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3紫玉米花色苷研究进展
博士学位论文
紫玉米酒花色苷衍生物形成机理及其抗氧化
与抗肿瘤活性研究
范龚健
指导教师
顾振新教授
专业名称
食品科学
研究方向
生物技术与食品资源高效利用
答辩日期
二○○九年六月
FORMATIONMECHANISMOFPERPLECOENWINEANTHOCYANINSDERIVATIVESANDTHEIRANTIOXIDANTANDANTITUMORACTIVITY
PresentedBy
FANGong-jian
UnderthesupervisionofProfessor(Ph.D)
CollegeofFoodScienceandTechnologyNanjingAgriculturalUniversityNanjing210095,P.R.China
ADissertationSubmittedtoNanjingAgriculturalUniversityinfulfillmentoftherequirementsforthedegreeofPhD
(FoodScience)
CompletedinJune,2009
CommencementinJuly,2009
原创性声明
本人郑重声明:
所呈交的学位论文,是本人在导师的指导下,独立进行研究工作所取得的成果。
除文中已经注明引用的内容外,本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。
对本文的研究做出重要贡献的个人和集体,均已在文中以明确方式标明。
本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。
学位论文作者(需亲笔)签名:
年月日
学位论文版权使用授权书
本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定,同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,允许论文被查阅和借阅。
本人授权南京农业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编学位论文。
保密□,在年解密后适用本授权书。
本学位论文属于不保密□。
(请在以上方框内打“√”)
学位论文作者(需亲笔)签名:
年月日
导师(需亲笔)签名:
年月日
目录
中文摘要I
ABSTRACTIV
缩略词表VIII
表格索引IX
图形索引X
前言XV
第一章文献综述1
1花色苷研究进展1
1.1花色苷基本结构1
1.2花色苷提取2
1.3花色苷纯化3
1.4花色苷结构解析4
1.5花色苷稳定性4
1.6花色苷生理功能10
2花色苷衍生物研究进展15
2.1辅色现象15
2.2花色苷衍生物分类16
2.3吡喃型花色苷的形成19
2.4吡喃型花色苷的颜色21
2.5陈酿期间吡喃型花色苷变化22
3紫玉米花色苷研究进展22
3.1紫玉米花色苷的性质22
3.2影响紫玉米花色苷稳定性的因素24
3.3紫玉米花色苷生理功能25
4本研究的目的意义及主要内容26
4.1本研究目的意义26
4.2主要研究内容27
第二章紫玉米酒发酵过程中色泽和花色苷变化41
1材料与方法41
1.1试验材料41
1.2培养基42
1.3实验试剂42
1.4主要仪器与设备42
1.5紫玉米酒发酵42
1.6测定指标与方法43
1.7数据分析44
2结果与分析45
2.1糖化曲对紫玉米的糖化作用45
2.2紫玉米酒颜色变化45
2.2.1紫玉米酒明度变化45
2.2.2紫玉米酒彩度变化46
2.2.3紫玉米酒色调角变化46
2.3紫玉米酒颜色密度变化47
2.4紫玉米酒色调变化48
2.5紫玉米酒总酚指数变化48
2.6紫玉米酒总花色苷含量变化50
2.7紫玉米酒花色苷组分分析50
2.8紫玉米酒花色苷结构初探51
3讨论56
3.1糖化曲对紫玉米酒颜色的影响56
3.2糖化曲对紫玉米花色苷组分的影响57
3.3紫玉米酒颜色与花色苷的关系57
4本章小结58
第三章阿魏酸和咖啡酸对紫玉米酒的辅色作用研究61
1材料与方法61
1.1试验材料61
1.2培养基62
1.3主要试剂62
