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多肽合成关键技术
多肽化学已经走过了一百近年光辉历程,19,EmilFischer一方面开始关注多肽合成,由于当时在多肽合成方面知识太少,进展也相称缓慢当时合成采用了苯甲酰,乙酰保护,脱去相称困难,并且容易导致肽链断裂。
直到1932年,MaxBergmann等人开始使用苄氧羰基(Z)来保护α-氨基,该保护基可以在催化氢化或氢溴酸条件下定量脱除,多肽合成才开始有了一定发展。
到了20世纪50年代,随着越来越多生物活性多肽发现,大大推动了有机化学家们对多肽合成办法以及保护基研究,因而这一阶段研究成果也非常丰富,人们合成了大量生物活性多肽,涉及催产素(oxytocin),胰岛素等,同步在多肽合成办法以及氨基酸保护基上面也获得了不少成绩,这为日后固相合成办法浮现也提供了实验和理论基本。
也就是这个阶段,FredSanger创造了氨基酸序列测定办法,并为此获得了1958年Nobel化学奖。
还是她日后创造了DNA序列检测办法,并于1980年再次获得了Nobel化学奖,成为到当前为止唯一获得两次Nobel化学奖科学家。
1963年,Merrifield提出了固相多肽合成办法(SPPS),这个在多肽化学上具备里程碑意义合成办法,一出来,就由于其合成以便,迅速,当前已经成为多肽合成首选办法,随后发展也证明了该办法不但仅是一种合成办法,并且也带来了有机合成上一次革命,并成为了一支独立学科,固相有机合成(SPOS)。
固然,Merrifield也因而荣获了1984年Nobel化学奖。
也正是Merrifield,她通过了重复筛选,最后屏弃了苄氧羰基(Z)在固相上使用,一方面将叔丁氧羰基(BOC)用于保护α-氨基并在固相多肽合成上使用,其可以在酸性条件下定量脱除,反映也非常迅速,在30min就可以反映完全。
由于叔丁氧羰基(BOC)办法中,氨基酸侧链保护基团大多基于苄基(Bzl),因而也称为BOC-Bzl方略。
同步,Merrifield在20世纪60年代末创造了第一台全自动多肽合成仪,并初次合成生物蛋白酶,核糖核酸酶(124个氨基酸)。
随后多肽化学研究重要集中在固相合成树脂,多肽缩合试剂,氨基酸保护基研究。
1972,LouCarpino一方面将9-芴甲氧羰基(FMOC)用于保护α-氨基,其在碱性条件下可以迅速脱除,10min就可以反映完全,并且由于其反映条件温和,迅速得到广泛使用,到了20世纪80年代取代了叔丁氧羰基(BOC),成为了固相多肽合成中首选合成办法。
该办法中氨基酸侧链大多基于叔丁基(But),因而,也称为FMOC-But方略。
同步,在多肽合成树脂,缩合试剂以及氨基酸保护,涉及合成环肽氨基酸正交保护上也获得了丰硕成果。
进入21世纪,随着蛋白质组学研究进一步,对于多肽化学规定不但仅是合成办法,而更多集中在多肽标记与修饰办法,以及蛋白构造与功能模仿多肽合成以及长肽或蛋白合成。
∙多肽化学合成基本简介
多肽化学合成办法,涉及液相和固相两种办法。
液相合成办法当前重要采用BOC和Z两种保护办法,当前重要应用在短肽合成,如阿斯巴甜,力肽,催产素等,其相对与固相合成,具备保护基选取多,成本低廉,合成规模容易放大许多长处。
与固相合成比较,液相合成重要缺陷是,合成范畴小,普通都集中在10个氨基酸以内多肽合成,尚有合成中需要对中间体进行提纯,时间长,工作量大。
固相合成办法当前重要采用FMOC和BOC两种办法,它具备合成以便,迅速,容易实现自动化,并且可以比较容易合成到30个氨基酸左右多肽。
1.1.氨基酸保护基
20种常用氨基酸,依照侧链可以分为几类:
脂肪族氨基酸(Ala,Gly,Val,Leu,Ile,),芳香族氨基酸(Phe,Tyr,Trp,His),酰胺或羧基侧链氨基酸(Asp,Glu,Asn,Gln),碱性侧链氨基酸(Lys,Arg),含硫氨基酸(Cys,Met),含醇氨基酸(Ser,Thr),亚氨型基酸(Pro)。
