论著氩等离子凝固术和冷冻消融术对犬气管急性损伤的实验研究.docx
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论著氩等离子凝固术和冷冻消融术对犬气管急性损伤的实验研究
氩等离子凝固术和冷冻消融术对犬气管急性损伤的实验研究
张莹莹张杰王娟徐敏裴迎华王玉玲王婷张晨阳
【摘要】目的比较氩等离子凝固术在不同功率(30w、60w)下对正常气管的急性损伤深度及冷冻消融术在不同作用时间(30s、60s)下对正常气管的急性损伤程度和深度,探讨上述四种不同的处理方式对正常气管作用的效果和安全性。
方法对8条杂种犬的气管行氩等离子凝固和冷冻消融处理,分为冷冻30s组、冷冻60s组、30w氩等离子凝固组、60w氩等离子凝固组、正常气管组,每组8例标本。
48h后行肉眼观、组织病理观察和电镜下观察,统计每种处理方式的损伤深度。
结果1、冷冻30s组和冷冻60s组损伤深度均达气道软骨浅层;2、电镜下冷冻30s组见软骨细胞变性,冷冻60s组见多数软骨细胞变性,偶见软骨细胞坏死。
3、30w氩等离子凝固术组和60w氩等离子凝固术组损伤深度均达软骨层,两组软骨层细胞多数坏死;4、60w氩等离子凝固术组气管软骨层细胞和基质比30w氩等离子凝固术组坏死程度严重。
结论1、本研究结果提示在气道腔内介入治疗中接近气管壁时,应用氩等离子凝固术可造成气道壁的严重损伤,功率越高,这种危险性越大,甚至可达气管壁全层从而造成气道壁塌陷。
2.冷冻治疗亦不是绝对安全,当接近气管壁时,随着冷冻时间的延长亦可造成气道壁软骨的损伤,本研究提示冷冻30s虽然在光镜下未见明显的软骨细胞损伤,但在电镜下即可在部分动物见到软骨细胞变性,提示在气道腔内介入治疗中接近气管壁时冷冻治疗最好控制在30S以内。
【关键词】氩等离子凝固术,冷冻消融术,犬气管,急性损伤
基金项目:
首都临床特色应用研究(Z121107*********)
作者单位:
100050北京,首都医科大学附属北京天坛医院呼吸科
通信作者:
张杰,Email:
zhangjie6218@
AProspectiveExperimentalStudytoObservetheAcuteInjuryAppliedbyArgonPlasmaCoagulationandCryoablationinDogAirway
ZHANGYing-ying,ZHANGJie,WANGJuan,XUmin,PEIYing-hua,WANGYu-ling,WANGTing,ZHANGChen-yang,DepartmentofPulmonaryMedicine,BeijingTianTanHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing100050,China
Correspondingauthor:
ZHANGJie,Email:
zhangjie6218@
【Abstract】ObjectiveTocomparethedepthanddegreeoftheacuteinjuryinnormaltracheacausedbywaysofargonplasmacoagulation(APC)indifferentpowers(60w、30w)andcryoablationindifferentduration(30s、60s),furthermore,todetecttheeffectandsafetyoffourmethodsaboveappliedinnormaltrachea.MethodsEightnormalbronchusofcanineareinjuredbymeansofargonplasmacoagulationandcryoablation.Accordingtothecausesofinjury,samplesareclassifiedtogroupsoffreezingfor30seconds,groupsoffreezingfor60seconds,groupsofAPCusingpowersof30w,groupsofAPCusingpowersof60w,groupsofnormalbronchus,andeachgroupcontainseightsamples.48hourslater,samplesareobservedbynakedeyes,histopathologyandultrapathologyrespectly,andmakestatisticanalysisofdepthininjuriescausedbyeverymethod.Results1.Samplesingroupsoffreezingfor30secondsand60secondsareinjuriedtoinnerpartofthecartilage;2.Ultrapathologicalfindingsinsamplesoffreezingfor30secondsaredegenerationofcartilagecells.Ultrapathologicalfindingsinsamplesoffreezingfor60secondsaredegenerationofmajorpartsofcartilagecells,andnecrosisofminorpartsofcartilagecells;3.SamplesingroupofAPCusingpowersof30wandgroupofAPCusingpowersof60warealsoinjuriedtothecartilage,majorcartilagecellsarenecroticinsamplesofbothgroups;4.thedegreeofnecrosisinlayerofcartilageingroupofAPC60wismoreseverethanthatingroupofAPC30w.Conclusion1.Itisdangeroustotreatbasesofmassesinairwaywithlowpower(30w)andhighpower(60w)inAPCandcryoablationoffreezingfor60sinclinicaloperation;2.Itissafetotreatareasofmassbaseswithcryoablationoffreezingfor30secondsintheperiodofacuteinjury.Itneedsfurtherevidencetodeterminewhetheritissafeinthewholeperiod;3.Theseverityofinjuryinairwaystructureappliedbycryoablationisrelatedtothedurationofcryoablation,themoresevereofinjuryinairwaystructure,thelongerofcryosurgerytime;4.TheseverityofinjuryinairwaystructureappliedbyAPCisrelatedtotheenergyappliedintheoperationofAPC,themoresevereofinjuryinairwaystructure,thehigherenergyweused.