1.4主要仪器与设备62
1.5紫玉米酒的发酵62
1.6紫玉米酒的陈酿62
1.7测定指标与方法62
1.8数据分析63
2结果与分析63
2.1阿魏酸对紫玉米酒的辅色作用63
2.1.1阿魏酸对紫玉米酒颜色的影响63
2.1.2阿魏酸对紫玉米酒总酚指数的影响65
2.1.3阿魏酸对紫玉米酒总花色苷的影响65
2.1.4阿魏酸对紫玉米酒花色苷组分的影响66
2.1.5阿魏酸—花色苷衍生物的光谱特征67
2.2咖啡酸对紫玉米酒的辅色作用68
2.2.1咖啡酸对紫玉米酒颜色的影响68
2.2.2咖啡酸对紫玉米酒总酚指数的影响70
2.2.3咖啡酸对紫玉米酒总花色苷的影响71
2.2.4咖啡酸对紫玉米酒花色苷组分的影响71
2.2.5咖啡酸—花色苷衍生物的光谱特征72
2.3辅色剂对紫玉米酒的辅色作用比较73
3讨论74
3.1陈酿对紫玉米酒颜色和花色苷的影响74
3.2阿魏酸和咖啡酸对紫玉米酒颜色的影响74
3.3阿魏酸和咖啡酸对紫玉米酒总花色苷含量的影响75
3.4阿魏酸和咖啡酸对紫玉米酒花色苷组成的影响75
4本章小结75
第四章紫玉米酒花色苷衍生物形成机理初探79
1材料与方法79
1.1试验材料79
1.2主要试剂80
1.3主要仪器80
1.4紫玉米花色苷提取与纯化80
1.5花色苷辅色体系的建立80
1.6测定指标与方法81
1.7数据分析81
2结果与分析81
2.1辅色剂对紫玉米花色苷颜色的影响81
2.1.1辅色剂对紫玉米花色苷明度的影响81
2.1.2辅色剂种类对紫玉米花色苷彩度的影响82
2.1.3辅色剂种类对紫玉米花色苷色调角的影响83
2.2辅色剂对紫玉米花色苷光谱特征的影响83
2.2.1辅色过程中最大吸收峰变化83
2.2.2辅色过程中紫玉米花色苷光谱曲线变化84
2.3模拟体系中紫玉米花色苷颜色密度变化85
2.4模拟体系中紫玉米花色苷色调变化86
2.5模拟体系中花色苷组分分析86
2.6模拟体系中紫玉米花色苷含量变化87
2.7模拟体系中花色苷衍生物变化88
2.8紫玉米花色苷衍生物结构解析89
2.9模拟体系中与紫玉米酒中花色苷衍生物比较92
3讨论93
3.1阿魏酸和咖啡酸的辅色效果93
3.2花色苷降解与花色苷衍生物形成94
3.3花色苷衍生物形成机理94
4.本章小结96
第五章紫玉米酒花色苷衍生物抗氧化和抗肿瘤活性研究101
1材料与方法102
1.1细胞系102
1.2主要试剂102
1.3主要仪器和设备102
1.4紫玉米酒花色苷及其衍生物制备102
1.5紫玉米酒花色苷及其衍生物的分离103
1.6肿瘤细胞的复苏、培养与传代103
1.7测定指标与方法103
1.8数据分析105
2结果与分析105
2.1紫玉米花色苷及其衍生物分离纯化105
2.2紫玉米花色苷及其衍生物的抗氧化作用107
2.2.1还原力107
2.2.2总抗氧化能力108
2.2.3清除DPPH自由基能力108
2.2.4抑制脂质过氧化能力109
2.2.5清除超氧阴离子能力109
2.2.6清除羟基自由基能力110
2.3紫玉米花色苷及其衍生物的抗肿瘤作用111
2.3.1对人胃癌细胞MGC-823的生长抑制作用111
2.3.2对人肠癌细胞HCT-116的生长抑制作用111
2.3.3对人胃癌细胞MGC-823和人肠癌细胞HCT-116的损伤作用111
2.3.4对人胃癌细胞MGC-823和人肠癌细胞HCT-116的凋亡诱导作用113
3讨论115
4本章小结116
全文结论121
创新点123
致谢125
攻读博士期间发表论文及申请专利情况127
紫玉米酒花色苷衍生物形成机理及其抗氧化
与抗肿瘤活性研究
中文摘要
本文比较了不同酒曲对紫玉米的糖化作用,研究了紫玉米酒精发酵过程中色泽、总酚指数和花色苷组分与含量变化,探讨了阿魏酸和咖啡酸对紫玉米酒陈酿过程中色泽和花色苷含量与组分的影响,用建立阿魏酸和咖啡酸的模拟辅色体系研究花色苷溶液的色泽变化和花色苷及其衍生物的变化规律,以揭示紫玉米酒花色苷衍生物的形成机理;对陈酿后的紫玉米酒花色苷进行分离纯化,比较紫玉米酒花色苷及其衍生物的抗氧化和抗肿瘤活性。
研究结果如下:
1、比较研究了2种酒曲对紫玉米糖化效果。
结果表明,酒曲A(陕西户县产)适合于紫玉米的糖化,糖化后的紫玉米醪中还原糖和总花色苷含量分别达到232.29mg/g和433.7μg/g,均显著高于用酒曲B(江苏苏州产)糖化的209.45mg/g和329.5μg/g。
