IEc介导志贺菌的头孢菌素抗生素耐药的分子机制研究可编辑.docx
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IEc介导志贺菌的头孢菌素抗生素耐药的分子机制研究可编辑
ISEcp1介导志贺菌头孢菌素抗生素耐药的分子机制研究
ISEcp1介导志贺菌头孢菌素抗生素耐药的
分子机制研究#
1,211,3
1**
5
10
15
20
25
30
35
40
(1.郑州大学公共卫生学院,郑州450001;
2.河南科技大学医学院,洛阳471003;
3.新乡医学院公共卫生系,新乡453003)
摘要:
目的研究头孢噻吩诱导前后志贺菌ISEcp1与blaCTX-M基因的位置关系及其在志贺
菌CTX-M超广谱β-内酰胺酶表达中所起的作用。
方法用头孢噻吩的次抑菌浓度对临床分
离鉴定的志贺菌进行诱导耐药试验。
对志贺菌出发株及诱导耐药株的ISEcp1、blaCTX-M进
行聚合酶链反应PCR。
采用PCR-mapping及DNA测序分析比较其诱导耐药前后ISEcp1与
blaCTX-M的位置关系差异。
将PMD19-T空载体、该志贺菌CTX-M基因全长,及前述
PCR-mapping获得的包含ISEcp1下游及CTX-M基因全长的片段即ISECTX片段)分别与T
载体连接转化到大肠杆菌感受态细胞DH5α中得到DH5αT、DH5αCTX和DH5αISECTX。
RT-PCR观察DH5αCTX和DH5αISECTX的blaCTX-M基因表达水平差异。
药敏试验观察各
克隆株的耐药性差异。
结果成功获得志贺菌诱导耐药株,该诱导耐药株对头孢噻吩高水
平耐药。
志贺菌敏感株和诱导耐药株PCR扩增均扩出ISEcp1和blaCTX-M且为CTX-M-1亚组
blaCTX-M-55,但只有诱导耐药株blaCTX-M基因上游存在ISEcp1插入序列。
测序发现此插
入序列为blaCTX-M基因提供启动子-35及-10位点及1个右反向重复序列(转位酶识别位
点)。
DH5αISECTX较DH5αCTX的CTX-M超广谱β-内酰胺酶表达水平高,且该克隆株
对头孢噻肟、头孢曲松、头孢呋辛钠、头孢吡肟的耐药性较强。
结论在外界头孢噻吩抗
生素压力下,敏感志贺菌中ISEcp1可转座到blaCTX-M基因上游并使下游blaCTX-M基因高
水平表达,导致对头孢菌素耐药。
关键词:
流行病学;志贺菌;耐药;ISEcp1;blaCTX-M
中图分类号:
R378.2
StudyonthemolecularmechanismofISEcp1involvedin
cephalosporinresistanceinShigella
WangYingfang1,4,YangHaiyan2,DuanGuangcai1,5,XiYuanlin3
1.CollegeofPublicHealth,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou,450001;
2.ColledgeofMedicine,HenanUniversityofScienceandTechnology,Luoyang,471003;
3.CollegeofPublicHealth,XinxiangMedicalUniversity,Xinxiang453003;
Abstract:
ObjectiveTocomparethelocationofISEcp1inShigellaflexneribeforeandafterinduced
byCephalothinCF,andstudytherelationshipbetweentheCTX-Mextendedspectrumbeta-lactamase
expression.MethodsClinicalshigellaflexneristrainwasinducedintoanti-drugstrainby1/2MIC
inducedtrailsofCF.ISEcp1andCTX-MwereamplifiedbypolymerasechainreactionPCRin
originalstrainandinducedanti-drugstrainPCR-mappingwasusedtodetectblaCTX-M,ISEcp1and
analyzetheirrelatioship.ThePCRproductsweresequencedandcompared.ThecompleteblaCTX-M
andtheISECTXincludeddownstreamofISEcp1andthecompleteblaCTX-Mwereinsertedina
T-vectorandtransformedintoDH-5αwhichwerenamedDH5αCTXandDH5αISECTX.The
expressinglevelsofblaCTX-MinDH5αCTXandDH5αISECTXweredetectedbyRT-PCR.
