银新杨中与DRE元件结合的转录因子的克隆.docx
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银新杨中与DRE元件结合的转录因子的克隆
分类号:
单位代码:
10749
密级:
学号:
0203118
宁 夏 大 学
学位论文
银新杨中与DRE元件结合的转录因子的克隆及其转化新疆杨的研究
IsolationofDRE-BindingTranscriptionFactorfromYinxinPoplar(P.alba×P.albavar.pyramidalis)anditsTransformationto
P.albavar.pyramidalis
研究生:
秦红霞
指导教师:
宋玉霞研究员
申请学位类别:
理学硕士
专业领域名称:
生物化学与分子生物学
研究方向:
植物基因工程
所在学院:
生命科学学院
二零零六年三月
独创性声明
本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。
尽我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得宁夏大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。
与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。
研究生签名:
时间:
年月日
关于论文使用授权的说明
本人完全了解宁夏大学有关保留、使用学位论文的规定,即:
学校有权保留送交论文的复印件和磁盘,允许论文被查阅和借阅,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。
同意宁夏大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。
(保密的学位论文在解密后应遵守此协议)
研究生签名:
时间:
年月日
导师签名:
时间:
年月日
摘要
DREB(Dehydration-ResponsiveElementBinding)转录因子是一类植物特有的,在植物感受非生物逆境(干旱、高盐和低温)胁迫时,通过与DRE(Dehydration-ResponsiveElement)/CRT(C-repeat)元件相互作用诱导一系列干旱、高盐和低温胁迫应答基因表达的调控因子,在保护植物免受非生物逆境胁迫的伤害中起重要作用。
本研究选用银新杨(P.alba×P.albavar.pyramidalis)为材料,通过PCR和同源EST搜索的方法克隆得到一个类DREB的基因,命名为PaDREB2。
酵母单杂交实验表明,该基因编码的蛋白能特异地与DRE元件结合并激活下游报告基因的表达。
用RT-PCR的方法研究了PaDREB2的表达模式,结果表明PaDREB2受低温、干旱和高盐的胁迫诱导。
因此推测PaDREB2是DREB类转录因子大家组的一个成员。
新疆杨(P.albavar.pyramidalis)是银白杨的变种,具有较耐寒、耐盐碱、抗干旱、抗风和抗烟尘等特性,是西部地区造林绿化的理想树种。
选用常规的组织培养技术获得新疆杨无菌苗,并建立了高效的再生体系和遗传转化体系。
选用逆境诱导型启动子rd29A启动PaDREB2基因,构建到植物表达载体上,并用农杆菌介导的叶盘转化法转化新疆杨。
通过抗生素筛选和PCR检测的方法得到了25个转基因阳性株系。
关键词:
DREB转录因子,PaDREB2,新疆杨,银新杨
Abstract
Dehydration-ResponsiveElementBinding(DREB)transcriptionfactors,specificallybindingwithdehydrationreponsiveelement(DRE),activateavarietyofstress-responsivegenesinplantsunderabioticstresses(dehydration,highsaltandlowtemperature).Soitplaysanimportantroleinprotectingplantsfromabioticstresses,suchasdehydration,highsaltandlowtemperature.UsingPCRandhomologousESTsearch,weisolatedaDREB-likegenefromYinxinpoplar(P.alba×P.albavar.pyramidalis)namedPaDREB2.YeastOne-hybridexperimentdemonstratedthatPaDREB2proteincouldfunctionasaDREBtranscriptionfactoractivatingtargetgeneexpressionbyspecificallybindingtoDREcis-element.TostudytheexpressionpatternofPaDREB2,RT-PCRwascarriedout.AndtheresultsshowedthatPaDREB2isinducedbylowtemperature,dehydrationandhighsalt.SoPaDREB2isamemberoftheDREB-liketranscriptionfactorsfamily.
P.albavar.pyramidalisisamutationofP.alba.Tosomeextent,P.albavar.pyramidalisisabletobearcold,salt,alkali,dehydration,windandsoot,andisperfecttreeforforestationandvirescenceinwesternarea.WehavegotgermfreeseedlingsandestablishedhighfrequencyregenerationsystemandtransformationsystemofleafexplantofP.albavar.pyramidalis.Weselectedadversity-inducedpromotor(rd29A)andjoinitwithPaDREB2geneinplantsexpressionvector(pCAMBIAI1301).WeintroducedthisvectorintoP.albavar.pyramidalismediatedbyAgrobacteriumtumefaciens.Finally,usingantibioticsfiltrationandPCR,wegot25transgeniclines.