采用传统小曲工艺发酵紫玉米酒,研究紫玉米酿制过程中的颜色和总花色苷含量与组分的变化。
结果表明,紫玉米酒酿制过程中花色苷被降解,总花色苷含量下降,最终紫玉米酒中总花色苷含量分别为150.3μg/ml和142.3μg/ml。
紫玉米酒在7d的酿制过程中明度和彩度呈上升趋势。
紫玉米酒的总花色苷含量和紫玉米酒的彩度呈正相关,与色调角呈负相关,与明度无相关性。
采用HPLC-MS检测紫玉米酒酿造过程中花色苷含量与组分变化。
结果表明,紫玉米酒中的主要花色苷为:
矢车菊素-3-葡萄糖苷、天竺葵素-3-葡萄糖苷、芍药素-3-葡萄糖苷、矢车菊素-3-葡萄糖苷和芍药素-3-葡萄糖苷经丙二酸酰化后的花色苷。
经酒曲A糖化后得到得紫玉米酒中各花色苷相对含量为29.46%,4.59%,22.36%,29.96%和13.63%;经酒曲B糖化后得到的紫玉米酒中各花色苷相对含量为32.97%,4.01%,23.46%,22.38%和17.18%。
紫玉米酒在发酵过程中花色苷各组分含量均下降,未酰化的花色苷降解显著。
2、经酒曲A糖化后酿制的紫玉米酒在15℃下避光陈酿,研究陈酿期间紫玉米酒的颜色和花色苷变化规律。
结果表明,紫玉米酒总花色苷在陈酿过程中呈降解趋势,紫玉米酒由红色变为橙色。
经140d陈酿后,添加0.1mg/ml的阿魏酸和咖啡酸后总花色苷含量分别达到180.32μg/ml和157.51μg/ml,分别比对照高出38.48%和20.97%。
辅色剂浓度越大紫玉米酒中总花色苷含量越高,紫玉米酒的辅色效果越明显。
通过HPLC-DAD检测发现,辅色后的紫玉米酒花色苷最大吸收峰均发生蓝移效应。
添加阿魏酸后,紫玉米酒中生成了4种花色苷衍生物,其出峰时间分别为:
31.26,33.37,34.17和38.23min,可见光区吸收峰为506、506、502和506nm;添加咖啡酸后,生成了5种花色苷衍生物,其出峰时间分别为:
28.53,30.62,31.41,34.41和38.43min,可见光区吸收峰为506、506、502、506和503nm。
3、模拟紫玉米酒的pH值与酒精度,建立紫玉米花色苷和辅色剂的辅色体系,研究模拟体系贮藏过程中的颜色和花色苷变化规律。
研究结果表明,添加阿魏酸和咖啡酸的紫玉米花色苷溶液经140d避光贮藏,明度显著降低,色品a*值和b*值均有增加趋势。
辅色后的紫玉米花色苷溶液仍能显现红色,而未添加辅色剂则变为无色,且贮藏80d时吸收峰消失。
HPLC-DAD结果表明,添加辅色剂后,紫玉米花色苷溶液的吸收峰发生蓝移效应,最大吸收峰由贮藏前的515nm蓝移至贮藏结束时的505nm。
模拟体系中紫玉米花色苷经阿魏酸和咖啡酸辅色后均生成3种吡喃型花色苷。
根据花色苷衍生物的HPLC-MS技术推测阿魏酸和咖啡酸与花色苷直接反应生成了吡喃型花色苷。
经阿魏酸后生成的花色苷衍生物有:
矢车菊素-3-葡萄糖苷-乙烯基愈创木酚,天竺葵素-3葡萄糖苷-乙烯基愈创木酚和芍药素-3葡萄糖苷-乙烯基愈创木酚;经咖啡酸后生成的花色苷衍生物有:
矢车菊素-3-葡萄糖苷-乙烯基儿茶酚,天竺葵素-3葡萄糖苷-乙烯基儿茶酚和芍药素-3葡萄糖苷-乙烯基儿茶酚。
紫玉米花色苷衍生物与辅色剂的种类及其两者作用时间(即陈酿时间)有关。
通过对模拟体系中花色苷及其衍生物变化规律的研究发现,添加阿魏酸的花色苷组分降解明显,其花色苷衍生物在50d时检测到吡喃型花色苷;添加咖啡酸后在贮藏80d时检测到吡喃型花色苷;阿魏酸比咖啡酸更易和花色苷作用生成吡喃型花色苷。
4、采用大孔树脂HP-10和葡聚糖LH-20分离纯化紫玉米酒花色苷。
结果表明,紫玉米中分离得到的Cy-3-G组分和Pn-3-G组分的相对保留面积分别达到86.45%和96.23%。
添加阿魏酸和咖啡酸后的紫玉米酒花色苷衍生物中的主要成分矢车菊素-3-葡萄糖苷-乙烯基愈创木酚和矢车菊素-3-葡萄糖苷-乙烯基儿茶酚分别达到69.70%和70.43%。
5、在本研究建立的6个抗氧化体系中,Cy-3G均能表现出较强的抗氧化能力。
花色苷衍生物Fa和Ca总抗氧化能力分别达到15.01和13.90U/g,清除超氧阴离子能力分别达到80.65和87.56U/g,两者和Pn-3-G之间差异不显著。