多肽化学合成中氨基酸保护非常核心,直接决定了合成可以成功核心。
由于常用20中氨基酸中有诸多都是带有活性侧链,需要进行保护,普通规定,这些保护基在合成过程中稳定,无副反映,合成结束后可以完全定量脱除。
合成中需要进行保护氨基酸涉及:
Cys,Asp,Glu,His,Lys,Asn,Gln,Arg,Ser,Thr,Trp,Tyr。
需要进行保护基团:
羟基,羧基,巯基,氨基,酰胺基,胍基,吲哚,咪唑等。
其中Trp也可以不保护,由于吲哚性质比较稳定。
固然在特殊状况下,有些氨基酸也可以不保护,象,Asn,Gln,Thr,Tyr。
表1常用3种氨基脱除条件
TFA
HBr/TFA
H2/Pd-C
Piperidine/DMF
Boc
y
y
n
n
Z
n
y
y
n
Fmoc
n
y
n
y
图1常用3种氨基保护基构造
氨基酸侧链保护基团非常多,同一种侧链有各种不同保护基,可以在不同条件下选取性脱除,这点在环肽以及多肽修饰上具备很重要意义。
并且侧链保护基和选取合成办法有密切关系,液相和固相不同样,固相中BOC和FMOC方略也不同样,从某种意义上看,多肽化学就是氨基酸保护基灵活运用与搭配。
关于侧链保护基使用,请参照王德心《固相有机合成——原理及应用指南》第四章,咱们这里重要简介Cys,Lys,Asp几种保护基及其脱除办法。
Cys最常用保护基有三种,Trt,Acm,Mob,这三个保护基可以完毕多对二硫键多肽合成。
Lys最常用保护基有:
Boc,Fmoc,Trt,Dde,Allyl,这对于固相合成环肽提供了诸多正交保护方略。
Asp最常用保护基有:
Otbu,OBzl,OMe,OAll,OFm,同样也提供了各种正交保护方略。
表2巯基常用保护基
简称
构造
脱除条件
Trt
TFA,HCl/HOAc,I2/MeOH
Acm
I2/MeOH,Hg2+
Mob
HF,TFMSA,Hg2+
表3氨基常用保护基
简称
构造
脱除条件
Trt
TFA,HOAc,HCOOH
Boc
HCl/HOAc,TFA/DCM
Fmoc
Pip/DMF,NaOH/MeOH
Dde
H2NNH2/DMF
Allyl
Pd(Ph3P)4,吗啉/THF
表3羧基常用保护基
简称
构造
脱除条件
Otbu
TFA,HOAc,HCOOH
OBzl
H2/Pd,HF,TFMSA
OMe
NaOH/MeOH
OAll
Pd(Ph3P)4,吗啉/THF
OFm
Pip/DMF,DBU/DMF
1.2.多肽缩合试剂
当前多肽合成中,重要采用羧基活化办法来完毕接肽反映,最早使用是将氨基酸活化为酰氯,叠氮,对称酸酐以及混合酸酐办法,但是由于这些条件下,存在氨基酸消旋,以及反映试剂危险以及制备比较复杂,逐渐被日后缩合试剂取代,按照其构造可以分为两种:
缩合试剂重要有:
碳二亚胺型,鎓盐型(Uronium)。
1.2.1.碳二亚胺型
重要涉及:
DCC,DIC,EDC.HCl等。
采用DCC进行反映,由于反映中生成DCU,在DMF中溶解度很小,产生白色沉淀,因此普通不用在固相合成中,但是由于其价格便宜,在液相合成中,可以通过过滤除去,应用依然相称广泛。
EDC.HCl由于其水溶解性特点,在多肽与蛋白连接中使用比较多,并且也相称成功。
但是该类型缩合试剂一种最大缺陷,就是如果单独使用,会有比较多副反映,但是研究表白如果在活化过程中添加HOBt,HOAt等试剂,可以将其副反映控制在很低范畴。
其反映机理如下:
图2 DIC活化反映机理
1.2.2.鎓盐型
鎓盐型缩合试剂反映活性高,速度快,当前使用非常广泛,重要涉及:
HBTU,TBTU,HATU,PyBOP等。
该试剂使用过程中需要添加有机碱,如,二异丙基乙胺(DIEA),N-甲基吗啉(NMM),该试剂加入后,才干活化氨基酸。
其反映机理如下:
图3 TBTU活化反映机理
