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缓释SHH壳聚糖微球
缓释SHH-壳聚糖微球复合纤维蛋白胶治疗脊髓损伤的实验研究
报告正文
1立项依据与研究内容
(1)项目的立项依据。
(研究意义、国内外研究现状及发展动态分析,需结合科学研究发展趋势来论述科学意义;或结合国民经济和社会发展中迫切需要解决的关键科技问题来论述其应用前景。
附主要参考文献目录)
1)研究的目的及意义
脊髓损伤(spinecordinjury,SCI)是中枢神经系统的严重创伤,不仅对患者本人及家庭产生严重的影响,而且给社会带来沉重的负担[1,2],近年来脊髓损伤发病率呈现逐年增高趋势。
脊髓损伤后,上下神经传导束的断裂、溃变是造成损伤平面以下肢体感觉和运动功能障碍的直接原因。
损伤区继发炎症反应,形成的血栓加重脊髓缺血,而胶质细胞大量增生形成的瘢痕组织阻碍神经纤维的再生,导致神经元和神经纤维的坏死、溃变。
同时,损伤部位抑制因子的高表达是脊髓损伤后神经再生困难的主要因素。
脊髓损伤的治疗一直是研究的热点和难点,随着组织工程技术的发展,带动了生物材料和组织构建技术的快速发展,也给脊髓损伤修复治疗带来了新的希望[3-5]。
脊髓组织工程的基本思路是将体外分离培养的种子细胞种植到具有一定形状结构的三维生物材料支架上,持续培养扩增,构成具有生物活性的细胞-支架复合物,再种植于脊髓损伤部位,桥接修复损伤的组织,恢复其解剖学的结构和功能。
在这个体系中,细胞、支架或生物材料的构建以及材料和细胞间的相互作用是三个主要因素。
目前用于脊髓组织工程的种子细胞主要有神经干细胞、嗅鞘细胞、施旺细胞等[6,7],如果单纯移植细胞治疗时无有效的支撑,周围组织易坍塌,则神经纤维无法充分延伸与周围组织形成突触连接。
生物材料支架的主要作用是引导细胞的生长、增殖、分化、迁移、表型以及凋亡,从而促进脊髓神经的再生[8]。
同时,近来的研究表明[9]在脊髓损伤后给予外源性的生长因子可以促进神经功能的恢复。
神经营养因子还可与其他轴突生长抑制因子,共同起促进轴突生长的补充作用[10]。
然而,在实际应用中生长因子都存在着稳定性差,半衰期短的问题。
随着材料科学和相关学科的快速发展,生长因子和可降解材料复合使局部给药成为可能,将生长因子制备成缓释制剂的研究也越来越深入。
因此,本实验在原有研究基础上,以组织工程“三要素”,即生物活性分子,种子细胞和三维支架的优化组合为切入点,同时利用药物缓释技术,选用音猬因子(Sonichedgehog,SHH)作为细胞分化诱导剂和神经纤维延伸的趋化因子和突触形成因子,制备包封SHH的壳聚糖缓释微球,而后将壳聚糖缓释微球梯度填充于圆柱状纤维蛋白支架中,外胚层间充质干细胞(ectomesenchymalstemcells,EMSCs)为种子细胞,构建一种可缓释SHH,含种子细胞的SHH缓释复合纤维蛋白支架。
为了提高EMSCs修复脊髓损伤的效果,将EMSCs大量扩增后,用神经干细胞培养基将其转化为神经干细胞,而后将细胞种植于载SHH微球的纤维蛋白支架上,体外观察该支架缓释释放的SHH对神经干细胞向成熟神经细胞分化和形成突触的影响。
在体外研究的基础上,将SHH缓释复合纤维蛋白支架移植入大鼠脊髓缺损部位,通过光镜、电镜及免疫组化方法对损伤部位动态观察支架在脊髓内的改建过程,及其对神经再生和突触形成及胶质细胞增生的影响,同时,对各组大鼠后肢在不同时间点进行Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)运动功能评分,从而全面评价SHH缓释复合纤维蛋白支架是否具有优异的缓释修复脊髓损伤的能力并研究SHH诱导支架内EMSCs分化为神经元细胞及神经细胞之间突触形成的作用机制,进而为组织工程支架移植修复脊髓损伤提供新的研究思路和临床应用提供实验依据。
2)国内外研究现状及分析
