恩诺沙星胶体金免疫层析试纸条的技术报告.docx
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恩诺沙星胶体金免疫层析试纸条的技术报告
恩诺沙星胶体金免疫层析试纸条的技术报告
1.1胶体金的制备
1.1玻璃器皿的准备
玻璃器皿表面的少量污染会干扰金颗粒的生成,一切玻璃容器应绝对清洁,用前经过酸洗,硅化。
硅化过程一般是将玻璃容器浸泡于含5%二氯二甲硅烷的氯仿溶液中1min,室温干燥后蒸馏水冲洗,再干燥备用。
专用的玻璃器皿以第一次生成的胶体金稳定其表面,弃去后以双蒸馏水淋洗,可代替硅化处理。
将玻璃器皿用酸液浸泡72小时后,取出,大量自来水冲洗,洗洁精洗涤,蒸馏水浸泡24h后用去离子水冲洗三次,37℃温箱烘干后备用。
1.2柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液
在胶体金免疫层析试验中,检测信号是由于金颗粒在检测线或质控线上聚集而成,所以如果金颗粒太小就不能产生足够的颜色信号,如果太大又会遇到空间位阻问题。
空间位阻可以阻止小分子蛋白质接近金颗粒的zeta电位,例如IgG分子(160000Daltons)大约8nm,约有4nm可以与金颗粒的表面结合,其最适的标记金颗粒为40nm,而对小分子抗原来说,可以使用20nm的胶体金颗粒进行标记[67]。
本实验中直接制备20nm胶体金用于ENR抗体的标记,结果比较理想。
取0.01%氯金酸水溶液100ml用恒温电磁搅拌器加热至沸腾,持续搅拌的情况下加入1%柠檬酸三钠水溶液1ml,继续搅拌加热20min,溶液呈透亮的红色。
室温冷却,用去离子水恢复到原体积,4℃保存。
1.3.胶体金的质量鉴定
1.3.1肉眼观察
用肉眼观察制备的胶体金,其颜色为酒红色、均匀度较好无杂质、透明度较高。
1.3.2紫外扫描鉴定
取冷却后的胶体金溶液进行400~600nm紫外扫描,确定最大吸收峰波长,观察最大吸收峰的峰形、峰宽。
胶体金溶液400~600nm的紫外扫描图谱见图1。
图1胶体金溶液400~600nm紫外扫描图谱
1.1.3.3透射电镜鉴定
透射电镜下观察胶体金颗粒的大小是否均匀一致,有无椭圆形及多角形。
拍片放大后测量胶体金颗粒直径大小,取多个点计算胶体金颗粒的平均直径。
胶体金颗粒的透射电镜扫描图片见图2。
图2胶体金电镜扫描图片(电压:
40.0kV,放大倍数:
40.0k)
在透射电镜下观察到胶体金颗粒的大小基本一致,没有椭圆形、多角形的金颗粒。
将照片扫描后转换成电子版图片,放大后测量胶体金颗粒直径大小。
随机挑选10个胶体金颗粒通过计算得到金颗粒平均直径为23.5±0.5nm,与紫外扫描鉴定法得到的颗粒直径接近。
2抗体制备
取健康经产Balb/c母鼠或雄鼠,每只注射1ml灭菌石蜡油,15天后注射1ml杂交瘤细胞细胞(含1×103细胞),约7~10天后采集腹水。
每只小鼠可采腹水约2~3ml。
离心去脂肪层和细胞层后,用硫酸铵纯化后分装冻存。
腹水单抗的制备 给Balb/c小鼠腹腔注射灭菌液体石蜡2.5mL/只,7~14天后同途径接种经克隆化培养后的杂交瘤细胞0.5mL/(1×103~2×103个),经10天左右抽取腹水,离心去除油脂和沉淀后,即为小鼠腹水单抗。
单抗效价测定将腹水或细胞上清倍比稀释后,按间接ELISA操作流程进行测定。
主要操作如下:
用包被缓冲液将包被用抗原OVA-ENR稀释至适当的工作浓度,每微孔加100μl,4℃过夜,弃去孔内的液体。
每孔加封闭液200μl,37℃水浴保持2小时后用洗涤缓冲液洗3次,将腹水或细胞上清倍比稀释后按顺序加入,每孔100μl,每块板同时设空白对照、阴性对照和阳性对照各2孔。
37℃水浴1小时,每孔加适当浓度的酶标二抗100ul,置37℃水浴1小时。