KeywordsDREBtranscriptionfactor,PaDREB2,P.albavar.pyramidalis,Yinxinpoplar
目录
英文缩略词表I
第一章绪论1
1.1研究的目的与意义1
1.2杨树基因工程育种研究进展2
1.3植物DREB转录因子的研究进展及应用7
1.4研究内容和方法12
第二章银新杨与DRE元件结合的转录因子的克隆及鉴定分析13
2.1实验材料13
2.2常用培养基和溶液的配制14
2.3实验方法15
2.4结果与分析21
2.5讨论25
第三章PaDREB2基因植物表达载体的构建及转化农杆菌26
3.1实验材料26
3.2常用培养基和溶液的配制26
3.3实验方法27
3.4结果与分析29
3.5讨论31
第四章新疆杨高效再生及遗传转化体系的建立32
4.1实验材料32
4.2常用培养基和溶液的配制32
4.3实验方法32
4.4结果与分析33
4.5讨论37
第五章新疆杨农杆菌转化体系的优化和阳性植株的获得39
5.1实验材料39
5.2常用培养基和溶液的配制39
5.3实验方法40
5.4结果与分析41
5.5讨论44
第六章结论46
参考文献48
致谢56
附录57
作者简介58
英文缩略词表
英文缩写英文全称中文名称
AmpAmpicilin氨苄青霉素
bpbasepair碱基对
CefCefotaximesodium头孢霉素(头孢噻肟钠)
dday天
DREBDehydration-ResponsiveElementBinding与脱水应答元件结合
DREDehydration-ResponsiveElement脱水应答元件
DNADeoxyribonucleicacid脱氧核糖核酸
dNTPsdeoxynucleosidetriphosphate脱氧核苷三磷酸
DEPCDiethylPyrocarbonate焦碳酸二乙酯
GenGentamicin庆大霉素
hhour小时
HymBHygromycinB潮霉素B
IAAIndole-3-Aceticacid吲哚-3-乙酸
IBAIndole-3-Butyricacid吲哚-3-丁酸
IPTGIsopropylthio-β-D-galactoside异丙基硫代-β-D-半乳糖苷
kbkilobasepairs千碱基对
KanKanamycin卡那霉素
Lliter升
minminute分钟
mlmilliter毫升
NAA1-Naphthylaceticacid萘乙酸
ORFOpenReadingFrame开放读框
PCRPolymeraseChainReaction聚合酶链式反应
RifRifampicin利福平
r/mratorperminute转/分
SDsyntheticdropout缺陷的
SDSSodiumDodecylSulfate十二烷基磺酸钠
Secsecond秒
TDZThidiazuron赛苯隆
UUnit单位
µlmicroliter微升
µmol/Lmicromole/liter微摩尔/升
6-BA6-BenzylAminopurine6-苄基腺嘌呤
第一章绪论
在植物的生长过程中逆境胁迫是不可避免的,如干旱、高盐和低温等。
当植物受上述逆境胁迫时,通过逆境胁迫信号的传导在植物体内可以诱导一系列应答基因的表达[1-4]。
由于对植物细胞如何感应干旱、高盐及低温引起的水分胁迫,如何将这些胁迫信号传递到细胞核的转录因子以及下游的各种功能基因的表达调控等一系列的分子机理知道得甚少,因而这些方面成为了近年来植物分子生物学研究领域的一个前沿内容。
1998年刘强等[5]用酵母单杂交的方法从拟南芥(ArabidopsisthalianaL.)中分离得到了5个与DRE元件结合的转录因子,分别命名为DREB1A、DREB1B、DREB1C和DREB2A、DREB2B。
这5个转录因子分属于DREB1和DREB2两个亚类,分别受低温和干旱的快速强烈诱导。
从蛋白质结构分析上看这5个转录因子都具备反式作用因子的典型特征。