理想的组织工程支架应该与脊髓具有良好的组织相容性,可被脊髓内的细胞逐渐改建为神经组织,并且该支架在促进神经纤维再生的同时能够有效地抑制胶质瘢痕形成。
目前用于构建组织工程支架的材料主要分为人工合成材料和天然生物材料两大类。
其中,细胞外基质蛋白因具有促进细胞粘附和生长的特性,已被应用于构建生物材料支架和修饰合成材料支架[11]。
纤维蛋白是来源于血液的细胞外基质,作为细胞移植和生长因子缓释系统的载体,用于修复脊髓损伤已取得令人满意的效果[12,13]。
鞠躬[14]用纤维蛋白原溶液将嗅鞘细胞制成细胞悬液注入脊髓横断后的间隙内,结果证明有再生神经纤维穿过间隙,该研究结果为将纤维蛋白原用于修复脊髓损伤提供了新思路。
与一些人工合成材料相比,纤维蛋白原用于构建组织工程支架修复脊髓损伤具有以下优势:
纤维蛋白原可取自于同种血浆,同种移植无排斥反应;纤维蛋白原溶液在血活酶作用下可凝固并交织成多孔的纤维蛋白网状支架有利于支架内外的物质交换,且支架的制作过程简单易行;纤维蛋白分子上含有RGD序列,可促进细胞的黏附、迁移和神经细胞突起的延伸;纤维蛋白是血液中的天然成分,用其构建的组织工程支架在体内具有很好的组织相容性,可逐渐被细胞分泌的蛋白酶降解,同时降解过程中可缓慢释出所交联的活性分子等。
基于上述优势,有理由认为纤维蛋白作为生物材料用于构建修复脊髓损伤的组织工程支架具有良好的应用前景。
外胚层间充质干细胞(Ectomesenchymalstemcells,EMSCs)是干细胞家族的又一重要成员,来源于胚胎时期的神经嵴,保留多向分化潜能[15,16]。
来源于牙髓和牙周组织的EMSCs在体外特定的诱导条件下,可分化为为神经细胞[17],鼻腔粘膜来源的EMSCs能分化为神经细胞和胶质细胞等。
同时,鼻腔粘膜取材方便,量大,对嗅觉无损伤。
此外,EMSCs能产生一系列的细胞因子,表达趋化因子受体,对细胞因子和趋化因子作出反应[18]。
本课题组预实验发现在大鼠鼻腔呼吸粘膜固有层内广泛存在神经外胚层干细胞标志蛋白Nestin和中胚层干细胞标志蛋白CD44表达阳性的EMSCs,能在体外传代和扩增,第五代的EMSCs仍可高表达干细胞标志蛋白[19]。
我们将EMSCs和纤维蛋白胶一起移植入大鼠的脊髓损伤部位,动物后肢运动功能可获得部分恢复[20]。
如何更有效地诱导移植入脊髓损伤部位的EMSCs分化为神经细胞,以替代脊髓损伤丧失的神经细胞细胞,并设法引导神经纤维延伸促进突触的形成,进而实现脊髓组织结构的重建,仍是一个值得进一步研究的内容。
脊髓损伤后给予应用外源性神经生长因子具有促进细胞存活、突触形成、树突成形、神经递质释放至脊髓损伤范围和轴突生长等作用[9,10]。
音猬因子(Sonichedgehog,SHH)是5种刺猬(Hedgehog,HH)因子中的一种。
SHH是以电子游戏角色超音速刺猬命名的,目前研究得较深入的Hedgehog因子。
现有研究表明,SHH通过腹背侧神经管结构的产生、维持神经上皮细胞的存活并促进神经管的形成来实现神经系统的发育、分化过程的具有调控功能[21,22]。
研究证明敲除SHH基因的动物表现为其神经系统腹侧的结构大多缺如,这一实验充分说明在神经系统的发育中,如果SHH信号通路受到破坏将会影响整个中枢神经系统形成背腹两侧分区,导致整个中枢神经系统腹侧表型神经元的完全丧失,而且SHH对轴突的延伸亦有趋化作用,神经管基板分泌的SHH可引导轴突生长锥沿浓度梯度(由低向高)定向生长。
现有研究表明SHH促进神经细胞之间突触形成[23],可促进神经元存活,刺激突起生长,诱导突起寻找靶组织并形成突触[24]。
上述研究报道表明SHH可能是一种新的、有效的神经分化诱导剂和神经纤维延伸的趋化因子和突触形成因子,所以我们认为SHH对于脊髓损伤再生修复作用的值得进一步研究。
但是,如何将SHH与纤维蛋白支架交联是一个关键问题。
SHH为多肽分子,在强酸碱环境、有机溶剂接触等条件下易变性,所以材料的复合、成型工艺可能会使未加保护的SHH部分甚至完全失活,从而减弱其生物学效应。
