鸡传染性法氏囊的诊断技术.docx
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鸡传染性法氏囊的诊断技术
鸡传染性法氏囊的诊断技术
前言
鸡传染性法氏囊病(IBD)是由IBDV引起的一种主要危害雏鸡的免疫抑制性传染病。
本病1957年首先在美国特拉华州岗博罗(Gumboro)镇的肉鸡群中发现的,故又称岗博罗病(Gumborodisease)。
根据本病有肾小管变性等严重的肾脏病变,曾命名为“禽肾病”。
又因该病主要以损伤鸡免疫器官法氏囊为主,1970年为避免一病多名引起的混乱,统一称之为鸡传染性法氏囊病。
本标准是参考OIE《诊断试验和疫苗标准手册》,并结合我国现有动物卫生法规、农业部对传染性法氏囊的相关政策和措施及河欣科技中心试验条件制定的。
1范围
本标准制定了传染性法氏囊的病毒分离、鉴定技术,病毒中和试验(VNT)、琼脂凝胶免疫扩散(AGID)试验、酶联免疫吸附试验(间接ELISA)、PCR的技术要求。
2病毒分离与鉴定技术
2.1材料准备
2.1.1 病料的采取及处理
病料的采取 病毒分离的病料应采自发病早期典型的病例,病程较长的家禽不宜用于分离病毒。
病禽扑杀后应以无菌操作法解剖尸体和采取病料,不同传染病所采病料不同,最好的检验病料为气管黏膜、肺、脑组织,应优先采集。
高热期的血液中也有较高病毒含量。
另外,脾、肝、肾和骨髓也可做为病毒分离的材料。
2.1.2病料处理 按1克组织加入5~10毫升灭菌生理盐水进行研磨。
每毫升研磨液中加入青霉素和链霉素各2000单位,置4℃冰箱作用2~4小时或37℃处理1小时后,以1500转/分钟离心15分钟,取上清液作为接种材料。
2.1.3无菌检验 对接种材料应作无菌检验。
接种营养肉汤或血液琼脂平板,观察有无细菌生长。
如有细菌,则应对材料进行滤过除菌或加入敏感抗菌药物处理。
2.2病毒分离
2.2.1 鸡胚选择与孵化 鸡胚应选择健康鸡群所产新鲜受精蛋,蛋的颜色以白壳蛋为好,照蛋时易于观察。
孵化温度以37.5℃,湿度60%左右为宜。
每天翻蛋3~4次,注意放蛋时应大头朝上,鸡胚接种日龄因分离繁殖的病毒特征不同在6~12日之间。
2.2.2接种前准备与接种 根据接种目的和分离的病毒特性不同,鸡胚接种分为绒毛尿囊腔内接种、卵黄囊接种、绒毛尿囊膜接种和羊膜腔接种等方法。
接种材料应确认无菌。
经照蛋后画出气室和鸡胚位置,先用碘酒棉球、后用酒精棉球涂擦消毒接种位置及其周围。
以绒毛尿囊腔内接种为例,接种位置一般选在气室边缘上3毫米处,在该部位打孔,用1毫升或2.5毫升灭菌注射器吸取处理后的病料,插入气室下部小孔约5~10毫米,每胚注射0.1~0.2毫升,然后用融化的石蜡将蛋壳小孔封闭。
2.2.3接种后检查 接种后每隔6小时照蛋一次,24小时内死亡鸡胚应丢弃并做无害化处理。
24小时后死亡鸡胚连同72小时未死亡鸡胚,置4℃经6~12小时后取出收获材料,同时检查鸡胚病变情况。
2.2.4鸡胚材料收获 一般情况,接种部位即为收获材料的部位。
尿囊腔接种者,无菌收取尿囊液;羊膜腔接种者,在先收取绒毛尿囊液后再用注射器吸取羊水;卵黄囊接种者,先收取尿囊液和羊水后再收取卵黄液。
以上收获物应作无菌检验,防止细菌污染。
2.3病毒鉴定
2.3.1法氏囊病毒的特异性鉴定:
样品接种鸡胚后,若鸡胚尿囊液没有凝血性,可用没有血凝性的鸡胚的绒毛尿囊液制备抗原,与法氏囊病毒标准阳性血清进行AGID试验,检测样品中是否含有法氏囊病毒。
2.3.2.1抗原的制备:
从没有凝血活性的鸡胚中取出绒毛尿囊液,以1000r/min离心10分钟后取上清,按终浓度0.1%的量加入甲醛溶液,置37℃温箱灭活36h做灭活检验后即可作为AGID试验用抗原。
3琼脂凝胶免疫扩散(AGID)试验
3.1材料准备
3.1.1硫柳汞溶液、PH值7.2,0.01mol/LPBS溶液,配制见附录A
3.1.2琼脂板:
制备方法见附录B
3.1.3法氏囊琼脂凝胶免疫扩散抗原、标准阴性血清和阳性血清。
3.2操作方法
3.2.1打孔:
在制备的琼脂板上按7孔一组的梅花形打孔(中间1孔,周围6孔),孔径约5mm。
孔距2mm-5mm,将孔中的琼脂用8号针头斜面向上从右侧边缘插入,轻轻向左方向将琼脂挑出,勿伤边缘或使琼脂层脱离皿底。
3.2.2封底:
用酒精灯轻烤平皿底部至琼脂刚刚要融化为止,封闭孔的底部,以防侧漏。
3.2.3加样:
用微量移液器或带有6-7号针头的0.25ML注射器,吸取抗原悬液滴入中间孔,标准阳性血清分别加入外周1、4孔中,被检血清按编码顺序分别加入另外4个外周孔,每孔均以加满不溢出为度,没加一个样品换一个滴头。
3.2.4作用:
加样完毕后,静置5min-10min,然后将平皿轻轻倒置放入湿盒内,37℃温箱中作用,分别在24h、48h、72h观察并记录结果。
3.3结果判定
3.3.1判定方法
将琼脂板置日光灯或侧强光下观察,若标准阳性血清与抗原孔之间出现一条清晰的白色沉淀线,则实验成立。
3.3.2判定标准
3.3.2.1若被检血清孔与中心孔抗原之间出现清晰致密的沉淀线,且该线与抗原与标准阳性血清之间沉淀线的末端相吻合,则被检血清判为阳性。
3.3.2.2被检血清与中心孔之间虽不出现沉淀线,但标准阳性血清的沉淀线一端向被检血清孔内侧弯曲,则此孔被检样品判为弱阳性(弱阳性者应重复试验,仍为弱阳性者,判为阳性)
3.3.2.3若被检血清孔与中心孔之间不出现沉淀线,且标准阳性血清沉淀线直向被检血清孔,则被检血清判为阴性。
3.3.2.4被检血清孔与中心抗原之间沉淀线粗而浑浊或标准阳性血清与抗原孔之间的沉淀线交叉并直伸,被检血清孔为非特异反应,应重做,若仍出现非特异反应则判为阴性。
4动物回归试验
4.4.14周龄非免疫健康鸡60只,取0.5mL病料上清液经滴鼻、点眼和擦肛等途径接种,另取5只作为空白对照。
无菌收集3~5d内死亡鸡的法氏囊,-70℃保存。
4.4.2接种后,鸡只出现精神委顿、羽毛蓬乱、食欲减退或废绝、卧地不起、拉白绿水样粪便等外观表现。
剖检发现,法氏囊肿大、弥漫性出血、呈“紫葡萄”状;心肌、骨骼肌出血。
发病率达到100%,5d后的
死亡率高达70%。
5病毒中和试验 可用细胞培养或幼龄鸡进行,比琼脂凝胶沉淀试验检测抗体更敏感,对估价疫苗的免疫应答是有用的。
5.1细胞培养中和试验 在微量滴定板的每孔中,加入0.5ml含100TCID50的病毒稀释液。
被检血清经56℃灭能30min,然后以滴定板上的病毒稀释液将被检血清作连续倍比稀释。
滴定板在室温放30min后,每孔加入0.2ml制备好的鸡胚细胞悬液,置37℃培养4~5天,每天在倒置显微镜观察细胞病变产生的情况,并以不出现细胞病变的最终稀释度的倒数(log2)判定终点。
5.2用鸡用中和试验 将被检血清在56℃灭能30min。
取lml被检血清与lml已知阳性IBD抗原(可用细胞培养毒,lml含200TCID50/0.05ml,或用清亮的10%法氏囊匀浆)合,置37℃孵良30~60min。
将上述混合物滴入7只易感鸡眼内(易感鸡不含有IBD抗 体),每只鸡滴0.5ml,3天后将鸡宰杀,检查其法氏囊有无病变。