【Keywords】argonplasmacoagulation,cryoablation,airway,acuteinjury
氩等离子凝固术(argonplasmacoagulation,APC)和冷冻消融术是在支气管镜下进行气道腔内肿物消融的常用技术。
APC是通过电离的氩气将高频电流输送到靶组织,电能转化为热能使靶组织在高温下被烧灼干燥;冷冻消融术是利用固体CO2转化为气体时吸收热量降低周围环境温度来损伤靶组织,二者均可达到消融病变组织的目的。
这两种技术在临床操作中对组织损伤的深度通常凭借操作医师的经验来判断,在对组织的消融过程中,尤其在处理肿物根部区域时操作不当很容易引起气道的不可逆损伤。
本研究拟通过观察APC和冷冻消融技术对犬气道急性损伤的深度和程度来探讨合适的气道腔内疾病的消融方法。
材料与方法
1材料
1.1实验对象
体重13-15kg实验用杂种犬,由北京天坛医院动物房提供,有检疫合格证,雌雄不限。
1.2主要实验设备
库蓝K300冷冻机北京库蓝医疗设备公司
冷冻探针(直径2.4mm)北京库蓝医疗设备公司
ERBE-300APC机德国ERBE电子医疗仪器公司
ERBEICC高频电凝设备德国ERBE电子医疗仪器公司
氩气喷管(直径2.3mm)德国ERBE电子医疗仪器公司
OlympusLF-TP纤维插管镜(内径2.6mm)日本OLYMPUS公司
OlympusBX50光学显微镜日本OLYMPUS公司
PhilipsEM2085透射电子显微镜日本Philips公司
1.3主要实验试剂
陆眠宁II(1.5ml/支)吉林省华牧动物保健品有限公司
3%戊巴比妥钠武汉金诺化工有限公司
甲醛北京天坛医院病理科提供
伊红北京天坛医院病理科提供
苏木素北京天坛医院病理科提供
酒精北京天坛医院呼吸科提供
石蜡北京天坛医院呼吸科提供
PBS缓冲液北京天坛医院电镜室提供
2.5%戊二醛北京天坛医院电镜室提供
1%锇酸北京天坛医院电镜室提供
2方法
本研究动物实验人员具有动物实验资格证,动物饲养室清洁,单笼饲养,饲料由北京天坛医院动物房统一提供。
2.1术前准备术前禁食6-8小时,术前1小时麻醉,全麻,麻醉方法为速眠新肌内注射,剂量为1ml/kg体重,20分钟后3%戊巴比妥钠腹腔内注射,剂量为0.3ml/kg体重。
2.2实验方法
2.2.1实验分组按处理方式不同分为冷冻30s组、冷冻60s组、APC30w组、APC60w组及未做任何处理的正常气管组,每组有8例标本。
2.2.2预实验用于评估在同一条犬的气道中行两种及两种以上气道处理是否可行。
杂种犬称重,全麻,隆突上5cm行60wAPC1秒、15cm行冷冻60s处理气道半周,48h后处理犬精神状态良好,未见并发症,处死,分别在距离两处损伤处气管2cm处取气管标本,送检组织病理,以评估各处理方式波及范围情况。
2.2.3实验步骤杂种犬称重,全麻,隆突上5cm、10cm、15cm、20cm处分别随机行冷冻30s、冷冻60s、30wAPC每点1s、60wAPC每点1s处理,每次处理均损伤气管半周。
每种处理方式采集8例标本。
2.2.3.1冷冻30s操作过程冷冻探针与冷冻机的探针接头连接完好,在气管插管镜的协助下,探针末端进入气管,探针末端与与气管粘膜表面呈切线方向接触,踩踏踏板开关,同时秒表计时,30s时松开踏板,自然状态下复温,在相距约5mm处再次冷冻30s,如此反复,共冷冻气道半周。
2.2.3.2冷冻60s操作过程冷冻探针与冷冻机的探针接头连接完好,在气管插管镜的协助下,探针末端进入气管,探针末端与与气管粘膜表面呈切线方向接触,踩踏踏板开关,同时秒表计时,60s时松开踏板,自然状态下复温,在相距约5mm处再次冷冻60s,如此反复,共冷冻气道半周。