并且研究发现DRE元件(TACCGACAT)或其核心序列(CCGAC)广泛地存在于干旱、高盐和低温胁迫应答基因的启动子区[6,7]。
因此期望通过对DREB转录因子的研究能够阐明一条新的逆境胁迫信号传递途径,并能够在改良植物抗逆性的研究中发挥作用。
目前除拟南芥外,还从水稻(OryzaSativeL.)[8]、油菜(BrassicanapnsL.)[9]、玉米(ZeamaysL.)[10]等多种植物中分离得到了DREB类转录因子。
同时屡见报道将DREB基因用于植物的抗逆基因工程育种研究中,并获得了抗逆性状得到改善的转基因植株。
例如用35S:
DREB1A转化拟南芥,与野生型植株相比,转基因植株中rd29A和cors基因的表达,无论是在胁迫条件下,还是非胁迫条件下均明显升高,并且脯氨酸和可溶性糖(包括蔗糖、棉子糖、葡萄糖和果糖)的含量也升高,从而提高了植物对于低温和盐胁迫的耐性[11]。
但是由于35S是组成型的强启动子,在不同的发育阶段都诱导外源基因在整株植物中表达,产生大量异源蛋白质或代谢产物在植物体内积累,打破了植物原有的代谢平衡,因而阻碍了植物的正常生长。
如2002年Hsieh等报道了转AtDREB1B基因的番茄植株出现了矮化和种子数量减少等问题。
进一步研究发现,用逆境诱导型启动子(如rd29A启动子)代替组成型的35S启动子启动DREB基因在转基因植物中的表达,不仅可以提高植物的逆境耐受性,同时减少了35S启动子启动下DREB基因在非逆境胁迫下的过表达给转基因植物的生长带来的不利影响[12]。
1.1研究的目的与意义
杨树是世界上许多国家广泛栽培的重要造林和用材树种,具有广泛的工业用途,是制浆造纸、胶合板、包装材料等的重要原料。
杨树无性繁殖容易,生长速度快,生长周期短,发展杨树种植业已经成为解决木材短缺的重要途径之一。
但水资源缺乏、土地盐渍化给杨树的种植带来很大的挑战,所以急需培育一批抗逆品质优良的树种。
与常规的育种方法相比,基因工程育种具有时间短、目的性强等特点,因此研究与杨树抗逆性相关的基因,并开展杨树抗性基因工程育种是杨树育种的一个重要方面。
新疆杨(P.albavar.pyramidalis)[13]是银白杨的变种,在相同的非盐化灌淤沙壤土条件下,其生长优于银白杨[14]。
在中国现有林木中目前仅见雄株未发现雌株,一直采用无性繁殖[15]。
新疆杨具有较耐寒、耐盐碱、抗干旱、抗风和抗烟尘等特性,是西部地区造林绿化的理想树种。
其塔形树冠不仅美观,而且遮荫小,因此又是农田林网和四旁绿化的优良树种之一。
近年来,新疆杨在北方各地如陕西、甘肃、宁夏、青海、辽宁等省(区)大量引种栽植,且生长良好,有的省(区)将其列为重点推广的优良树种来发展。
因此加强新疆杨现有优良品质,如抗虫、抗病、抗寒、抗旱、抗盐碱等,并进行利用是十分重要的。
杨树中有关DREB类转录因子的研究还鲜有报道,本研究拟从银新杨中分离得到DREB类转录因子,并将其用于新疆杨的遗传转化,进一步的改良和加强新疆杨的抗逆品质,同时为杨树乃至整个林业抗逆性基因工程育种提供了一条全新的技术途径。
1.2杨树基因工程育种研究进展
植物基因工程育种是指采用分子生物学和基因工程技术将一段DNA序列即外源目的基因有目的、有计划地插入、整合到受体植物的染色体上,使其在受体细胞中表达并稳定遗传,从而使受体植株获得符合育种目标的优良基因。
与传统的杂交育种相比转基因育种具有目的性强、缩短育种周期、可以打破种间杂交不亲和界限等特点,因此已成为高新技术育种中的核心技术。
杨树是世界上中纬度地区广泛栽培的重要用材树种,具有广泛的工业用途和社会价值。
目前对杨树各方面的研究已比较深入,杨树组织培养技术的研究也比较成熟,其中许多树种已建立了离体繁殖再生系统。
杨树还是根癌农杆菌的天然宿主,有利用根癌农杆菌介导法进行遗传转化的优势。
因此,基因工程技术在杨树的遗传改良育种中已得到了广泛的应用,并屡见成功实例的报道。
1.2.1农杆菌介导的遗传转化机理