同时设立IBD阳性血清和阴性血清作对照。
若被检血清采于非免疫鸡群,其阳性血清和被检血清鸡的法氏囊无病变,而阴性血清对照鸡的法氏囊出现病变时,表明被检血清的鸡已感染IBDV;如果被检血清采于免疫鸡群,出现这种情况,说明IBD疫苗免疫应答较好。
相反,阳性血清鸡的法氏囊无病变,而阴性血清和被检血清鸡的法氏囊出现病变,表明IBD疫苗免疫应答差。
6酶连吸附试验(间接ELSIA)
6.1仪器与试剂
6.1.1仪器
6.1.1.1酶标仪:
具490nm波长滤光片。
6.1.1.296孔酶标板。
6.1.1.3微量加样器:
50/iL、100/iL。
6.1.1.4振荡器。
6.1.1.537℃恒温箱。
6.1.1.6微量离心管:
1.5mL。
6.1.1.7台式离心机。
6.2试剂
6.2.1试剂规格
本标准所用化学试剂除另有特殊规定外,均为分析纯。
试剂配制用水需满足GB/T6682的要求。
6.2.2包被液
碳酸盐缓冲液,0.1mol/L,pH9.6,配制方法见附录C。
6.2.3洗涤液
含有0.05%(体积分数)Tween-20酌磷酸盐缓冲液(PBS-T),0.OImol/L,pH7.4,配制方法见附录C
6.2.4稀释液
含有2.5%(质量浓度)牛血清白蛋白的PBS-T,使用当日配制。
6.2.5封闭液
含5%犊牛血清及0.I%Tween-20的TNE溶液,TNE溶液配制方法见第A.3章。
6.2.6底物溶液
含有0.04%(质量浓度)邻苯二胺及0.1%(体积分数)双氧水的柠檬酸一磷酸盐缓冲液,pH5.0,现
用现配,配制方法见第A.4章。
N/T1554-2005
6.2.7终止液
2mol/L硫酸溶液。
6.3标准抗原、酶标抗体和标准血清
分别为:
——鸡传染性法氏囊病病毒抗原;
——酶标羊抗鸡IgG抗体;
——标准阳性血清;
——标准阴性血清。
6.4被检血清
无菌条件下静脉采血1mL,分离血清,装于无菌小瓶或试管中,加贴标记后置4℃冰箱中保存备检。
6.5操作方法
6.5.1包被抗原
将鸡传染性法氏囊病抗原用包被液稀释到工作浓度,每孔加IOOpL,用塑料薄膜盖住酶标板,37℃
恒温箱中温育th,4℃过夜后备用。
6.5.2封闭
次日甩干包被液,每孔加封闭液200pL,用塑料薄膜盖住酶标板,置37℃恒温箱中温育90min。
甩
干后用洗涤液洗涤3次,甩干。
6.5.3温育
用稀释液将被检血清作100倍稀释,每孔加100/iL,每份血清加两孔,做平行重复试验。
每板的最后一排加标准阳性血清和标准阴性血清各2孔。
置37℃恒温箱中温育1h,甩干后用洗涤液洗涤3次,甩干。
6.5.4加酶标羊抗鸡IgG抗体
将酶标羊抗鸡IgG抗体用封闭液稀释至工作浓度,每孔加100/-tL,置37℃恒温箱中温育1h,甩干
后用洗涤液洗涤3次,甩干。
6.5.5加底物溶液
每孔加新配制的底物溶液IOO/-tL,37℃避先反应10min~15min。
6.5.6加终止液
每孔加入2mol/L硫酸溶液50pL,终止反应。
6.5.7测定OD值
用酶标检测仪于波长490nm处测定各孔的OD值,必须在加入终止液后10min内完成。
6.6结果判定
6.6.1判定前提
当标准阳性血清与标准阴性血清的OD值的比值大于2时,才可进行结果判定。
6.6.2计算P/N值
待检样品的P/N比值按式
(1)计算。
1554-2005
式中:
A-P/N值;
B——待检血清孔平均OD值;
C-标准阴性血清平均OD值。
6.6.3判定