因此,寻找一种可提高营养因子的缓释性能、保护其生物活性的缓释载体至关重要。
而缓释给药系统不需要频繁给药,能在较长时间内维持体内有效药物浓度,从而可以大大提高药效。
用可降解微球加载药物是一种在局部提供持续药物释放的方法,己经成功的应用于激素[25],疫苗[26]等。
改变可降解材料的成分可控制体内降解时间,以满足不同的需要。
其中,壳聚糖(chitosan,CS)是天然生物大分子甲壳素通过脱乙酰而得到的衍生物。
它不仅具有优良的生物可降解性、生物相容性和生物黏附性[27]。
而且还具有消炎、抗菌、止血及抑制癌细胞转移等大多数聚合物所不具有的功能[28]。
以CS为原料而制备的微胶囊[29,30],日益成为药物控释的新热点,在脊髓损伤再生修复研究领域有必要进行类似探索。
将SHH包封于壳聚糖缓释微球为解决SHH在生物体内降解快,易变性等问题提供了可能。
基于先前的研究基础,我们设想采用壳聚糖微胶囊包封SHH,而后将该胶囊按照浓度梯度填充于纤维蛋白支架中,EMSCs为种子细胞,构建一种可缓释SHH,含种子细胞的SHH缓释复合纤维蛋白支架。
将该支架移植入大鼠脊髓损伤部位,一方面,支架内的SHH浓度梯度可引导脊髓再生神经纤维沿支架隧道内壁向损伤脊髓的远侧端延伸(趋化作用);另一方面,以EMSCs为种子细胞补充脊髓损伤后凋亡、坏死的细胞,同时支架在改建过程中释放的SHH可诱导支架内EMSCs分化为神经元细胞及神经细胞之间突触形成,继而形成神经回路(circuits),可望达到更好地重建脊髓组织结构的效果。
通过本研究全面评价SHH缓释复合纤维蛋白支架是否具有优异的缓释修复脊髓损伤的能力并研究SHH诱导支架内EMSCs分化为神经元细胞及神经细胞之间突触形成的作用机制,进而为该组织工程支架在脊髓损伤修复方面提供新的研究思路和为临床应用提供可能。
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(2)项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键科学问题。
(此部分为重点阐述内容)
1)研究内容
(a)SHH缓释复合纤维蛋白支架的构建
SHH缓释微胶囊的制备及性质研究;
离子凝胶法制备载SHH的CS微胶囊的制备及载药性能,考察药物包封率和载药量的关系,及SHH活性检测。
主要包括研究制备条件和不同囊材对颗粒性能的影响,探索对壳聚糖微胶囊SHH的控缓释作用和SHH药代动力学研究。
②研究SHH微胶囊在纤维蛋白支架中的填充效率,最终筛选、优化出复合SHH微胶囊的纤维蛋白支架的制备方法
③复合SHH微胶囊纤维蛋白支架的种子细胞(EMSCs)的种植。
主要包括EMSCs的获取,神经干细胞培养基诱导和接种。
(b)SHH缓释纤维蛋白支架体外对EMSCs分化为神经元和突起延伸形成突触的影响
将复合SHH微胶囊的纤维蛋白支架制成冰冻切片,将切片贴附于玻璃圆盖片,标记浓度梯度方向后将支架置入神经干细胞培养基(Neurobasal+B27+FBS)中,在支架切片中央接种EMSCs体外培养,电镜观察支架内细胞分化和神经突起延伸及形成突触的情况,通过与不含SHH的纤维蛋白支架支架比较,评价SHH对EMSCs的分化、形成突触的诱导作用及对神经突起沿浓度梯度延伸的趋化作用。
(c)SHH缓释复合纤维蛋白支架促大鼠损伤脊髓再生修复的实验研究
将SHH缓释复合纤维蛋白支架移植入大鼠脊髓横断缺损部位,于移植后不同时间,提取移植部位脊髓组织蛋白,用免疫印迹技术测定神经细胞和神经胶质细胞的相关标志性蛋白和神经再生相关蛋白的相对含量并与对照组比较;部分实验动物用4%多聚甲醛灌注固定后,取出移植部位脊髓组织制成冰冻切片,通过光镜、电镜及免疫组化方法对损伤部位动态观察支架在脊
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- 关 键 词:
- 缓释 SHH 聚糖