2.2.3.3APC30w操作过程APC机线路连接及电极板连接完毕,氩气喷管与APC机接头连接完好,在气管插管镜的协助下,氩气喷管末端进入气管,到达预定部位,APC机功率调整为30w,在距离气管粘膜2cm处喷射1s后停止,在距离此处约5mm处再次行APC1s,如此反复,处理气道半周。
2.2.3.4APC60w操作过程APC机线路连接及电极板连接完毕,氩气喷管与APC机接头连接完好,在气管插管镜的协助下,氩气喷管末端进入气管,到达预定部位,APC机功率调整为60w,在距离气管粘膜2cm处喷射1s后停止,在距离此处约5mm处再次行APC1s,如此反复,处理气道半周。
2.2.4术后观察48h后处死杂种犬,取气管全段,肉眼观损伤处,再分别取损伤部位气管全层送检组织病理,其中每种处理方式各3例兼送检电镜观察,并在隆突部位取正常气管送检组织病理。
2.3统计分析
将每种处理方式组的8个标本按损伤深度达粘膜层、粘膜下层、软骨层、外膜层分别标记,统计每组的标本达各层深度的数量,行多组有序秩和检验,P<0.05为差异有统计学意义。
3结果
3.1在预实验中,距离60wAPC和60s冷冻处理部位2cm处气管与正常气管相比无差别,组织病理标本如下:
正常气管
距离60wAPC处理部位2cm处气管
距离60s冷冻处理部位2cm处气管
气管全层或内侧三层
(×40)
(×40)
(×40)
粘膜及粘膜下层
(×100)
(×100)
(×100)
3.2处理48h后各组标本肉眼观
肉眼观
正常气管
冷冻30s
冷冻60s
APC30w
APC60w
3.3处理48h后各组标本组织病理学的HE涂片描述如下:
冷冻30s组
冷冻60s组
30wAPC组
60wAPC组
粘膜层
8例标本均出现粘膜上皮不完全剥脱
8例标本均出现粘膜上皮不完全剥脱,剥脱范围较冷冻30s组大
8例标本均出现粘膜上皮不完全剥脱,残留粘膜仅剩单层上皮细胞
3例标本见粘膜上皮完全剥脱,5例见残留少量单层粘膜上皮
粘膜下层
8例标本均出现炎细胞浸润;8例均出现血管扩张,2例见红细胞溢出
8例标本均出现炎细胞浸润,数量均较冷冻30s多;8例均出现血管扩张,2例见红细胞溢出,1例红细胞溢出数量多
8例标本粘膜下层正常结构消失,成纤维细胞减少;少量炎细胞浸润
8例标本粘膜下层正常结构消失,基质大部分呈均质状,成纤维细胞减少;炎性渗出明显
软骨层
8例均出现软骨浅层约1-2层软骨细胞变性,余层软骨细胞形态正常
8例均出现软骨浅层2-3层软骨细胞变性,表现同冷冻30s组,其中2例见变性达1/2层
4例标本见软骨浅部1/4层软骨细胞变性,可见软骨细胞坏死,4例标本软骨浅层1/3层软骨细胞变性,可见软骨细胞坏死
3例标本软骨1/2层软骨细胞变性、坏死,5例标本软骨2/3层软骨细胞变性、坏死
外膜层
8例外膜结构均正常
8例外膜结构均正常
8例外膜结构均正常
7例外膜结构正常,1例外膜有少量炎细胞浸润
处理48h后各组标本组织病理学的HE涂片直观图如下:
冷冻30s组
冷冻60s组
APC30w组
APC60w组
气管全层或内侧三层(×40)
粘膜下层(×100)
粘膜上皮不完全剥脱,粘膜下层间质内少量炎细胞
粘膜上皮不完全剥脱,粘膜下层间质内较多炎细胞
粘膜层不可见,粘膜下层正常结构消失
粘膜层不可见,粘膜下层间质呈均质样改变
软骨层(×100)
软骨浅层1-2层可见部分软骨细胞轮廓不正常
软骨浅层3层部分软骨细胞轮廓不正常
软骨浅层部分正常结构消失