P/N比值大于等于2为阳性;小于1.5为阴性。
1.5≤P/N<2为可疑,可疑样品应重检一次,重检后的P/N比值大于等于1.5判为阳性,小于
1.5判为阴性。
1554-2005
7反转录-聚合酶链反应试验(RT-PCR)
7.1仪器与器材
PCR检测仪,高速台式冷冻离心机(离心速度12000r/min以上),台式离心机(离心速度2000r/min),稳压稳流电泳仪和水平电泳槽,电泳凝胶成像系统(或紫外分析仪),混匀器,冰箱(2℃~8℃和-20℃两种),微量可词移液器(IOtiL、IOOp-L、1000uL)及配套无RNA酶污染带滤芯吸头,Eppendorf管。
7.2试剂
除特别说明以外,本标准所用试剂均为分析纯,一级水、二级水符合GB/T6682规定的要求;本标准所有试剂均用无RNA酶污染的容器(用DEPC水处理后高压灭菌)分装。
a)裂解液:
Trazol
b)三氯甲烷;
c)异丙醇:
-20℃预冷;
d)75%乙醇;
e)DEPC水
f)M-MLV反转录酶:
10U/vL;
g)5×RT缓冲液;
h)RNA酶抑制剂:
40U/ruL;
i)Taq酶:
10U/tLL;
j10×PCR缓冲液(Mg2+full);
k)dNTPs:
含有dATP、dTTP、dCTP、dGTP各10mmol/L;
l)引物
n)电泳缓冲液:
0.5×TBE缓冲液
o)电泳加样缓冲液
7.3操作方法
7.3.1样品总RNA的提取
7.3.1.1取扎个灭菌的1.5mLEppendorf管,其中以为被检样品、阳性对照与阴性对照的和,编号。
每管加入600fiL细胞裂解液,分别加入被检样品、阴性对照、阳性对照各200v-L,每加一份样品换用一个吸头,再各加入200vL三氯甲烷,在混匀器上振荡混匀5s。
于4℃、以12000r/min离心15min。
7.3.1.2.取与5.3.1.1相同数量灭菌的1.5mLEppendorf管,加入500fiL异丙醇(-20℃预冷),做标记。
吸取5.3.1.1各管中的上清液转移至相应的管中,上清液应至少吸取500l_LL(不能吸出中间层),颠例混匀。
7.3.1.3于4℃、以12000r/min离心15min(Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置),小心倒去上清,倒置于吸水纸上,沾干液体(不同样品应在吸水纸不同地方沾干);加入600vL75%乙醇,颠倒洗涤。
7.3.1.4于4℃、以12000r/min离心IOmin(Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置),小心倒去上清,倒置于吸水纸上,尽量沾于液体(不同样品应在吸水纸不同地方沾干)。
7.3.1.5以4000r/min离心10s(Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置),将管壁上的残余液体甩到管底部,小心倒去上清,用微量加样器将其吸干,一份样品换用一个吸头,吸头不要碰到有沉淀一面,室温干燥3min,不能过于干燥,以免RNA不溶。
7.3.1.6加入nvLDEPC水,轻轻混匀,溶解管壁上的RNA,以2000r/min离心5s,冰上保存备用。
提取的RNA应在2h内进行PCR扩增;若需长期保存应放置于-70℃冰箱内。
7.3.2RT-PCR操作程序
7.3.2.1反转录
反应液总量20uL。
依次在RT反应管中加入以下反应物:
a)模板:
提取样品的总RNA5ul;
b)卞游引物P2:
1ul;
