疾控中心检定菌保存传代使用销毁标准操作规程.docx
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疾控中心检定菌保存传代使用销毁标准操作规程
检定菌种保存、传代、使用、销毁标准操作规程
1.目的:
为规范微生物学检定用菌的管理,确保菌种的溯源性与稳定性,从而确保微生物学检验结果的准确可靠。
2.范围:
本规程适用于检定用菌种的管理,包括菌种的申购、保存、传代、使用及销毁等。
3、定义:
标准菌种是指由中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏管理中心提供的冷冻干燥菌。
传代用菌种是指用标准菌种制备的采用特定保存方法长期固定保存的菌种,用于传代及制备工作用
菌种。
工作用菌种是指用标准菌种或传代用菌种接种至普通琼脂斜面培养后,作为日常工作使用的菌种。
菌种的代是指将其接种至一新鲜培养基上或培养基内,每萌发一次即称为一代,从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0代。
4.职责:
4.1检验科负责提出菌(毒)种的购买申请,并按国家有关生物安全法规的要求做好使用管理和销毁工作。
4.2总务科负责实施采购,检验科负责保存、验收。
5.规程:
5.1.检定菌的申购
检验科每年根据检定菌种的使用情况(包括临时检验需要),提出购买计划,交由中心分管主任审批后,向中检所菌种保藏中心购买冻干菌种(标准菌种);也可以直接向省(市)疾控部门申请提供传代用菌种,需询问与确定菌种的代数,以便传代时控制代数。
5.2.检定菌的接收
菌种到达实验室后,由菌(毒)种保管人接收菌种,检查其名称和数量,以及每一支的完整性,同时将菌种的所有信息,填写在《检定菌种接收记录》(附表1)上,并将其暂贮存于4~8℃冰箱中,在一周内必须完成转种。
5.3.检定菌的保存
5.3.1.工作用菌种的保存
工作用菌种采用斜面低温保存法。
将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上,待菌生长充分以后,转移至2~8℃冰箱中保存。
此法仅用于工作用菌种的短期保存,并应随时检查其污染杂菌和变异等情况,发现异常情况,经应灭活处理后销毁。
保存时间根据菌种种类而不同,细菌:
1个月;酵母菌:
2个月;霉菌及芽胞:
3个月。
5.3.2.传代用菌种的保存
采用甘油冷冻管保藏法或液体石蜡保存法。
5.3.2.1.甘油冷冻管保存法
用无菌接种环轻轻刮取经冷冻复溶增菌后并接种至平板或琼脂斜面的菌苔,并通过接种环与试管壁之间的轻轻摩擦而使细菌充分扩散到预先装入试管中的无菌纯化水中,调整菌液浓度,使其等同于10号比浊管,向已制备好的菌悬液中加入等体积的无菌甘油(浓度20%),即为10%甘油菌悬液,轻轻振摇,使内容物充分混合,分装于无菌小试管,在-80℃冷冻条件下保存。
此甘油冷冻管为第2代(G2)。
可以每隔2年转种一代。
使用时,取出一支放至室温,转种增菌培养或接种至琼脂斜面复苏,挑取纯菌落传代或工作用。
此种方法主要适用于需氧细菌和酵母菌的保藏(如大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门菌)。
5.3.2.2.液体石蜡保存法
5.3.2.2.1.无菌液体石蜡的制备:
选用优质化学纯液体石蜡,将液体石蜡分装加塞,用牛皮纸包好,在121℃灭菌30分钟,置40℃恒温箱中蒸发水分,经无菌检查后备用。
5.3.2.2.2.液体石蜡管的制备:
将菌种穿刺接种于半固体高层培养基中,在适宜条件下培养结束后,在层流台下用无菌吸管吸取上述无菌液体石蜡至培养好的菌种管内,并使石蜡高出菌种表面约1cm使菌体与空气隔绝,并将试管直立,置于-20℃冷冻或2~8℃冰箱中保存。
此法主要适用于霉菌、厌氧菌、放线菌、芽孢杆菌的保存(如枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌等)。
5.3.3.各菌种的保存方法、条件及期限,见《传代用菌种保存方法、保存温度、保存期限》(附件1)。