1.3.多肽合成办法比较
1.3.1.液相多肽合成(solutionphasesynthesis)
液相多肽合成当前依然广泛使用,在合成短肽和多肽片段上具备合成规模大,合成成本低明显长处,并且由于是在均相中进行反映,可以选取反映条件更加丰富,象某些催化氢化,碱性水解等条件,都可以使用,这在固相中,使用却由于反映效率低,以及副反映等因素,无法应用。
液相多肽合成中重要采用BOC和Z两种反映方略。
图4液相合成Glu-Trp
1.3.2.固相多肽合成
图5 FMOC固相合成Glu-Trp
固相多肽合成当前使用重要有两种方略:
BOC和FMOC两种。
BOC办法合成过程中,需要重复使用TFA脱BOC,并且在最后从树脂上切割下来需要使用HF,由于HF必要使用专门仪器进行操作,并且切割过程中容易产生副反映,因而当前使用受到实验条件限制,使用也逐渐减少。
FMOC办法反映条件温和,在普通实验条件下就可以进行合成,因而,也得到了非常广泛应用。
1.3.2.1.固相合成中惯用树脂
固相合成中树脂,普通都是聚苯乙烯-二乙烯苯材料,大小在75-150μm,交联度在1-2%之间,当前使用大多是1%,由于这种交联度下,树脂在DMF,DCM中具备较好溶胀性能,立体上是一种空间网状构造,反映物分子可以在树脂内部自由移动。
树脂中最核心某些是连接手臂,它一端连接在树脂上,一端作为反映位点。
当前广泛使用树脂有:
PAM,MBHA,Wang,2-Cl-Trt,Rink-Amide-MBHA等。
其中PAM,MBHA是用在BOC方略中,由于其对酸非常稳定,需要在HF,TFMSA等强酸条件下才可以切割下来。
图6 固相合成惯用树脂
1.3.2.2.茚三酮检测
固相多肽合成中,重要是通过检测树脂上游离氨基来判断连接效率,检测办法称为Kaiser办法,其检测成果,如果有游离氨基时候,显示兰色,或红褐色(pro,ser,His)。
Kaiser试剂涉及:
A,6%茚三酮乙醇溶液
B,80%苯酚乙醇溶液
C,2%0.001MKCN吡啶溶液
配制中吡啶需要通过茚三酮解决后,重蒸后再使用。
检测过程,取少量树脂,加入A,B,C各2-3滴,100℃下加热1-2min,如果溶液有兰色,或树脂浮现兰色,红褐色,表白尚有游离氨基,否则阐明连接完全。
尚有其他检测游离氨基办法:
三硝基苯磺酸法,苦味酸法,溴芬兰法等。
图7茚三酮检测原理
1.3.2.3.固相合成切割办法
固相合成完毕之后,必要选取适当切割试剂将多肽从树脂上切割下来,然后通过冰乙醚沉淀,离心收集沉淀,通过HPLC分离纯化,冷冻干燥得到最后产品。
由于选取树脂不同,氨基酸序列不同,在切割时候,选取切割办法也不完全相似,普通都是选取酸性条件下切割条件,对于PAM,MBHA树脂,普通采用HF切割,切割过程中需要添加对甲苯酚,对巯基苯酚,苯甲醚等试剂。
而对于Wang,Rink-Amide,Trt树脂,普通采用TFA切割,切割过程中加入,乙二硫醇,苯甲硫醚,水,三异丙基硅烷,苯酚等。
这些添加试剂重要作为碳正离子俘获试剂使用,目是俘获切割反映过程中生成碳正离子,减少这些碳正离子对某些氨基酸侧链攻打导致副反映,比较容易产生副反映氨基酸有:
Trp,Tyr。
切割试剂用量普通10-15ml/g树脂。
惯用切割配比:
HF/p-cresol/p-thiocresol(90/5/5),TFA/TIS/EDT/H2O(94/1/2.5/2.5),反映普通是在室温条件下2h-4h。
1.3.3.多肽合成中重要问题
1.3.3.1.消旋及其反映机理
多肽合成过程中,某些氨基酸在活化过程中会导致不同限度消旋,特别容易消旋氨基酸有:
Cys,His,Phe,固然这些消旋化还和溶剂,温度以及合成中有机碱等因素关于。
对于这些氨基酸,可以通过采用高效缩合试剂,减少反映时间,可以减少消旋比例,普通条件选取恰当,消旋化都可以控制在5%以内。
消旋反映机理如下:
图8消旋反映机理
1.3.3.2.二酮哌嗪(DKP)反映
DKP副反映出当前FMOC-Wang树脂合成过程中,重要出当前第一种氨基酸为Pro时候,当第二个氨基酸脱FMOC时候,α-氨基被游离出来之后,及时对Wang树脂苄酯键进行分子内胺解,生成六元环二酮哌嗪衍生物,同步从Wang树脂上释放出来,导致反映终结。
该反映非常迅速,文献报道采用50%Pip/DMF,脱1min,4min条件,但是咱们实验证明在多数状况下,虽然是1min左右反映就超过了20%。
因而普通在末端第一种氨基酸为Pro时候,建议采用2-Cl-Trt树脂合成,由于该树脂巨大空间阻力,可以完全消除该副反映。
这个副反映在BOC方略合成过程中,却可以完全避免,由于BOC在使用TFA脱除后,使氨基以TFA盐形式存在,从而失去了亲核性,不能攻打苄酯键。
图9 DKP反映机理
1.3.3.3.困难序列多肽合成
固相多肽合成中也经常遇到多肽合成失败或合成效率很低问题,这里面重要因素是由于多肽序列引起,由于有些多肽序列在树脂上形成β-折叠,变化了树脂溶胀性能,尚有也许将反映活性位点埋藏在树脂里面,这样使得反映很难进行,当前报道使用重要办法有:
∙使用混合溶剂,DMSO/DMF,6N胍啶/DMF溶液
∙提高反映温度,或采用微波办法
∙使用高离液盐,LiCl,NaClO4等。
∙使用溶胀性能更好PEG-PS树脂,同步减少树脂担载量(0.05-0.2mmol/g)
1.4.合成多肽分析鉴定办法
多肽分析鉴定办法有多肽一级构造,二级构造鉴定,多肽一级构造涉及:
质谱分析,氨基酸构成分析,氨基酸序列分析。
二级构造涉及:
圆二色谱(CD),NMR,X-衍射等办法。
1.4.1.纯度分析
多肽纯度分析,普通都采用HPLC进行分析,选取RP-C18,粒径5μm,孔径300A,4.6×150mm,流动相:
A,0.1%TFA/H2O;B,0.1%TFA/ACN,洗脱梯度,5%B--65%B,时间30min。
也有些多肽,特别是短肽,由于亲水性强,在C18上保存很弱,需要变化条件,这里重要有两种办法:
一种变化分析梯度,可以将起始梯度改为2%,等度或小梯度洗脱;此外一种办法是在流动相中加入强离子对试剂,如七氟丁酸,十八烷基磺酸钠等。
1.4.2.一级构造分析
1.4.2.1.质谱分析
质谱分析目重要是确证分子量,固然采用MS/MS可以某些理解多肽序列信息,但是这个需要比较全数据库作为基本,分析才干比较精确。
由于多肽性质不稳定,需要采用软电离技术,当前多肽分析重要使用了电喷雾(ESI-MS),基质辅助激光解吸(MALDI-MS)。
其中ESI-MS普通会给出多电荷峰,电荷数目和多肽序列上氨基,胍基,咪唑基数目关于,因而,经常给出了双电荷,三电荷等离子峰。
MALDI-MS可以分析蛋白大分子,并且普通状况下很少带多电荷,因而数据直接相应了分子离子峰,容易分析。
此外,普通在分析长肽或蛋白过程中,需要添加NH4,Na,K等离子,提高敏捷度,因此普通在MS中浮现一组峰,分别相应:
(M+H)+,(M+NH4)+,(M+Na)+,(M+K)+。
1.4.2.2.氨基酸构成分析
氨基酸构成分析普通需要产品纯度较高,它可以给出多肽中氨基酸种类,数目。
分析过程一方面通过酸水解破坏肽键,典型酸水解条件是:
真空条件下,110℃,用6M盐酸水解16至72小时。
酸水解虽然很有用,但酸水解条件下不能获得完整氨基酸分析,由于天冬酰胺和谷氨酰胺侧链具有酰胺键,用于切断蛋白质肽键酸也可以将天冬酰胺转换为天冬氨酸,谷氨酰胺转换为谷氨酸。
由于水解温度比较高,色氨酸吲哚环容易被空气氧化,虽然在密封管中,色氨酸吲哚环也几乎都被破坏了。
因而蛋白质色氨酸含量往往是通过它紫外吸取光谱预计,也可以通过碱水解分析色氨酸含量。
半胱氨酸在酸水解中也不能精准测定,要精准测量需要在蛋白质水解之迈进行氧化或羧甲基化,形成衍生物在酸水解之后才干定量。