c)2×RT缓冲液:
1ul;
d)10mmol/LdNTP:
2ul;
e)RNA酶抑制剂:
1ul;
f)M-MLV反转录酶:
1ul;
g)DEPC水:
6ul。
以4000r/min离心20s,放人PCR仪中,RT条件:
42℃、60min,95℃、5min。
7.3.2.2PCR扩增
PCR反应体系
反转录产物10ul
10×PCR缓冲液5ul
10mmol/LdNTPs1ul
10×氯化镁(25mmol/L)3ul
上游引物p1(20umol/L)1ul
下游引物p2(20umol/L)1ul
Tap酶(5U/Ul)0.5ul
加DEPC水至50ul
以4000r/min离心20s,放人PCR仪中,RT条件:
42℃、60min,95℃、5min。
7.3.2.3反应条件
各种试剂充分混合均匀后,以4000r/min离心30s,放入PCR仪中,设定PCR程序。
反应条件为95℃、5min,95℃、1min,51℃、1min,72℃、1min,35个循环;72℃、10min。
试验检测结束后,根据琼脂糖凝胶电泳来判断试验结果。
7.4结果判定与分析
7.4.11%琼脂糖凝胶的制备
称取lg琼脂糖,加入到100mLO.5×TBE缓冲液中。
加热融化后稍冷却到40℃左右加5pL(10mg/mL)溴化乙锭,混匀后倒入放置在水平台面上的凝胶盘中,胶板厚5mm左右。
依据样品数量选用合适型号的梳子。
待凝胶冷却疑固后拔出梳子(胶中已形成加样孔),放入水平电泳槽中,加1×TBE缓冲液淹没胶面。
7.4.2
取8yL~IOpLPCR扩增产物和2uL加样缓冲液混匀后加入一个加样孔。
每次电泳应加阳性对照和阴性对照的扩增产物。
并且设立DNA标准分子质量Marker作分子质量大小对照。
7.4.3电泳条件
电压80v~iooV,或电流40mA~50mA,电泳时间30min~40min。
7.4.4结果观察和判定
a)在紫外灯下观察核酸条带并判断结果;
b)PCR后阳性对照孔会出现一条701bp的DNA片段,阴性对照没有核酸条带;
c)待测样品电泳后在相应701bpDNA位置上有条带者为法氏囊病毒核酸检测结果阳性;
d)无条带或条带的大小不是701bp的为法氏囊病毒核酸检测结果阴性。
必要时,可取PCR扩增产物进行序列测定,序列结果与已公开发表的法氏囊病毒特异性片段序列进行比对,序列同源性在95%以上,可判定待测样品法氏囊病毒核酸检测结果阳性。
8综合判定
IBD的诊断方法有多种。
依据临床症状和病理变化只可作出初步诊断,确诊应依靠实验室检查。
病毒的分离与鉴定多用于急性病例的确诊,RT-PCR通用于该病病原的快速诊断,特异性强、敏感性高.经过常规检测方法和分子生物学技术检测方法,病料的各项指标均符合传染性法氏囊病和其病毒的特征,证明分离的病毒确实为传染性法氏囊病病毒。
用其进行鸡胚接种传代培养,可引起鸡胚规
律性的死亡,具有高致病率和高死亡率的特点,显示为超强毒株。
IBDV侵害鸡的免疫系统器官法氏囊,造成鸡只的免疫抑制,使鸡对其他细菌病和病毒病的易感性增强,因此被形象地称为“鸡的艾滋病”,给养鸡业造成了严重的损失。
为防制IBD,业内已经开发出了多种弱毒疫苗、中等毒力疫苗及灭活疫苗,并且还在研制和开发活病毒载体疫苗、DNA疫苗及基因工程亚单位疫苗[4]。
然而在生产上预防措施不少,但免疫失败却时有发生,究其原因,也发现有很多不
当之处,比如母源抗体水平参差不齐,或者疫苗选择不当,或者病毒变异,或者疫苗使用方法不当、鸡场消毒不彻底等,这些问题的存在,都有可能造成
