮下脂肪组织。
表皮是皮肤的最外层。
其通常在身体外表面形成防水的防护层,且由具有下基底膜的复层扁平上皮构成。
其通常不含有血管,且通过从真皮扩散而获得营养。
组成表皮的主要细胞类型是角质形成细胞,也存在黑色素细胞和朗氏细胞。
表皮被分为几层,其中细胞通过最内层的有丝分裂而形成。
它们向上层移动,在分化时改变形状和组成,且变为充满角蛋白。
它们最后到达被称为角质层的最上层,并且开始脱落或脱皮。
表皮的最外层由25到30层死细胞组成。
一般而言,表皮分为5个亚层或层(从表面到深入)角质层、透明层、颗粒层、棘层和生发层或基底层。
通常,表皮和真皮的接触面是不规则的,由连续乳头或指状突起组成,其在皮肤薄的地方最小,而在掌和足底皮肤中最长。
通常,掌和足底的乳头与表皮的高度相关联,其产生脊。
皮下脂肪组织是皮肤的最深层。
此层的特征在于其由结締组织、血管和脂肪细胞组成。
通常,此层连接皮肤与下层结构,使身体隔绝寒冷,并以脂肪的形式储存能量。
一般而言皮肤在深层组织上形成对抗物理、化学和细菌物质的防护屏障。
这意味着例如口腔或阴道区域或粘膜组织不属于皮肤。
在优选实施方案中,术语'皮肤'指身体覆盖物的最外层,即表皮。
在更优选的实施方案中,术语'皮肤'指表皮的角质层。
在甚至更优选的实施方案中,术语皮肤指表皮最外面的25到30层死细胞。
在最优选的实施方案中,术语'皮肤,,指表皮最外面的IO层死细胞。
术语'刺激'与固有皮肤菌群微生物菌群的生长相关联,指当与根据本发明的孩i生物接触时,一种或多种固有皮肤菌群微生物菌群的生长加速。
生长加速优选指增殖增加,即单位时间内细胞分裂增加。
可选择地,术语'刺激'也指个体细胞大小的增加。
细菌细胞大小可以通过用染料SYBRGreenI(分子探针,美国)染色后用流式细胞计量法(例如Becton-DickinsonFACSort流式细胞仪,SanJose,CA)来估算。
细菌细胞大小用偏角光散射(SSC)模式估算。
因此生长加速指单位时间内生物量产量的增加。
优选在体外观察固有皮肤菌群微生物菌群的生长刺激,更优选用一种测定方法,其中根据本发明的微生物与一种或多种固有皮肤菌群的微生物接触,并且测定这个(这些)固有皮肤菌群的微生物的生长。
可以通过在培养的不同时间间隔进行细胞/菌落计数来测定生长,并将其与不包含根据本发明的孩i生物的对照相比较,以此来确定生长是否加速。
在实施例中描述了测定生长刺激的体外测定方法,其包含所谓的'体外
孔平板测定'。
简言之,此类测定包含如下步骤
-培养至少一种固有皮肤菌群的微生物,将其均匀涂布到预备好的包含适
于各微生物生长(且优选检测)的适当琼脂培养基的琼脂平板上;
-在接种的琼脂平板提供孔;
-用预培养的根据本发明的微生物细胞填充孔;
-琼脂平板在允许固有皮肤菌群微生物菌群生长的条件下培养适当的时间;和
-检测在含有根据本发明的微生物的孔周围固有皮肤菌群微生物菌群的生长,且将其与不含根据本发明的微生物的孔周围微生物的生长相比较。
可获得的测定细胞和/或菌落数的手段和方法可以影响最后一步中生长的测定,例如用适当的染料染色和/或光学手段例如光密度法、和在显微镜下细胞/菌落计数。
甚至更优选地,固有皮肤微生物菌群的生长刺激也可以在原位皮肤测定中观察。
此测定方法在实施例中描述,其简要包括如下步骤-培养至少一种固有皮肤微生物菌群,将其均匀涂布于测试个体的皮肤区
域;
-将根据本发明的微生物的一部分准确涂布于固有皮肤微生物菌群涂布的
区域之内;
-培育足够时间以允许固有皮肤微生物菌群的生长;
-将上层皮肤层,包括其中包含的微生物,转移到含有适当生长培养基的
琼脂平板上;
-琼脂平板在允许固有皮肤微生物菌群生长的条件下培养一段时间;
-测定根据本发明的微生物涂布区域周围的固有皮肤微生物菌群的生长,并将其与没有涂布本发明微生物的对照中微生物的生长相比较。
此测定所使用的皮肤区域可能是个体的任何合适皮肤区域,优选人个体。
在优选的实施方案中,其为人个体前臂的皮肤区域。
区域的大小不是决定性的,优选约为l-40cm2,更优选5-20cm2,甚至更优选5-10cm2,例3口约5、6、7、8、9或10cm2。
将固有皮肤微生物菌群的微生物平均涂布于此区域,优选密度约为102cfu/cm2-103cfu/cm2。