每孔加新鲜配置的TMB底物液100μl,37℃水浴10~30分钟。
每孔加终止液50μl。
以待测孔光密度值(OD值)大于或等于阴性对照孔的2.1倍判为阳性。
以判为阳性的最高稀释倍数为效价判定终点效价。
重复3次,计算平均值。
交叉反应试验 将ENR和其结构类似物环丙沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、洛美沙星偶联载体BSA、OVA倍比稀释,每个浓度分别取100ul与100ul工作浓度的腹水在37℃水浴反应1小时,再加入到包被封闭好的酶标板微孔内反应1小时。
然后按间接ELISA操作流程加单抗及HRP-羊抗鼠IgG,测定OD450值,并计算交叉反应率,即Y=S/Z×100%,其中S表示恩诺沙星与50%抗体结合时的浓度,Z表示类似物与50%抗体结合时的浓度。
对恩诺沙星的检测灵敏度测定:
方法同交叉反应试验,将不同浓度(0ppb-100ppb)的恩诺沙星作为标准品代替类似物进行试验,最后测定OD450值,并计算抑制率(N-P)/N值(N为零标准品OD值,P为其它标准品OD值)。
用抑制率作纵坐标,标准品浓度的对数值作横坐标绘制标准曲线。
测定10个零标准管,求出光密度值的平均数X,再减去2倍标准差,从标准曲线上查出对应于光密度值为X-2SD的浓度,即为灵敏度。
3胶体金标记抗体蛋白
胶体金标记蛋白实质上是抗体蛋白等生物大分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。
吸附机理可能是胶体金颗粒表面带负电荷,与蛋白质分子的正电荷之间靠静电力相互吸引,达到范德华引力范围内即形成牢固的结合。
胶体金颗粒的粗糙表面也是利于形成吸附的重要条件。
由于结合过程主要是物理吸附作用,并不影响蛋白质的生物活性。
由于盐类成分能影响金颗粒对蛋白质的吸附,并可使金颗粒聚沉,故标记前应先用低离子浓度的水透析,以除去多余的盐。
胶体金对蛋白质的吸附主要取决于pH值,在接近蛋白质的等电点或略偏碱的条件下,二者容易形成牢固的结合物。
3.1抗体蛋白的处理
将待标记的抗体蛋白溶液用0.002mol/L的NaCl(pH7.0)4℃透析过夜,除去多余的盐离子,40000g4℃离心1h,除去聚合物。
3.2胶体金溶液的准备
用0.1mol/LK2CO3或0.1mol/LHCl调节胶体金溶液的pH值为6.0。
由于金颗粒容易吸附于电极上使之堵塞,故不能用pH计测定金溶液的pH值,一般使用精密pH试纸。
3.3稳定胶体金最适抗体蛋白用量的选择
3.3.1分光光度计测定法
将经过高速离心处理后的抗体用2mmol/L硼酸缓冲液(pH9.0)稀释至0.5mg/ml。
稀释后抗体和其他试剂按表1逐项操作。
表1最适蛋白用量分光光度计测定法步骤
试剂
试验管
对照管
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
1
抗体(µg)
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
H2O100µl
胶体金(ml)
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
摇匀,静置5min
10%NaCl(µl)
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
0
摇匀,静置5min后,测定520nm处OD值
以OD值为纵坐标,抗体蛋白用量为横坐标做一曲线,取曲线与横坐标接近那一点的抗体蛋白用量即为稳定胶体金的最小蛋白用量。
在此基础上再加10%~20%即为稳定胶体金的抗体蛋白实际用量。
结果见图3。