Sususceptibilitytestswereperformedinthetwoclones.ResultsInducedanti-drugstrainofshigella
flexneriwasobtainedsuccessfully.ItisresistanttocefalotinCFatahighlevel.ISEcp1and
blaCTX-M-55werefoundinoriginalstrainandinducedanti-drugstrainblaCTX-M-55wasflank
基金项目:
高等学校博士学科点专项科研基金博导类(编号:
207)
作者简介:
王颖芳1977.3-,女,讲师,博士研究生,分子流行病学
通信联系人:
段广才1958.8-,男,教授,分子流行病.E-mail:
gcduan@//0>.
-1-
45
50
55
60
upsreambyanISEcp1elementprovidearightinvertedrepeatIRRrecognizedbytransposase;-35
and-10promotersequencesmaydrivetheexpressionofblaCTX-Mgeneatahighlevel.The
expressinglevelsofblaCTX-MinDH5αISECTXwashigherthanDH5αCTX.Theantibiotic
resistancesofDH5αISECTXtoceftotaximeCTX,ceftriazoneCRO,cefurosimicsodiumCXM
andcefepimeFEPwerehigherthanDH5αCTX.ConclusionISEcp1elementcouldtranslocate
upstreamofblaCTX-MinS.flexnerifollowinginductionbycephalothin.ISEcp1maydrivethe
expressionofthebalCTX-MgengatahighlevelinShigellaspp.
Keywords:
Epidemiology;Shigellaflexneri;drugresistance;ISEcp1;blaCTX-M
0引言
由于具有广谱抗菌活性的头孢菌素大量使用,造成了产超广谱β-内酰胺酶(extended
spectrumbeta-lactamase,ESBLs)细菌在世界范围内的流行。
CTX-M型属于非TEM和SHV
型ESBLs,此类酶可水解头孢菌素,其抗菌活性可被克拉维酸所抑制[1]。
CTX-M-ESBLs按
照氨基酸相似性划分为6个亚组,即CTX-M-1、CTX-M-2、CTX-M-8、CTX-M-9、CTX-M-25
和CTX-M-45组,迄今发现140余种。
近年来通过对CTX-M-ESBLs周围的“基因环境”进
行研究,发现位于blaCTX-M-like上游的的插入序列ISEcp1可能对其表达和水平传播起重要作
用[2,3]。
目前志贺菌中ISEcp1在产CTX-M超广谱β-内酰胺酶志贺菌耐药中的作用尚不清楚。
本研究旨在探讨志贺菌中插入序列ISEcp1与CTX-M型超广谱β-内酰胺酶与的关系,及其
在产CTX-M超广谱β-内酰胺酶志贺菌耐药中的作用。
1材料与方法
65
1.1
1.1.1
材料
菌株
1.1.1.1大肠埃希菌ATCC-25922(药敏实验标准控制菌)购自河南省临床检验中心。
1.1.1.2志贺菌出发菌株mel-sf1998023/zz:
采用改良K-B纸片法筛选一株对头孢噻吩
(Cephalothin,CF)、诺氟沙星(Norfloxacin,NOR)、庆大霉素(Gentamycin,GM)、
70
磺胺甲基异恶唑(Cotrimoxazole,SMZ)均敏感的福氏志贺菌。
临床分离鉴定的野生志贺菌
出发菌株mel-sf1998023/zz来源于郑州大学第三附属医院。
1.1.2
试剂
SS琼脂、EMB琼脂、营养琼脂、水解酪蛋白(Mueller-Hinten,MH)琼脂产自上海市
医学化验所。
各种琼脂平板在本实验室按配方配制。