5.4.检定菌的传代
检定菌菌种的传代因冻干菌(标准菌种)与传代用菌种而不完全相同。
5.4.1.标准菌种的复苏、确认、传代
5.4.1.1.标准菌种的复苏
5.4.1.1.1.把冻干菌种管、灭菌毛细滴管(1ml)、双碟、镊子、营养肉汤培养基(或其它适宜培养基)数支,移入接种室或超净工作台。
5.4.1.1.2.将冻干菌种管外壁用碘酒擦洗消毒,稍干,用75%乙醇棉擦净,放在灭菌双碟内,待干。
点燃酒精灯,将标准菌种管的封口一端在火焰上,烧灼红热,用灭菌毛细滴管吸取营养肉汤培养基(或其它适宜的培养基),滴在灼热的菌种管封口一端,使骤冷而炸裂。
5.4.1.1.3.取灭菌镊子,在火焰旁,将炸裂的管口打开,放入灭菌双碟内,另取1支灭菌毛细滴管,在火焰旁吸取营养肉汤培养基(或其它适宜的培养基)少许,加至菌种管底部,将冻干菌块搅动促使溶解,随即吸出管内菌液,接种至营养肉汤培养基(或其它适宜的培养基)内,并根据不同菌种类型而将其培养于相宜的温度下24~72小时(细菌需要24~48h的培养物,酵母菌需要72小时的培养物,形成孢子的微生物则宜保藏孢子,放线菌和丝状真菌则应培养7~10天)。
最后将毛细滴管及菌种管经高温灭菌(121℃,45分钟)。
5.4.1.1.4.取出培养物,仔细观察液体培养基是否浑浊,浑浊说明菌种复活生长,若不浑浊,在将其作为无活菌生长的培养物丢弃以前,细菌应至少培养1周以上,真菌和酵母菌至少应培养2周以上,并在丢弃之前应高温灭活处理(121℃,45分钟)。
5.4.1.2.标准菌种的确认
5.4.1.2.1.用无菌接种环取上述培养物接种到营养琼脂培养基(细菌)或玫瑰红钠培养基(真菌和酵母菌)平板上,或相应的宜于该菌生长的鉴别培养基平板上,然后在30~35℃下培养3天(细菌);20~25℃下培养5天(真菌和酵母菌)。
培养后,首先观察其是否具有典型的菌落形态,然后挑取生长旺盛的单一的纯菌落,划线于平皿培养基,每种菌划4个平皿,以便收集较多的生长旺盛的典型单菌落,进行保存和鉴定。
鉴定时作革兰氏染色、镜检,观察其染色特性及形态特征。
最后再做生化实验以进一步鉴定该菌种。
若在该平板上发现有其它菌落生长,则说明操作有污染或菌种不纯,应将此被污染了的培养物灭活处理,并寻找原因。
应根据其原因采取措施重新分离挑选纯菌落。
5.4.1.2.2.菌种的确认结果,记录在《检定菌种鉴定记录》上。
5.4.1.2.3.各检定菌种的复活、划线用培养基、培养条件,见《菌种复活、划线用培养基、培养条件》(附件2)。
5.4.1.3.标准菌种的传代
5.4.1.3.1.按菌种说明书要求复溶菌粉,转种于适宜的增菌培养基内,称第1代(G1),复壮后转接至平板上,并在适当温度下培养适当时间,分离单个纯种菌落,此为第2代(G2)。
5.4.1.3.2.菌种确认后,挑取平板上纯菌落制成浓菌悬液用于制备甘油冷冻管,作为保存菌种(G2),也称传代用菌种,同时挑取纯菌落转接斜面菌种数支,作为工作用菌种,此为第3代(W3)。
5.4.1.3.3.将第2代(G2)菌种管冷冻保存,将工作用菌(W3)于适当温度下培养适当时间后用于日常检验。
5.4.1.3.4.取一支冷冻保存的第2代(G2)菌种转种于平板和斜面培养基上,平板上的菌种制成冷冻保存管第3代(G3);斜面培养基的菌种经适当温度下培养适当时间后用作工作用菌种,此仍为第3代(W3)。
5.4.1.3.5.将第3代菌种(G3)冷冻或低温保存,将生长、转种后的第2代(G2)菌种经高温灭活处理后丢弃。
5.4.1.3.6.按上述规程操作,直至G4转为W5为止,需重新开启冷冻干燥菌种,重复上述规程操作,保存和使用菌种。
5.4.1.3.7.当工作用菌种代数小于5时,在规定保存期限内,可直接用上一代工作用菌种转接下一代工作用菌种。
5.6.4.2.传代用菌种的传代
当无标准用菌种时,可从省(市)疾控部门申请提供菌种作为传代用菌种,不需经过复溶增菌,但应划线接种确认。