1.4.2.3.氨基酸序列分析
氨基酸序列分析基本原理是Edman降解,重要涉及耦联、水解、萃取和转换等4个过程。
一方面使用苯异硫氰酸酯(PITC)在pH9.0碱性条件下对蛋白质或多肽进行解决,PITC与肽链N-端氨基酸残基反映,形成苯氨基硫甲酰(PTC)衍生物,即PTC-肽。
然后PTC-肽用三氟乙酸解决,N-端氨基酸残基肽键被有选取地切断,释放出该氨基酸残基噻唑啉酮苯胺衍生物。
接下来将该衍生物用有机溶剂(例如氯丁烷)从反映液中萃取出来,而去掉了一种N-端氨基酸残基肽仍留在溶液中。
萃取出来噻唑啉酮苯胺衍生物不稳定,经酸作用,再进一步环化,形成一种稳定苯乙内酰硫脲(PTH)衍生物,即PTH-氨基酸。
留在溶液中减少了一种氨基酸残基肽再重复进行上述反映过程,整个测序过程当前都是通过测序仪自动进行。
1.4.3.二级构造分析
1.4.3.1.圆二色谱(CD)
圆二色谱是一种特殊吸取谱,它通过测量蛋白质等生物大分子圆二色光谱,从而得到生物大分子二级构造,简朴、快捷,广泛应用在蛋白质折叠,蛋白质构象研究,酶动力学等领域。
圆二色谱紫外区段(190-240nm),重要生色团是肽链,这一波长范畴CD谱包括了生物大分子主链构象信息。
α-螺旋构象CD谱在222nm、208nm处呈负峰,在190nm附近有一正峰。
β-折叠构象CD谱,在217-218nm处有一负峰,在195-198nm处有一强正峰。
无规则卷曲构象CD谱在198nm附近有一负峰,在220nm附近有一小而宽正峰。
1.4.3.2.核磁共振(NMR)
随着二维、三维以及四维NMR应用,分子生物学、计算机解决技术发展,使NMR逐渐成为大分子构造物质分析重要办法之一。
NMR可用于拟定氨基酸序列、分布以及构象。
当前,NMR在分析分子中含少于30个氨基酸小肽时是非常有用,分析成果迅速精确。
1.4.3.3.X-衍射
X-衍射可获得关于化合物晶型直接信息,并且可以判断相对与绝对构型。
∙多肽标记及修饰
当前多肽标记及修饰内容非常多,广泛应用在多肽药物,多肽生物学,多肽抗体以及多肽试剂研究中。
当前应用广泛有:
非放射性核素标记(C13,H2),荧光标记(FAM,FITC),生物素标记,磷酸化修饰等。
2.1.非放射性核素标记
当前在非放射性核素标记中,使用广泛依然是C13,H2,由于其使用安全,放射性小。
当前有比较完全非放射性标记氨基酸,可以按照正常多肽合成办法将标记好氨基酸直接连接到多肽上。
2.2.荧光标记
荧光标记由于没有放射性,实验操作简朴。
因而,当前在生物学研究中荧光标记应用非常广泛,荧光标记办法与荧光试剂构造关于系,对于有游离羧基采用办法与接肽反映相似,也采用HBTU/HOBt/DIEA办法连接。
但是对于FITC标记,需要在连接FITC前,增长一种氨基己酸,避免在切割过程中被TFA切割掉。
2.3.生物素标记
生物素-亲合素系统(biotin-avidinsystem,BAS),是70年代后期应用于免疫学,并得到迅速发展一种新型生物反映放大系统。
由于它具备生物素与亲合素之间高度亲和力及多级放大效应,并与荧光素、酶、同位素等免疫标记技术有机地结合,使各种示踪免疫分析特异性和敏捷度进一步提高。
重要有用于标记多肽氨基生物素N-羟基丁二酰亚胺酯(BNHS)和生物素对硝基酚酯(pBNP),其中以BNHS最惯用,固然,也可以直接使用生物素也可以标记,由于其构造上有个游离羧基,采用HBTU/HOBt/DIEA办法缩合,由于生物素溶解度低,使用DMSO/DMF混合溶剂增长溶解度。
2.4.磷酸肽合成
磷酸肽在生命过程中发挥重要作用,磷酸化位置在多肽上Ser,Thr,Tyr。
当前磷酸肽合成普通都采用磷酸化氨基酸,当前使用都是单苄基磷酸化氨基酸,Tyr也可以直接使用磷酸化氨基酸。