涂布于皮肤的微生物在空气中干燥,并将整分试样的根据本发明的微生物准确涂布于该区域内。
这可以通过本领域内技术人员所公知的手段来实现。
例如,将根据本发明的微生物离心(15分钟,4000xg)。
细胞沉淀用K/Na-緩冲液洗两次(每次1ml)。
在200plK/Na緩沖液中重悬细胞,并将IOnl准备好的微生物用微量移液器准确应用于预接种的皮肤区域。
皮肤优选在室温培育例如2小时。
例如在粘性胶带剥离的帮助下可以转移上层皮肤,包括其中包含的微生物。
上层皮肤转移到琼脂平板中,该琼脂平板在允许所测试的微生物或固有皮肤菌群生长的温度下培养,并且使用已知支持此类微生物生长的生长培养基。
通常培养约24小时。
通过本领域内技术人员所公知的方法检测微生物的生长。
优选通过光密度法或计数在涂布整分试样的本发明微生物的点附近形成的菌落来测定。
细菌细胞大小可以通过用染料SYBRGreenI(分子探针,USA)染色后用流式细胞计量法(例如Becton-DickinsonFACSort流式细胞仪,SanJose,CA)来估算。
细菌细胞大小用偏角光散射(SSC)模式估算。
如果在体外孔平板测定中,微生物能导致至少一种这类固有皮肤微生物菌群生长加速,使其与未加微生物的对照相比至少增加5%,优选至少10%、20%、30%、40%、50%、60%或70%,更优选至少75%,和甚至更优选至少80%,和最优选至少85%,则此类微生物被认为是刺激一种或多种固有皮肤微生物菌群的生长。
更优选地,如果在原位皮肤测定中,微
生物能导致至少一种固有皮肤微生物菌群生长加速至少5%,优选至少10%、20%、30%、40%、50%、60%或70%,更优选至少75%,甚至更优选至少80%,和最优选至少85%,则此类微生物被认为是刺激一种或多种固有皮肤微生物菌群的生长。
在优选实施方案中,根据本发明的微生物刺激固有皮肤菌群的主要代表性微生物,即表皮葡萄球菌的生长。
词语'刺激生长'的含义如上所述,并优选指体外刺激,更优选在上文所描述的体外孔平板测定中。
甚至更优选地,其含意为在上文所描述的原位皮肤测定中的刺激。
最优选指体外以及原位测定方法中的刺激。
体外孔平板测定和原位皮肤测定优选如实施例中所述执行。
在优选的实施方案中,本发明的微生物也刺激某种微球菌的生长,优选藤黄微球菌。
在更优选的实施方案中,也刺激类白喉菌的生长,优选属于棒杆菌属的细菌。
在特别优选的实施方案中,根据本发明的微生物刺激固有皮肤微生物菌群的所有微生物的生长。
根据本发明的微生物的特征也在于其不能刺激暂居病原微生物菌群的生长。
术语'暂居病原菌群'指位于皮肤上但不能繁殖的微生物,或指能在皮肤上繁殖并短期存在的污染物。
具体地,如果一种微生物应用于皮肤上,不能在健康皮肤提供的环境条件下生长和复制,并且不能永久定居于此器
官(或其区域)上,那么这种孩吏生物祐:
认为属于暂居病原菌群。
某些细菌、酵母和真菌可以暂时从人皮肤分离,但是如下微生物由于它们频繁出现,
明显被分类为暂居菌群金黄色葡萄球菌、酿脓链球菌0^/^tococc附/;'gew^)、革兰氏阴性杆菌(例如乙酸钓不动杆菌(Jd'eto6flctefcfl/omceric肌))、白色念珠菌(CVi'rf/Jafl/6/ca'力和津泉糸匕马拉色菌(Afa/fl5^'''/'r/wr)。
暂居菌群的微生物通常具有致病因子,其允许细菌附着于病症皮肤区域。
其能够附着于例如胶原结构或角蛋白结构。
暂居病原-微生物菌群的测定可以通过例如代谢足迹法、脂肪酸组分和细胞壁组分评估、16S核糖体RNA测序或编码特异致病因子的特异DNA探针的检测。
12术语'不刺激暂居病原微生物菌群的微生物生长'指本发明的微生物不能刺激至少一种、优选多于一种、优选多于两种、更优选多于5种和特别优选任何一种暂居病原微生物菌群的生长。
如果一种微生物不能在接触暂居病原微生物菌群时导致其生长加速,则此种^:
生物被认为不刺激暂居病原微生物的生长。
是否有生长刺激可以如上所述在体外或原位测试,与本发明的微生物刺激至少一种固有皮肤菌群微生物菌群生长的性质相关联。
确定刺激与否的
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