花色苷衍生物Fa和Ca清除DPPH自由基的抑制率分别达到66.95%和60.33%,两者显著高于Pn-3-G的抑制率。
花色苷衍生物Fa和Ca清除羟自由基能力分别为319.53和582.84U/mg,两者显著低于Pn-3-G的。
花色苷衍生物Fa的还原力、清除DPPH自由基能力、抑制脂质过氧化能力和清除羟自由基能力均低于花色苷衍生物Ca,但是总抗氧化能力高于花色苷衍生物Ca。
6、采用MTT法检验花色苷衍生物对人胃癌细胞MGC-823和人肠癌细胞HCT-116的抗肿瘤活性,结果表明,5种花色苷组分对肿瘤细胞均有抑制作用。
Cy-3-G对人胃癌细胞MGC-823的半数抑制浓度为140.3μg/ml,高于Pn-3-G的107.9μg/ml;Cy-3-G对人肠癌细胞HCT-116的半数抑制浓度为76.7μg/ml,高于Pn-3-G的72.3μg/ml,表明这两种花色苷对人肠癌细胞HCT-116抑制作用较好,且Pn-3-G的抑制作用好于Cy-3-G。
花色苷衍生物Fa和Ca对人胃癌细胞MGC-823的抑制率高于其他3种组分,其数抑制浓度74.5和75.0g/ml,两者之间的半数抑制浓度差异不显著。
花色苷衍生物Fa对人肠癌细胞HCT-116抑制作用显著,其半数抑制浓度为55.6g/ml,显著低于花色苷衍生物Ca。
两种花色苷衍生物对人肠癌细胞HCT-116抑制作用均高于Cy-3-G、Pn-3-G和PCW。
随着花色苷及其衍生物浓度的增加,其抗肿瘤活性越强。
对给药后的细胞进行可见光形态学观察和DAPI荧光染色观察。
结果表明,人胃癌细胞MGC-823和人肠癌细胞HCT-116给药后出现细胞变圆和浮起,胞膜皱缩。
对给药后肿瘤细胞进行DAPI荧光染色,发现加药后细胞呈现核固缩现象,致密浓染的细胞核数目明显增加,并伴有核型不规则变化及体积缩小,出现核碎裂等凋亡的特征。
关键词:
紫玉米;花色苷衍生物;酿酒;抗氧化;抗肿瘤
FORMATIONMECHANISMOFPERPLECOENWINEANTHOCYANINSDERIVATIVESANDTHEIRANTIOXIDANTANDANTITUMORACTIVITY
ABSTRACT
EffectsofXiaoquonthesaccharificationofpurplecornwereinvestigatedinthispaper.Winecolor,totalpolyphenolindexandcompositionandcontentofanthocyaninsweredetectedinthealcoholfermentationwithSaccharomycescerevisiae.Afterfermentation,purplecornwine(PCW)wasco-pigmentedwithferulicacidandcaffeicacidduringaging.Effectsoftheseco-pigmentsonthecolorandanthocyaninsofpurplecornwinewerestudied.Andthenthesimulationsofco-pigmentationsystemwereestablishedwithferulicacidandcaffeicacid.Thecolorchangesofthsesimulationsystemsweredeterminedduringstorage.Thevariationsofanthocyaninsandtheirderivativeswerediscussedandtheirformationmechanismwasrevealedinthispaper.PCWanthocyaninswereseparatedandpurificated,theirantioxidantandantitumoractiveitywerecompared.Themainresultsandfindingsweresummarizedasfollows:
1.WinestarchA,whichwasfromShanxi,HuCounty,wassuitableforthesaccharificationofpurplecorn.Aftersaccharification,thereducingsugarandtotalanthocyaninsreached232.29mg/gand433.7μg/g.TheyweresignificantlyhigherthanwhichwassaccharifiedbySuzhouwinestarch(209.45mg/gand329.5μg/g).
Purplecornwinewasfermentedbytraditionalxiaoqutechnology.Changeofcolorandtotalanthocyanincontentduringbrewingofpurplecornwinewereinvestigated.Theresultsshowedthatduringthebrewing,thecontentoftotalanthocyaninsdecreasedandtheanthocyaninsdegraded.Totalanthocyaninscontentreached150.3μg/mland142.3μg/mlattheendofalcoholfermentation.LightnessandChromaincreasedduringthe7days’fermentation.TatalanthocyaninspositivelycorrelatedwithChroma,andnegativelycorrelatedwithhue,buthadnocorrelationwithlightness.
HPLC-MSwasusedtodetecttheanthocyaninscontentandcompositionsduringbrewing.Fiveanthocyaninsweredetectedandtheywerecharacterizedascyanidin-3-glucoside,pelargonidin-3-glucoside,peonidin-3-glucoside,cyanidin-3-(6’’-malonylglucoside)andpeonidin-3-(6’’-malonylglucoside).Therelativecontentofthesefiveanthocyaninswere29.46%,4.59%,22.36%,29.96%and13.63%inthepurplecornwinewithwinestarchAand32.97%,4.01%,23.46%,2.38%and17.18%inthewinewithwinestarchB.Thecontentofeachanthocyanindecreasedandthenon-acylatedanthocyaninsdegradedsignificantly.
2.Purplecornwinewasagingat15℃induckness.Thechangeofcolorandanthcoyaninswerestudiedintheagingofpurplecornwine.Theresultsshowedthattotalanthocyaninscontinuouslydegradedduringaging.Thecolorofpurplecornwineturnedfromredtoorange.After140day’saging,totalanthocyanininthesampleswith0.1mg/mlofferulicacidandcaffeicacidwas180.32and157.51μg/ml,whichwasincreasedby38.48%and20.97%,respectivelymorethanthoseofcontrast.Moreover,themoreco-pigmentswereadded,thehighertotalanthocyaninscontentweredetectedandthebetterco-pigmentationwasobtained.
HPLC-DADresultsshowedthatthemaximumabsorptionpeakofthesetwokindsofwineshiftedhypsochromi
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