头孢噻吩为标准品,购自中国药品检验
75
中心。
PCR相关试剂购自北京天根生化科技有限公司。
药敏纸片购自杭州天和微生物试剂有
限公司。
感受态细胞DH5α购自郑州创生生物工程有限公司。
pMDl9-T载体购自TaKaRa公司。
DNA提取试剂盒、逆转录试剂盒购自北京天根生化科技有限公司。
TRIzol购自Invitrogen公
司。
1.1.3
引物
80
由北京赛百盛基因技术有限公司合成。
-2-
1.1.3.1插入序列ISEcp1引物
[3]
:
P1
5'-GCAGGTCTTTTTCTGCTCC-3',P2
5'-TTTCCGCAGCACCGTTTGC-3'
扩增片段长度为527bp,退火温度为58℃。
1.1.3.2
blaCTX-M引物
[4]
:
P3
5'-CTTCCAGAATAAGGAATCCCAT-3'
P4
5'-CCCATTCCGTTTCCGCTA-3'扩增完整的blaCTX-M基因,扩增片段长度为914bp,退
85
火温度为56℃。
1.1.3.3
若blaCTX-M上游存在插入序列ISEcp1则用PCR-mapping应扩增出1372bp片段,此片段
命名为ISECTX,引物为:
P5
温度为57℃。
5'-TTGGGCGAATGAAGCCGTGT-3',P4(同前),退火
1.1.3.4
CTX-M-1亚组blaCTX-M基因引物[5]:
P65'-CGCTTTGCGATGTGCAG-3',P7
90
5'-ACCGCGATATCGTTGGT-3',扩增CTX-M-1亚组blaCTX-M基因,扩增片段长度为551bp,
退火温度为52℃。
1.1.3.5
16S
rRNA基因引物
[6]
:
P8
5'-TGATCCTGGCTCAGATTGA-3',P9
5'-TTTACGGCGTGGACTACC-3',扩增片段长度为803bp,退火温度为56℃。
1.2
方法
95
1.2.1
菌株鉴定
对临床分离株进行生化、血清学及抗生素敏感性鉴定。
1.2.2
次抑菌浓度诱导耐药志贺菌试验
将志贺菌的标准株和敏感株接种到固体培养基中,用肉汤稀释法测定最低抑菌浓度
MIC。
然后将出发菌株在含1/2MIC的CF的营养肉汤液体培养基中传代,20代后转无药物
100
LB固体培养基,挑单个菌落测MIC,当药物诱导后MIC≥4倍诱导前MIC时结束诱导;并
设在不含药物的液体培养基中培养20代作对照。
经此实验将获得一株志贺菌诱导耐药株命
名为YDC。
1.2.3
志贺菌插入序列ISEcp1、blaCTX-M基因及ISECTX片段的检测
DNA提取试剂盒提取模板DNA。
PCR扩增体系为50μl:
PCRmixture25μl,引物各
105
1μl10M,模板DNA2μl,ddH2O21μl;反应条件为:
94℃预变性5min,循环参数为:
94℃60s,
退火温度如前面材料中所述45s,72℃60s共32个循环,最后72℃延伸10min。
取5μlPCR
产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳,用凝胶成像仪观察结果并照相。
1.2.4
克隆构建
1.2.4.1T载体克隆DH5αT的构建:
取pMDl9-Tvectorlμl加人DH5α感受态细胞中,冰水中
110
放置30min,42℃加热90s后,再在冰水中放置2min,加入1000μlLB培养基,37℃振荡
培养60min。
取150μl培养菌液均匀涂布在含有Amp的LB平板培养基上,37℃培养过夜。
挑选单菌落,在LB液体培养基中增菌培养。
1.2.4.2完整blaCTX-M基因克隆DH5αCTX及ISECTX片段克隆DH5αISECTX的构建:
利
-3-
用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收blaCTX-M基因或ISECTX片段的PCR产物。
按照pMDl9-T
115
120
vector试剂盒说明,在微量离心管中配置如下连接反应体系,全量为10μl:
SolutionI5μl,Insert
