超分辨远场生物荧光成像突破光学衍射极限.pdf
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第35卷第9期2008年9月中国激光CHINESEJOURNAL0FLASERSV0135,No9September,2008文章编号:
02587025(2008)09128325超分辨远场生物荧光成像突破光学衍射极限毛峥乐王琛程亚(中国科学院卜海光学精密机械研究所强场激光物理国家重点实验室,上海201800)摘要长期以来。
远场光学荧光显微镜凭借其非接触、无损伤,可探测样品内部等优点,一直是生命科学中最常用的观测j=具。
但由于衍射极限的存在,使传统的宽场光学显微镜横向和纵向的分辨率分别仅约为230am和i000nm。
为了揭示细胞内分子尺度的动态和结构特征,提高光学显微镜分辨率成为生命科学发展的迫切要求,在远场荧光显微镜的基础上,科学家们已经发展出许多实用的提高分辨率甚至超越分辨牢极限的成像技术。
例如,采用横向结构光照明提高横向分辨率到约100nm利用纵向驻波干涉效应将纵向分辨率提高510倍。
然而,直到在光学荧光显微镜中引入非线性效应后。
衍射极限才被真正突破。
如受激荧光损耗显微镜利用非线性效应实现了3050nm的三维分辨率。
另外应用荧光分子之间能量转移共振原理以及单荧光分子定位技术也可以突破衍射极限,甚至可以将分子定位精度提高到几个纳米的量级。
关键词光学;超分辨;远场光学荧光显微镜;生命科学;非线性效应;单分子中图分类号TH74265文献标识码Adoi:
103788CJL200835091283SuperresolutionFar-FieldFluorescenceBio-lmaging:
BreakingtheDiffractionBarrierMaoZhengleWangChenChengYa(StateKeyLaboratoryofHighFieldLaserPhysics,ShanghaiInstituteofOpticsandFineMechanics,ChineseAcademyofSciences,Shanghai201800,China)AbstractFar-fieldopticalfluorescencemicrocopyhasbecomeanessentialtoolinlifescienceforalongtimelargelyowingtOitsuniquecapabilitytOprovidenoninvasive,three-dimensional(3D)imaginginsidecellsHowever,resolutionofatraditionalwide-fieldopticalmicroscopyiSlimitedtOabout230nmlaterallyand1000amaxially。
duetOthediffractionlimitoflightResolutionimprovementisurgentlydemandedbecausemolecule-scaledynamicsandstructuresaretOberevealedinsidelivingcellsintodaySlifescienceSofar。
manyscientistshaveproposedasignificantamountofnovelmethodsinordertOenhanceresolutionoffar-fieldopticalimagingForexample,lateralresolutionofapproximately100nmhasbeenachievedbyuseofstructuredilluminationwhereastheaxialresolutionhasbeenenhanced510一foldusingastandingwaveproducedbytwobeamspropagatinginoppositedirectionsNeverthelessdiffractionbarrierwasnotbrokeninthesecasesuntilnonlinearopticaleffectswereintroducedintoopticalfluorescencemicroscopyAsanexample。
theuseofanonlinearopticaleffect,namely。
simulatedemissiondepletionmicroscopyhasresultedina3Dresolutionof3050nmFurthermorethebarrierofdiffraction-limitcanalsobebrokenbynoveltechnologiesbasedonfluorescenceresonanceenergytransferandhigh-accuracylocalizationoffluorophores,bvwhichmoleculescanbepositionedwithflresolutionofseveralnanometersKeywordsoptics;superres01ution;far-filedopticalfluorescencemicroscopy;nonlinearopticaleffects;singlemolecule收稿日期:
20080307;收到修改稿日期:
20080604作者简介:
毛峥乐(1982一),男,上海人,硕士研究生,主要从事生物荧光成像方面的研究。
导师简介:
程亚(1971一),男,上海人,研究员,博士生导师,长期从事飞秒激光与物质相互作用、飞秒三维生物成像及飞秒三维微加工研究。
Email:
ycheng一45277hotmailcom(通信作者)国激光3j卷1引言11生命科学与光学显微镜毫无疑问。
纳米技术与牛物技术是21世纪发展最迅速和热门的科学领域。
纳米技术应用广泛,包括1100nm尺度内的成像、测量、加工、操纵等。
如冬l1所示T,许多重要的生物体比如葡萄糖、抗体、病毒等都处于这个尺度范围内,研究这些微,卜物体的需求推动了高分辨率显微成像技术的发展。
反过来,超分辨显微术的发展也推动r整个生命科学的进步。
图1自然界微生物尺度Fig1Sizeofmicroorganismsinnature光学最微镜的发展伴随着人类对微观世界探索的历程。
早在公元前一世纪,人们就发现透过水滴可以观察到物体放大的像。
1590年前后,荷兰透镜工匠ZJanssen和他的儿子把透镜组安装在管中,发明了原始的光学显微镜。
在此之后,AntonvanLeeuwenhoek和RHooke对成像原理进行深入的研究,改进和发明了显微镜各部分结构,包括调焦结构、照明系统和载物台。
得到了现代光学显微镜的雏形口。
他们利用光学显微镜做了一系列生物学观察实验,AntonvanLeeuwenhoek第一次观测到细菌以及一滴水中的微生物,1665年RHooke发现细胞,这一里程碑式的发现展示了光学显微镜在生物学领域的巨大潜力。
1873年,德国人EAbbeo。
揭示了远场光学显微镜由于光的衍射效应和有限孔径分辨率存在极限的原理,此后,提高光学显微镜分辨率工作一度停滞不前。
Abbe分辨率极限的数值约为a2n,其中A是光波波长。
托是样品介质的折射率。
若以波长为500nm的光成像,水折射率为133,分辨率极限约为200nm。
12几种非远场荧光光学超分辨技术为了提高分辨率,科学家们发明了许多新颖的超分辨技术。
由Abbe分辨牢极限22n可以知道降低光波波长是提高分辨率最直接有效的方式,采用波长2rim的X射线作为激发光源。
实现了30nm的分辩率m5|。
但低于400nm的光通常会损伤活细胞邸,因此通常情况下X射线显微镜无法应用于活细胞观测。
电子显微镜则利用波粒二相性,以德布罗伊波长为10qnm的电子束照射样品,可以达到01nm的超高分辨率o,被广泛应用于细胞生物学,但由于生物样品无法存活于高真空环境,电子显微镜同样无法应用于活细胞。
原子力显微镜使用一个传感器尖端作为探针,利用尖端的原子与物质表面原子之间的范德华力(VanDerWaalsForce)来呈现样品的表面形貌。
分辨
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