农杆菌属(Agrobacterium)细菌有一套天然的基因转化系统,是天然的遗传工程师,在改良植物的遗传性状方面发挥着重要作用。
用于遗传转化的农杆菌有根癌农杆菌(Agrobacteriumefaciens)和发根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)两种:
根癌农杆菌携带的质粒可诱发植物产生冠瘿瘤(Crowngall),因而称之为Ti质粒(Tumorinducingplasmid);发根农杆菌携带的质粒可侵染植物产生毛状根瘤(Hairyrootstumors),故称之为Ri质粒(Rootinducingplasmid)[16]。
Ti质粒上含有可转移DNA(T-DNA)区、毒性区(Vir区)、结合转移区(Con区)和复制起始区(Ori区)4部分。
其中与冠瘿瘤生成有关的是Vir区和T-DNA。
T-DNA区在农杆菌侵染植物时可以插入植物基因组中,使其携带的基因在植物中表达。
T-DNA两端是25bp的重复序列,是转移识别的唯一信号,分为左边界和右边界,两个边界序列之间是生长素和细胞分裂素合成基因以及冠瘿碱合成基因。
Vir区用于编码T-DNA加工、转移及整合的功能蛋白,该毒性区含有多个位点,如VirA,VirB,VirC,VirD,VirE,VirF,VirG,VirH等,每个位点包括1~11个开放阅读框。
当植物受到伤害时,分泌含有酚类化合物的汁液,这些酚类化合物促使农杆菌向植物受伤部位移动并附着于植物细胞表面,随后VirA的蛋白感受植物受伤细胞产生的信号(酚类化合物,糖类等),自身发生磷酸化。
磷酸化的VirA蛋白将磷酸基转移到VirG蛋白保守的天冬氨酸残基上,使VirG蛋白活化,从而激活其它Vir基因的转录,其中VirD基因编码的产物对T-DNA进行剪切,产生T-DNA单链,T-DNA单链与VirD2及VirE2结合成T链复合物,T链复合物被转移到农杆菌外,通过植物细胞壁上由VirB蛋白组成的通道进入植物细胞内,VirD2和VirE2上的核定位信号被转运蛋白识别,经过主动运输过程通过核孔进入细胞核内。
在VirD2的帮助下,T-DNA以单或多拷贝的形式随机整合到植物染色体上,完成T-DNA由农杆菌向植物的转移及整合过程[17]。
研究表明T-DNA优先整合到转录活跃区,另外在T-DNA的同源区与DNA的高度重复区,T-DNA的整合效率也比较高[18]。
由于T-DNA区内的基因表达调控序列与真核生物类似,因而可以不在农杆菌中表达,而在植物中表达;且T-DNA转移只与两个边界序列有关,边界序列之间的基因并不影响T-DNA的转移与整合,所以可以用目的基因代替T-DNA区内的基因,获得希望的转基因植株。
Vir区和T-DNA是反式作用的,Vir区基因表达的蛋白通过扩散过程到达T-DNA区并与之发生相互作用。
因此,可以将Vir区与T-DNA区置于两个质粒上而不影响两者的相互作用。
根据这一原理,人们建立了双元载体系统。
该系统含有两个质粒:
一个置于农杆菌中,含有Vir区;另外一个含有T-DNA区,这个质粒可以做的比较小(10bp),因而能够利用大肠杆菌方便地进行体外操作。
第二个质粒可以通过液氮冻融法高效地转入农杆菌中。
利用双元载体系统可以实现载体和任意农杆菌菌株的搭配,有利于实验者找到高效率的转化组合。
正是由于以上优点,双元载体得到了迅速发展[19]。
发根农杆菌的转化机理与根癌农杆菌类似,只是其中含有的质粒为Ri质粒,T-DNA区含有与发根生成有关的植物激素的合成基因。
1.2.2抗除草剂研究
除草剂的应用在发达国家已相当普及,85%~100%的栽培作物上都使用除草剂。
利用转基因技术向植物转入抗除草剂基因,可使其获得或增强对除草剂的抗性,从而提高除草剂在使用过程中对杂草的识别和消除功能。
1987年Fillatti等[20]首先将除草剂草甘膦的抗性基因通过农杆菌介导法导入银白杨×大齿杨(P.canescens(Ait)Smith×P.grandidentataMichx)无性系N0339中,转基因植株表现出较高的耐草甘膦能力。