软骨层2/3正常结构消失
3.4处理48h后各组标本电镜下结果描述如下:
冷冻30s组
冷冻60s组
30wAPC组
60wAPC组
粘膜层
3例标本中1例见粘膜上皮细胞,微绒毛消失,余未见粘膜上皮细胞
3例标本均未见粘膜层
3例标本均未见粘膜层
3例标本均未见粘膜层细胞
粘膜下层
成纤维细胞细胞核固缩,胞浆内线粒体肿胀;胶原纤维见部分结构不清
可见坏死纤维细胞,部分胶原纤维结构不清,可见毛细血管内红细胞瘀滞
纤维细胞部分崩解,轮廓消失,间质内可见核碎片;胶原纤维部分结构不清,血管内皮细胞崩解坏死,炎细胞数量多
纤维细胞坏死,胶原纤维呈均质样改变;间质内大量成堆核碎片,细胞密度明显减少
软骨层
部分软骨细胞脂肪变性,部分软骨细胞内细胞器减少,所见细胞细胞膜均完整
软骨细胞大部分脂肪变性、空泡变性、核固缩,偶见坏死崩解细胞轮廓
软骨细胞密度减低,所见软骨细胞大部坏死,可见脂肪变性细胞
软骨细胞密度减低,所见软骨细胞均坏死,部分仅存细胞轮廓
外膜层
纤维细胞结构正常,胶原纤维大致正常
纤维细胞大致正常,偶见纤维细胞空泡变性,部分胶原纤维正常结构消失
细胞密度减低,纤维细胞坏死,胶原纤维正常结构消失
间质内细胞少,大量核碎片,胶原纤维均质状,偶见胶原纤维轮廓
电镜下气管各部位正常结构如下:
粘膜上皮细胞(×0.7k)胶原纤维(×6.0k)
纤维细胞(×2.0k)毛细血管(×1.0k)
软骨细胞(×0.5k)
处理48h后各组标本电镜下结果直观图:
冷冻30s组
冷冻60s组
30wAPC组
60wAPC组
粘膜层
粘膜上皮上的微绒毛消失(×0.7k)
未见粘膜层
未见粘膜层
未见粘膜层
粘膜下层
胶原纤维结构模糊(×6.0k)
纤维细胞内线粒体肿胀、细胞核固缩(×2.0k)
胶原纤维结构模糊(×6.0k)
纤维细胞坏死(×2.0k)
毛细血管内红细胞瘀滞(×1.0k)
胶原纤维结构模糊(×6.0k)
纤维细胞坏死(×2.0k)
血管内皮细胞核崩解间质内见核碎片(×1.2k)
胶原纤维呈均质样改变(×6.0k)
纤维细胞坏死(×2.0k)
间质内成堆核碎片(×1.0k)
软骨层
软骨细胞脂肪变性(×0.5k)
软骨细胞坏死(×0.5k)
大部分软骨细胞变性(×0.5k)
软骨细胞坏死(×0.5k)
软骨细胞变性(×0.5k)
软骨细胞坏死,核消失(×0.5k)
外膜层
纤维细胞结构正常(×0.7k)
纤维细胞变性,胶原纤维结构模糊(×0.7k)
细胞密度降低,纤维细胞坏死(×0.7k)
正常细胞结构消失,见大量核碎片(×0.7k)
3.5处理48h后各组标本损伤深度统计(组织病理切片和电镜结合评估)
粘膜层粘膜下层软骨浅1/2层软骨深1/2层外膜层
冷冻30s组8
冷冻60s组62
30wAPC组8
60wAPC组71
采用有序多分类资料秩和检验,H=24.35,χ20.05,3=7.815<24.35,P<0.05,表示四种处理方式的损伤深度不全相同。
将前三种处理方式进行统计学分析,H=4.17,χ20.05,2=5.99>4.17,P>0.05,表示前三种处理方式的损伤深度无统计学差异。
4讨论
气道良恶性肿瘤及其它原因引起的气道肿物由于生长于气道,腔内操作风险大。
近年来随着冷冻、激光、氩等离子体凝固等技术的应用和经验积累,经支气管镜的腔内治疗方法的临床应用越来越多,在具体操作上包括选择能量、操作时间等多借鉴国外的方法及凭借操作医师的经验治疗,各医院在临床操作上各有差异,给处理后的临床疗效和并发症发生情况带来了不确定性。