DNAblaCTX-M基因或ISECTX片段的PCR产物4μl,pMDl9-Tvector1μl。
置于16℃,反应
过夜。
全部加入100μlDH5α感受态细胞中,冰水中放置30min,42℃加热90s后,再在冰
水中放置2min,加入890μlLB培养基,37℃振荡培养60min。
取150μl培养菌液均匀涂布
在含有x-gal、IPTG、Amp的LB平板培养基上,37℃培养过夜,挑选白色菌落,在LB液
体培养基中增菌培养。
1.2.5
阳性克隆的检测及核酸序列分析
提取各阳性克隆的质粒,以质粒为模板PCR扩增blaCTX-M基因或ISECTX片段,并
对扩增产物进行凝胶电泳,根据凝胶电泳图谱初步判断连接转化成功与否。
然后利用T载
体的通用引物对阳性克隆进行核酸序列分析,进一步确认克隆成功与否。
最后对测序结果进
125
行比对分析。
测序委托北京三博远志生物有限公司进行。
1.2.6
DH5αCTX及DH5αISECTX克隆株blaCTX-M基因表达水平分析
利用TRIzol提取两克隆株的总RNA,按照逆转录试剂盒说明书,用引物P6、P7
扩增blaCTX-M-1和P8、P9扩增16SrRNA分别对两克隆株RNA进行RT-PCR,扩增体系为
50μl:
PrimeScript1StepEnzymeMix2μl,2×1StepBuffer25m,10mol/L引物各2μl,Template
130
135
RNA3μl,RNasefreeddH2017μl;模板RNA经逆转录酶50℃反转录30min,94℃初始变
性2min后进行PCR。
PCR反应条件:
94℃变性60s,退火温度如材料中述退火45s,72
℃延伸1min,32个循环;72℃延伸10min。
PCR完成后PCR扩增目的片段,利用凝胶成
像分析系统检测每一菌株中的保守基因16SrRNA及CTX-M-1亚组blaCTX-M基因RT-PCR
扩增产物的扫描值,每一测量重复3次取其平均值,结果以16SrRNA的扫描值为内参照,
CTX-M-1亚组blaCTX-M基因RT-PCR扩增产物的扫描值与之相比所得值为其相对含量,比
较DH5αCTX及DH5αISECTX克隆株中CTX-M-1亚组blaCTX-M基因RT-PCR扩增产物的
相对含量。
1.2.7
统计学处理
统计分析采用SPSS16.0软件包。
比较DH5αCTX及DH5αISECTX克隆株中
140
blaCTX-M相对表达量,用t检验,以双侧α0.05为显著性水准。
1.2.8
药物敏感试验
对DH5αT、DH5αCTX和DH5αISECTX克隆株进行药敏试验。
采用纸片扩散法(disc
diffusiontest)测定抑菌环,采用琼脂稀释法测定最低抑菌浓度(minimuminhibition
concentration,MIC),参照美国临床实验室标准化协会(ClinicalandLaboratoryStandards
145
Institute,CLSI)颁布的MethodsforDilutionofAntibioticSusceptibilityTests进行。
质控菌为
大肠埃希菌ATCC25922。
选用的抗生素分别是:
选择头孢唑林(Cefazolin,CZ、头孢噻吩Cefhalothin,CF、头
孢呋辛钠CefurosimicSodium,CXM、头孢西丁Cefoxitin,FOX、头孢噻肟Cefotaxime,
CTX、头孢他啶Cefazidime,CAZ、头孢曲松Ceftriazone,CRO、头孢吡肟Cefepime,FEP。
-4-
150
1.2.8.1纸片扩散法测定抑菌环方法步骤:
1.2.8.1.1接种菌液的制备:
用接种环挑取LB平板上单个菌落,接种于LB液体培养基
37
℃振荡增菌过夜,取少量菌液用LB液体培养基稀释100倍继续37℃振荡培养1小时,
用LB液体培养基逐步稀释,使得紫外分光光度计测定OD600值约为0.08~0.12之间,此时
菌液浊度近似于0.5麦氏比浊管,约含1~2×108CFU/ml。
将此菌液再稀释于10倍的LB液
155
160
165
170
175
180
185
体培养基中,15min内接种平板。
1.2.8.1.2接种平板:
用灭菌棉签沾取菌液,涂布整个MH培养基表面,反复几次,以保证
涂抹均匀,平放数分钟待其干燥。
1.2.8.1.3贴纸片:
用无菌镊子分别夹取不同的抗生素纸片,贴在已接种细菌的平板表面。
每个10mm平板上贴5片不同的抗生素纸片,各纸片中心相距约24mm,纸片距平皿边缘约
15mm,各纸片间距离相等。
质控菌株ATCC25922以同样方法操作以作为对照。
1.2.8.1.4孵育:
37℃培养18小时后读取结果。
1.2.8.1.5结果判定:
用卡尺测量抑菌环直径(包括纸片计算在内),抑菌环的边缘以肉眼见
不到细菌明显生长为限。
按抑菌环直径判断细菌敏感、中度敏感或耐药。
判定标准根据CLSI
2012年出版的《抗微生物药物敏感性试验执行标准》第二十二版信息增刊M100-S22判读。
1.2.8.2琼脂稀释法测定抗菌药物最低抑菌浓度,具体步骤如下:
1.2.8.2.1抗菌药物的配制和梯度浓度的制备:
首先精确称量所需抗生素,用合适的溶剂
溶解,配制成含量为5120mg/L的贮存液。
然后用无菌去离子水再将贮存液稀释成以下梯度
浓度的工作液:
2560mg/L、1280mg/L、640mg/L、320mg/L、160mg/L、80mg/L、40
mg/L、20mg/L、10mg/L、5mg/L、2.5mg/L。
工作液保存在4℃冰箱1天之内尽快使用如
有需要额外配制更高或更低浓度的工作液)。
1.2.8.2.2MH平板制备:
将高压灭菌过的MH培养基冷却至60℃左右,取9mLMH培养
基,加入1mL特定浓度的抗生素工作液,充分混匀后,倾倒平板。
制成的系列梯度浓度的
MH平板可保存在4℃冰箱,3天之内使用。
1.2.8.2.3接种菌液的制备:
用接种环挑取LB平板上单个菌落,接种于LB液体培养基37℃
振荡增菌过夜,取少量菌液用LB液体培养基稀释100倍继续37℃振荡培养1小时,用LB
液体培养基逐步稀释,紫外分光光度计测定OD600值约为0.08~0.12,此时菌液浊度近似于
0.5麦氏比浊管,约含1~2×108CFU/ml。
将此菌液再稀释于10倍的LB液体培养基中。
1.2.8.2.4接种:
将制备好的接种菌液,15min内,用移液枪吸取1μL的菌液接种在事先
制备好的含特定抗生素浓度的MH平板。
每个板上划了9格内,每格接种1株志贺菌的接
种液,每板接种8株菌,第9格接种药敏实验标准控制菌大肠埃希菌ATCC25922。
1.2.8.2.5孵育:
将接种好的平板放于37℃恒温箱,培养18h~20h后读取结果。
1.2.8.2.6结果判定:
根据临床实验室标准化协会(ClinicalandLaboratoryStandards
Institute,CLSI)2012年出版的《抗微生物药物敏感性试验执行标准》第二十二版信息增刊
M100-S22判读。
以完全抑制细菌生长的最低药物浓度为被检抗生素的MIC。
薄层极微弱生
长或只生长1~2个菌落可忽略。
空白对照培养基上应出现接近融合生长。
标准质控菌的MIC
应在允许范围内,否则该次实验结果不可取。
-5-
1.2.9
ESBLs表型确证实验
采用K-B法用、头孢噻肟/克拉维酸钾Cefotaxime/clavulanicacid,CTX/CA和头孢他啶/
克拉维酸钾Cefazidime/clavulanicacid,CAZ/CA、CAZ、CTX药敏纸片对DH5αblaCTX-M
190
及DH5αISECTX进行ESBLs表型确证。
结果判读按CLSI文件M100-S22推荐的标准,
实验标准控制菌为大肠埃希菌ATCC25922。
2结果
2.1
菌株鉴定
临床分离志贺菌为福氏志贺菌,对头孢噻吩、诺氟沙星、庆大霉素、磺胺甲基异恶
195
唑四种抗生素均敏感命名为mel-sf1998023/zz,为头孢噻吩诱导的出发菌。
2.2
次抑菌浓度1/2MIC诱导耐药结果
次抑菌浓度1/2MIC的抗菌药物能诱导细菌产生耐药早已有报道[6]。
志贺菌出发菌株初
始菌的MIC为CF16μg/ml,将此初始菌在浓度为1
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