随后又成功地将抗除草剂基因转入美洲黑杨,这是杨树抗性基因工程研究的开端。
随后,1990年DeBlockM.[21]等将bar基因导入银白杨×欧洲黑杨(P.alba×P.nigra),得到了对草丁膦具有明显抗性的转基因植株;1992年Brasileriro等[22]用来自拟南芥的乙酰乳酸合成酶基因crs-1转化欧洲山杨×银白杨(P.tremula×P.alba),获得的转化植株能抵抗高剂量的绿黄隆;1994年Chupeau等[23]以欧洲山杨×银白杨叶片原生质体为受体,采用电击法分别转化了乙酰乳酸合成酶(Als)突变基因和乙酰转移酶(Pat)基因,分别获得了抗磺胺脲类除草剂和抗草苷膦类除草剂的转基因植株;2001年Gullner等[24]将编码抗除草剂乙酰替绿苯胺(chloroacetanilide)的谷酰丙氨酶(GST)基因转入杨树杂交种内,转基因植株叶片富含γ-GST和谷胱氨酶(GSH),其对除草剂抗性得到了提高。
1.2.3抗虫害
虫害严重影响树木的生长质量和生存状况,甚至导致物种的消失和造林的失败。
大面积的人工纯林更加剧了虫害的蔓延,造成大面积、毁灭性的森林灾害。
因此,培育抗虫林木新品种是人工林建设的重要前提。
Bt基因和蛋白酶抑制剂基因是目前植物抗虫基因工程中广泛使用的两种抗虫基因。
Bt基因能产生具有强烈杀虫作用的杀虫晶体蛋白,1993年田颖川等[25]用农杆菌介导法将Bt基因转入欧洲黑杨(P.nigra),转基因植株经抗虫实验证实,杨尺蠖(Apocheimacinerarius)和舞毒蛾(Lymantria)的死亡率可达80%和100%,并且存活幼虫的生长发育也受到明显的抑制。
2004年郭同斌等[26]研究了转Bt基因杨树(NL280106)在室内控制和自然条件下对杨小舟蛾(Micromelalophatroglodyta)幼虫的抗性,结果发现转基因杨树对大部分杨小舟蛾幼虫的生长具有明显抑制作用,使其取食量、体重增长速率显著低于对照,甚至导致幼虫死亡。
由于害虫容易对含单个抗虫基因的转基因植物产生抗性,因而培育含多价抗虫基因的转基因植物已成为目前倍受关注的问题。
与Bt毒蛋白相比,蛋白酶抑制剂具有抗虫广谱、对人畜无副作用以及害虫不易产生耐受性等特点。
2000年李明亮等[27]利用农杆菌介导法将Bt基因和蛋白酶抑制剂基因共同转入欧洲黑杨中,结果表明转基因欧洲黑杨具有了明显的杀虫活性,且抗虫能力明显高于含单一Bt基因的植物。
2000年田颖川[28]等用部分改造的BtCrylAc基因与慈姑蛋白酶抑制剂(API)基因构建了双抗虫表达载体,通过农杆菌介导法转化了杂种741毛白杨[P.albaL.×(P.davidianaDode+P.simoniiCarr.)×P.tomentosaCarr.],获得了一批转化植株。
并用杨扇舟蛾[Closteraanachreta(Fabricius)]进行虫试,结果表明试虫的死亡率达90%以上,而且存活幼虫的生长发育受到了明显的抑制。
随后2004年姜静等利用农杆菌介导法将蜘蛛杀虫肽和Bt基因C肽序列的融合基因导入小黑杨(P.simonii×P.nigra),经Southern杂交检测得到2株阳性植株。
抗虫实验结果显示转基因植株具有明显的抗虫效果,能显著抑制舞毒蛾幼虫的生长发育,表现出强烈的抗虫作用[29]。
2005年张冰玉等用农杆菌介导法,将两种杀虫机理不同的基因BtCry3和OC-I导入银腺杂种杨(P.alba×P.glandulosaDodecv.‘84K’)基因组中,其中BtCry3A基因对鞘翅目具有高度专一的抗性;水稻巯基蛋白酶抑制剂(OC-I)对鞘翅目昆虫有较强的抗虫性。
经检测得到了对光肩星天牛幼虫的毒杀和生长抑制作用显著的阳性植株[30]。
1.2.4抗病害
杨树的抗病研究主要集中在由于病原菌的侵害引起的杨树溃
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