将无异常的传代用菌种(一般为第3代),根据日常检验工作的需要量,挑取纯菌落转接斜面菌种数支,作为工作用菌种(为第4代),同时,结合菌种的代数和最长保存期限,挑取纯菌落制成浓菌悬液按“5.3.2.”的方法制备甘油冷冻管或液体石蜡管数支,作为传代用菌种(仍为第3代)。
5.4.3.工作用菌种的传代
当工作用菌种代数小于5时,可直接用上一代工作用菌种转接下一代工作用菌种。
取在冰箱4~8℃保存的工作用菌种用普通琼脂斜面传代,并将新传代的培养物替代原有的菌种,作为工作用菌种。
也可取用“甘油冷冻管保藏法或液体石蜡覆盖保藏法”保存的菌种,进行复苏,直接作为工作用菌种。
细菌每1个月传代一次;酵母菌每2个月传代一次;霉菌及芽胞每3个月传代一次。
当超过5代,须用传代用菌种传代。
5.4.4.传代时注意无菌操作,使菌株不死亡,不污染、不丢失。
同时实验人员也要采取有效的预防措施进行自我保护,如工作时必须穿工作服,佩带无菌手套,实验完成以后消毒实验进行的区域、实验仪器和器具。
如发生意外,如菌种泄漏或人员受伤,微生物学检验人员应立即向检验科科长报告以便及时进行处理。
5.4.5.传代后,按检定菌种的编号原则编号,并在每一支菌种管上贴上标签,标签内容包括:
名称、编号、代数、传代日期、操作人、有效期。
同时及时填写《检定菌种传代记录》(附表2)。
5.5.检定菌种的编号
采用汉字加数字表示:
汉字简称—代次—传代日期—顺序号
菌种的汉字简写:
大肠埃希菌(简称:
大肠)、金黄色葡萄球菌(金葡)、沙门氏菌(沙门)、志贺氏菌(志贺)、铜绿假单胞菌(铜绿)、副溶血弧菌(副溶血)、蜡样芽胞杆菌(蜡样)......。
代数用一位带有下标数字的字母表示:
传代用菌种用G表示;工作用菌种用W表示;如G3表示传代用菌种第3代;W3表示工作用菌种第3代。
传代日期用6位数字表示:
年份取四位数,月、日分别用两位数。
如2014年1月12日传代的第一支大肠埃希菌作为传代用菌种的编号为:
大肠-G3-20140112-01。
5.6.检定菌种的保管
5.6.1.检定菌种设专人加双锁保管,并对所保存的菌种建立《检定菌种保存、领用登记台账》(附表3)。
5.6.2.检定菌种的定期检查与鉴定
在菌种的保存期间,应每天检查保存菌种冰箱的温度、菌种管的塞子是否松动或生霉,并及时填写《检定菌种观察记录》(附表4),如有异常应及时处理。
菌种在保存期内均应根据菌种的特性(工作用菌种每转种两代一次、传代用菌种每三个月一次)检查其菌落性状、革兰染色、显微镜下菌体形态及生化特性等项目,若发现与原菌种变异较大,应重新分离、纯化、鉴定、再加以保存,并做好《检定菌种鉴定记录》(附表5)。
5.6.3.所保管的菌种,不能随意转让其他单位和个人,需要时应有单位证明和批准手续方可供应。
5.7.检定菌种的领用与使用
5.7.1.微生物学检验人员根据检验需要,需向菌种保管人员领取工作用菌种或传代用菌种,同时填写《检定菌种领用登记台账》相关内容。
5.7.2.微生物学检验人员领取工作用菌种或传代用菌种,用于日常检验或验证试验,使用后及时填写《检定菌种使用登记台账》(附表6),以便追踪菌种使用历史。
5.8.检定菌种(废弃)的销毁
5.8.1.下列情况的菌种或培养物或被污染的器具等,必须采用121℃、45分钟湿热灭活处理:
新一代菌种制备成功后的上一代菌种;
使用完后的菌种和带有标准菌种的器具和培养物;
超过有效期的菌种;
凡被污染、变异、可疑等异常情况菌种;
其他应废弃的菌种。
5.8.2.废弃菌种的销毁由菌种保管人提出申请,由检验科科长批准后,由微生物学检验员进行灭活处理,并有其他人在场监督,并填写《废弃菌种(物品)销毁处理记录》(附表7)。
6.记录归档
本标准涉及的记录由质量管理部门保存,保存期5年。
7.附则:
本标准附件二份,附表六份:
附件1:
《传代用菌种保存方法、保存温度、保存期限》
附件2:
《菌种复活、划线用培养基、培养条件》
附表1:
《检定菌种接收记录》
附表2:
《检定菌种传代、分离记录》
附表3:
《检定菌种保存、领用登记台账》
附表4:
《检定菌种观察记录》
附表5:
《检定菌种鉴
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