图3最适蛋白用量分光光度计测定法
由图可知,当每1ml胶体金溶液中单抗添加量等于或大于28µg/ml时,胶体金蛋白结合物的光密度值不再发生较大的变化,趋于平稳,说明胶体金颗粒对抗体蛋白的吸附基本达到饱和,稳定胶体金的最小蛋白用量为每1ml金溶液中添加28µg抗体蛋白,在此基础上再增加10~20%即为待标记抗体蛋白的实际用量。
最终确定实际蛋白用量为每1ml胶体金溶液中添加33.6µg抗体蛋白。
3.3.2目测法
具体步骤:
(1)0.1mol/LK2CO3或0.1mol/LHCl调节胶体金溶液pH为6.0。
(2)将pH6.0的胶体金溶液分装10管,每管1ml。
(3)待标记的抗体蛋白溶液用0.004mol/L,pH9.0硼酸盐缓冲液作系列稀释为5~100µg/ml,分别取1ml加入对应管的胶体金溶液中。
对照管加1ml稀释液(不含抗体蛋白),混匀。
(4)静置10min后,在上述各管中加入0.1ml10%NaCl溶液,混匀后静置2h,观察结果。
表2目测法确定稳定胶体金最适蛋白用量
管号
对照管
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
蛋白添加量(µg)
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
终颜色
蓝
蓝
蓝
蓝
浅蓝
红
红
红
红
红
红
结果见表2。
由表可知,未加抗体蛋白(对照管)和加入抗体蛋白的量不足以稳定胶体金的1~4管,呈现由红变蓝的聚沉现象;而加入抗体蛋白量达到或超过稳定胶体金的最小蛋白用量的5~10管保持红色不变。
其中含抗体蛋白量最低的5号试管即含稳定1ml胶体金所需的最小蛋白用量。
在此基础上再增加10~20%即为待标记抗体蛋白的实际用量,即稳定胶体金的实际蛋白用量为每1ml胶体金溶液中添加33.6µg抗体蛋白。
3.3胶体金标记抗体蛋白具体步骤:
3.3.10.1mol/LK2CO3调节胶体金溶液pH6.0。
3.3.2将10ml胶体金溶液中加入50ml烧杯中,电磁搅拌器250rpm搅拌,逐滴加入1ml含0.32µg抗体蛋白的蛋白溶液。
3.3.3逐滴加入3ml5%BSA,持续搅拌10min。
3.4金标抗体的纯化超速离心法步骤:
3.4.1金标抗体溶液常温低速(1500rpm)离心20min,弃去由凝聚的金颗粒形成的沉淀。
红色上清溶液4℃,11000rpm离心40min。
3.4.2溶液分为三层,透明上清,管底可流动的暗红色沉淀及管底壁上黑色致密的金颗粒层。
将可流动的暗红色沉淀转移到另外一个离心管中,用含1%BSA的0.01mol/LPB混悬至原量。
3.4.3平衡过夜,同上重复离心2次。
3.4.4最后用1%BSA的0.01mol/LPB(含0.02%NaN3)将沉淀混悬为原体积的1/40,4℃保存。
3.5金标抗体的质量鉴定
将羊抗鼠二抗点样于NC膜上,直接与金标ENR单抗作用,可见有明显的粉红色斑点,表明金标抗体有活性。
4包被抗原的合成
用于胶体金免疫层析试验的抗原和抗体必须有足够的敏感行、特异性和反应结合位点,能够和膜材料结合并与待测样品发生特异性反应。
本实验中共合成了3种包被抗原,在ELISA反应中都能和单抗发生特异性反应,但将3种抗原包被到NC膜上后,只有方法1包被抗原能与胶体金标记的单抗发生良好的显色反应。
这可能涉及到不同方法合成的包被抗原和NC膜的结合能力不同,同金标抗体的特异性结合反应也有差异,最后导致显色结果的不同。
4.1包被抗原B的合成
4.1.115mg恩诺沙星用1ml二甲基甲酰溶解。
冷却至10度,加40ul氯甲酸异丁酯,10度搅拌反应30分钟。
4.1.2100mgOVA用2ml50mmol/LNa2CO2溶解。