本文就临床应用较多的氩等离子体凝固术和冷冻消融术在不同的操作时间、使用能量等具体操作上所造成的急性期损伤程度通过动物实验寻找证据,从而为临床操作提供借鉴。
氩等离子体凝固术(argonplasmacoagulation,APC)最初应用于外科手术,用于术中止血,1991年由ERBE公司引入消化内镜介入领域,1994年在德国首次应用于呼吸内镜下介入治疗。
其原理【1】,【2】是氩气喷头和靶组织保持一定距离,高频电压在喷头和靶组织间形成较强的电场,氩气喷出后在强电场作用下形成氩等离子流,此离子流引导电流到达组织表面,电流引起的热效应使组织失活、凝固坏死。
通常认为,电流使表面组织坏死后由于组织干燥失去传导性,阻止电流进一步破坏深部组织,因此APC对组织破坏较浅表。
国内有报道【3】称其组织穿透力仅2-3mm。
国外则报道【4】其凝固深度与作用时间和功率有关系,作用2秒钟凝固深度可达2mm,3秒钟时可达3mm,较长时间才达到4mm。
GuenterFarin等【1】提到肉眼观察到的损伤深度为凝固组织的深度,最大3-4mm,而在组织发生凝固前会先表现为组织失活,失活的组织肉眼难以将其与正常组织区分,也就是说,组织凝固的深度并不代表组织受影响的深度。
在谈及APC在不同组织的操作方法时GuenterFarin表示APC应用于气管支气管时如使用直径1.5mm的细电极,最大功率为40w,单次启动作用时间1-5秒钟,如使用直径2.3mm的粗电极,最大功率60w,单次启动作用时间1-5秒钟。
我国在治疗气道肿物时常用的APC采用直径2.3mm的电极,功率为20-40w,单次启动作用时间为1-3秒钟【5】,【6】。
本实验采用粗电极,选择了30w低能量和60w高能量两种功率,单次启动作用时间为1秒钟。
在本次所报道的实验之前采用过单次启动作用时间为3秒钟,烧灼气管壁半周,48小时后观察,不论是功率为30w的低能量还是60w的高能量均出现了气管壁穿孔的现象,软骨断裂。
因此推断单次启动作用时间为3秒钟在烧灼气道肿物根部时是不可行的。
在判断APC和冷冻消融这两种处理方法是否可行方面就本实验而言,主要考虑此方法对气管壁的损伤有无达到软骨层水平,因为气管的主要生理功能【7】是维持气道通畅,保持肺组织与外界大气相通,气管软骨起到了支撑气道的作用,在各种原因引起的气管破坏损伤患者需要人工气管时除了考虑组织相容性外,主要考虑了其横向具有刚性纵向具有韧性的类似气管软骨所起的作用,也就是说易弯曲成形但不易塌陷。
此外还应避免成纤维细胞向腔内长入【8】,这要求在对气道壁进行有创操作时,粘膜下层的纤维结缔组织所受损伤也是一大问题,需要考虑。
本实验评估的是急性期气道损伤情况,查阅文献【9】后考虑设立观察时间为48小时较为合理。
实验中APC采用30w和60w功率时均采用单次启动作用时间为1秒钟,48h后将处理部位气管壁全层送检病理,HE染色后通过显微镜观察发现损伤在软骨层,电镜下更清晰见到软骨细胞坏死,尤其是60wAPC软骨细胞成片坏死,考虑在处理气道肿物蒂部时APC对正常气管损伤较大,不推荐使用。
冷冻消融术在气道内的应用较APC早,早在1968年GageAA【10】将冷冻技术应用于咽部肿瘤的治疗。
冷冻消融术的原理是[11]在低温下细胞内水分发生冻结,尤其是快速冷冻时水分未进行细胞内外交换直接由液体状态变为固体状态,而缓慢冷冻时细胞内水分会向细胞外转移,细胞内盐浓度升高细胞内的溶液的冰点随之降低,复温时尤其在缓慢复温时细胞内固体状态的小冰晶在融化过程中会发生迁移和相
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