磷酸化氨基酸连接普通采用HBTU/HOBt/DIEA办法,但是当前采用该办法合成磷酸化也有缺陷,特别是在合成多磷酸化多肽或长肽时候,连接效率低,最后产品纯度很低,对于这种磷酸化多肽,咱们考虑采用后磷酸化办法,其合成过程就是在多肽合成结束后,选取性脱去要标记氨基酸侧链保护基,对于Tyr,Thr可以直接使用侧链不保护氨基酸进行反映,而Ser可以采用Fmoc-Ser(trt),在1%TFA/DCM条件下可以定量脱除。
后磷酸化,采用双苄基亚磷酰胺,四氮唑生成亚磷酰胺四唑活性中间体,连接到羟基上,随后在过氧酸下氧化生成磷酰基,完毕反映。
∙蛋白构造与功能模仿多肽
多肽在与蛋白受体结合发挥功能时候,总是先折叠出某些特殊构造,多肽类似物合成重要是为了模仿这些构造,保持或提高生物活性,同步也为了变化多肽稳定性,提高其抗酶解能力。
3.1.α-螺旋多肽
α-螺旋是蛋白构造中最为普通一种,但是普通多肽在溶液中大多是无规卷曲,当前使用最多办法是多肽保持α-螺旋构造就是在多肽表面通过共价键将处在α-螺旋构造两个氨基酸连接起来,选取位点(i,i+4或i,i+7),选取化学键涉及:
二硫键,硫醚键,酰胺键,烯烃键(RCM)等办法。
3.1.1.二硫键
二硫键广泛存在与蛋白构造中,对稳定蛋白构造具备非常重要意义,二硫键普通是通过序列中2个Cys巯基,经氧化形成。
形成二硫键办法诸多:
空气氧化法,DMSO氧化法,过氧化氢氧化法等。
二硫键合成过程,可以通过Ellman检测以及HPLC检测办法对其反映进程进行监测。
3.1.2.硫醚键
硫醚键形成可以通过序列中Lys,将溴乙酸连接到Lys侧链氨基上,运用其和巯基特异性反映,反映在缓冲溶液中进行,迅速高效。
3.1.3.酰胺键
多肽内酰胺环肽合成普通是运用Lys,Asp(Glu)选取性保护,在固相上直接环化。
BOC方略中可以采用BOC-Lys(Fmoc),BOC-Asp(OFm),FMOC方略中可以采用FMOC-Lys(Aloc),FMOC-Asp(Allyl)。
对于首尾环肽,还可以先合成保护多肽,然后在液相中环化生成目的多肽。
3.1.4.烯烃键(RCM)
RCM反映是一种过渡金属催化反映,其反映中使用催化剂:
(Cy3P)2Cl2Ru=CHPh,可以催化烯烃环化,过程中脱去一分子乙烯。
图10 固相RCM反映
该反映也可以在固相树脂上直接环化,反映条件:
15-25%(Cy3P)2Cl2Ru=CHPhDCM,60-80℃,24-48h。
3.2.TASP(template-assembledsyntheticpeptide)多肽
瑞士Basel大学化学家初次提出TASP概念,她们运用品有“发夹”构造肽链作为模板,然后将具备α-螺旋构造多肽直接连接到模板上,模仿蛋白质高档构造。
3.3.长肽或蛋白合成
3.3.1.FMOC-tbu片段缩合办法
FMOC-tbu片段缩合办法在合成长肽以及蛋白上面运用非常广泛,其合成过程一方面是合成保护性肽片段,通过纯化后,将几种片段在液相或固相上组装起来。
使用本办法重要注意几种方面:
片段选取,片段合成与纯化,片段缩合办法。
片段选取要考虑到片段连接反映时间长,容易导致消旋,故片段C末端最佳选取Gly,Pro。
合成片段普通需要通过C4,C8等纯化,对于溶解性很差多肽,可以采用硅胶柱层析办法进行纯化。
由于片段分子大,在树脂内移动速度慢,故反映时间普通都很长,并且反映过程中与片段浓度关系很大,溶解时候,尽量提高片段浓度。
对各种条件选取,发现采用DMF为溶剂,DIC/HOBt办法缩合效率最高,消旋也最小。
图11FMOC-tbu片段缩合示意图
3.3.2.自然化学连接(NativeChemicalLigation)
自然化学连接办法长处是可以采用完全脱保护多肽,因而不存在溶解性问题,其反映也是在缓冲水溶液中进行,由于其运用是巯基和硫酯特异性反映,再通过由S到N转变完毕肽键合成。
图13自然化学连接
总之,此
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