4.1.310度反应4小时(必要时加NaOH,维持溶液的PH为9.0),然后4度过夜。
4.1.4用0.02M的PBS透析三天,每8小时换一次液。
得包被原1。
4.2包被抗原B的合成
4.2.130mg恩诺沙星用1ml二甲基甲酰溶解。
冷却至10度,加40ul氯甲酸异丁酯,10度搅拌反应30分钟。
4.2.2120mgHSA用2ml50mmol/LNa2CO2溶解。
4.2.310度反应4小时(必要时加NaOH,维持溶液的PH为9.0),然后4度过夜。
4.2.4用0.02M的PBS透析三天,每8小时换一次液。
得包被原2。
4.3包被抗原C的合成
4.3.1取EDC100mg,用pH8.0的10mmol/LPBS液1.5mL使之充分溶解(Ⅰ液)。
4.3.2取恩诺沙星40mg,用0.2mol/LNaOH溶液2ml溶液溶解(Ⅱ液)。
4.3.3取HSA100mg,溶于3ml10mmol/LPBS(PH8.0)液中(Ⅲ液)。
4.3.4将Ⅱ液与Ⅲ液混合,在磁力搅拌下逐滴加入Ⅰ液(余下0.5ml)。
4.3.5室温下避光搅拌1小时,逐滴加入余下的Ⅰ液。
4.3.64度搅拌12小时。
4.3.7静置10小时(4度)。
4.3.8用蒸馏水使之充分透析(约48小时),得包被原3。
4.4抗原的筛选
将三种包被抗原分别稀释到0.5mg/ml,再分别作1:
5、1:
10、1:
20、1:
40、1:
80、1:
160稀释,在NC膜上点样,37℃温箱中干燥后,直接浸泡于金标抗体溶液中,观察不同抗原点样点的显色情况。
包被抗原A的点样显色非常浅,肉眼几乎无法分辨,包被抗原C最高稀释倍数为1:
20,而包被抗原B的最高稀释倍数可达到1:
80,故选择包被抗原B用于试纸条的组装。
5抗原包被各种溶液的筛选
5.1抗原包被液和包被条件的选择
分别用A、B、C、D、E五种不同配方的包被液将包被抗原作1:
20,1:
40,1:
80,1:
160稀释,在NC膜上点样后37℃15min烘干,用封闭液封闭后,滴加6×稀释的纯化后金标抗体,反应10min后,洗涤液洗涤,观察显色情况。
判断标准:
+++表示着色很深;
++表示着色较深;
+表示着色淡;
—表示没有着色。
表3包被液筛选结果
包被液
A
B
C
D
E
1:
20
+++
+++
++
++
+++
1:
40
++
++
++
++
++
1:
80
++
+
-
+
+
1:
160
+
-
-
-
++
由表可知,包被液A在1:
80提取后,NC膜上点样着色照样很深,而其他包被液在1:
80提取后,颜色很淡或不显色,故选择包被液E作为实际用包被稀释液。
用包被液A将包被抗原作1:
20,1:
40,1:
80,1:
160,1:
320稀释,在NC膜上点样后分别37℃15min烘干和室温(20~25℃)30min自然干燥,其他条件不变,观察显色情况。
包被条件筛选结果见表4。
表4包被条件筛选结果
包被液A
1:
20
1:
40
1:
80
1:
160
1:
320
37℃15min
+++
+++
++
+
-
室温(20~25℃)30min
+++
+++
++
+
-
由表可知,点样后,包被液在37℃10min烘干和室温(20~25℃)30min自然干燥的不同包被条件差异不显著。
为缩短试验过程,包被条件选择37℃15min烘干。
5.2封闭液和封闭条件的选择
包被抗原点样干燥后,分别用A、B、C、D四种不同配方的封闭液进行封闭,其他条件不变,观察点样点和NC膜的显色情况。
封闭液筛选结果见表5。
表5封闭液筛选结果
封闭液
A
B
C
D
显色情况
++
++
+++
++
由表可知,封闭液C封闭后得到的斑点颜色很深,作为背景的NC膜呈白色,同斑点颜色反差非常大,说明封闭液C封闭效果很好,将NC膜上的一些结合位点进行了封闭,使金标抗体不在NC膜上结合停留,除抗原点样处为红色,NC膜其他位置都为白色。