免疫失败。
因此,根据鸡场具体情况选择合适的疫苗、制定合理的免疫程序是控制传染性法氏囊病毒病爆发的关键。
附录A
(规范性附录)
试剂的配制
A.1PBS液(0.01mol/LPBS,pH7.2)(用于IFA)
氯化钠(NaCI)8g
氯化钾(KCI)0.2g
碳酸氢钠(NaHCO3)1.15g
磷酸二氢钾(KH2PO4)0.20g
二级水加至1000mL
保存于4℃备用。
A.2无RNA酶溶液的配制
配制溶液所用的三氯甲烷、无水乙醇、异丙醇等应采用未开封的新品,配置溶液所使用的一级水、容器、移液器吸嘴等应无RNA醇蒋染,操作过程中应戴一次性的塑料或乳胶手套,避免人体的RNA酶污染。
A.3
一级水100mL
DEPC100uL
18℃~22℃室温下过夜,121℃、15min灭菌,或直接购买商品化的产品。
A.475%乙醇
DEPC水25mL
无水乙醇75mL
用无水乙醇和DEPC水配制,-20℃预冷。
A.511TBE电泳缓冲液(5x浓缩液)
Tris54.0g
硼酸27.5g
EDTA2.9g
一级水加至1000mL
用5mol/L的盐酸(HCI)调到pH8.0,正式试验时用一级水稀释成工作浓度的0.5×TBE缓冲液。
A.6EB(核酸染色剂)
用一级水配制成10mg/mL的浓缩液,用时每10mL琼脂溶液中加luL。
A.7加样缓冲液
每100mL溶液中含:
溴酚蓝0.25g,蔗糖40g。
A.81%硫柳汞溶液的配制
硫柳汞1g
加蒸馏水至100ml
溶解后,置100ml,瓶中盖塞存放备用。
附录B
(规范性附录)
琼脂板的制备
称量琼脂糖1.0g,加入100ml的PH7.2,0.01mol/LPBS液中在水浴中煮沸充分融化,加入8g氯化钠,充分溶解后加入1%硫柳汞溶液1ml。
制冷至45-50℃时,将洁净干热灭菌直径为90mm的平皿置于平台上,每个平皿加入18-20ml,加盖待凝固后,把平皿倒置以防水分蒸发,放普通冰箱中保存备用(时间不超过2周)
附录C
(规范性附录)
ELISA试剂的配制
C.1包被液:
碳酸盐缓冲液(0.1mol/L、pH9.6)
甲液:
碳酸钠(Na2C03)10.6g
加蒸馏水或去离子水至500mL
乙液:
碳酸氢钠(NaHC03)16.80g
加蒸馏水或去离子水至1000ml
甲液16ml
乙液34ml
加蒸馏水或去离子水至100ml
C.2洗涤液:
含有0.05%(体积分数)Tween-20的磷酸盐缓冲液(0.01mol/L,pH7.4)
磷酸二氢钾(KH2P04)0.20g
磷酸氢二钠(Na2HP04.12H20)2.90g
氯化钠(NaCI)8.00g
氯化钾(KCI)0.20g
吐温20(Tween-20)0.50mL
加蒸馏水或去离子水至1000ml
C.3TNE溶液
氯化钠(NaCI)0.9%
三(羧甲基)三氨基甲烷(Tris)0.05mol/L
乙二胺四乙酸(EDTA)0.001mol/L
C.4底物溶液
甲液:
柠檬酸(C6H807.H20)21.01g
加蒸馏水或去离子水至1000ml
乙液:
磷酸氢二钠(Na2HP04.12H20)71.64g
加蒸馏水或去离子水至1000ml
甲液与乙液按9.70:
10.30的比例混合,即为pH5.O的柠檬酸磷酸盐缓冲液。
底物溶液在临用之前按如下比例配制:
邻苯二胺(OPD)0.040g
30%双氧水O.ImL
pH5.O的柠檬酸一磷酸盐缓冲液lOOmL
。
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