封闭液A、B、D封闭后得到的斑点颜色也很深,但NC膜上呈深浅不一的粉红色,降低了斑点同背景的反差。
说明封闭液C的封闭效果比其他三种封闭液封闭效果好。
包被抗原点样后,用封闭液C以不同的封闭时间20min、25min、30min、40min、50min分别在室温(20~25℃)、37℃条件下进行封闭,其它条件不变,观察显色情况。
表6封闭条件筛选结果
封闭时间(min)
10
20
40
60
120
37℃
+++
+++
+++
+++
+++
室温(20~25℃)
+++
+++
+++
+++
+++
封闭条件筛选结果见表6。
由表可知,看出抗原点样后,37℃和室温条件下封闭10~120min均能得到着色较深、背景较浅的斑点。
为缩短试验时间,简化操作流程,选择的封闭条件为室温(20~25℃)封闭10min。
5.3金标抗体稀释液的选择
20mL标记好的金标抗体经超速离心纯化后得到200µL浓缩金标抗体,分别用金标抗体稀释液A、B、C、D、E作2倍稀释后,滴加到经点样、封闭后的NC膜上,观察显色情况。
金标抗体稀释液筛选结果见表7。
表7金标抗体稀释液筛选结果
金标抗体稀释液
A
B
C
D
E
显色情况
+++
++
++
+
+
由表可知,其他条件相同的情况下,经稀释液A稀释后的金标抗体滴加到NC膜上得到的斑点颜色最深,最清晰。
20ml标记好的金标抗体经超速离心纯化后得到100µl浓缩金标抗体,用金标抗体稀释液E分别作1.5倍、3.0倍、4.5倍、6.0倍、7.5倍提取后,滴加到经点样、封闭后的NC膜上,观察显色情况。
金标抗体稀释倍数选择结果见表8。
表8金标抗体稀释倍数选择结果
稀释倍数
1.5倍
3.0倍
4.5倍
6.0倍
7.5倍
显色情况
+++
+++
+++
+
-
由表可知,浓缩纯化后的金标抗体作4.5倍稀释比较合适,单稀释倍数超过4.5倍后,NC膜上斑点颜色较浅或不显色。
6试纸条组成材料的选择
6.1用于胶体金免疫层析试验的膜多为硝酸纤维素膜(NC膜),对NC膜的选择常有以下要求:
6.1.1蛋白结合力:
NC膜与蛋白质结合的机理是静电引力。
胶体金免疫层析试验用的NC膜IgG的结合力常为40~130µg/cm2。
6.1.2孔径大小:
孔径大小是一个关键因素,免疫层析试验使用的膜孔径多为0.5~1.0µm。
6.1.3层析速率:
层析速率可用两种方式表示,单位时间层析流动的距离(cm/min)和单位长度层析流动所需时间(s/4cm)。
本试验供筛选的4种NC膜的层析速率见表9:
表9NC膜的层析速率
膜的类型
层析速率(s/4cm)
厚度(µm)
AE99
120~160
120
AE98Fast
110~160
120
ND140
130~150
120
AE100
90~120
120
6.1.4膜的厚度:
厚度对层析速率影响不大。
6.1.5抗张强度:
膜的可拉伸强度和弹性范围,如果膜的抗张强度太低在制备过程中会出现类似于断膜等许多问题。
6.2硝酸纤维素(NC)膜的选择
6.1.1用包被抗原在AE99、AE98Fast、ND140、AE100四种NC膜上分别点样,干燥、封闭后再分别滴加金标抗体溶液,比较不同膜的显色情况。
6.1.2用AE99、AE98Fast、ND140、AE100四种NC膜分别组装试纸条,比较不同膜的层析速度,比较相同时间内不同膜上检测线的显色情况。
表10NC膜点样显色结果
NC膜型号
AE99
AE98Fast
ND140
AE100
显色情况
+++
+++
+++
+++
由表可知,不同NC膜点样显色颜色都很深,没有明显区别。
6.1.3不同NC膜组装的试纸条试剂展开速度和加样5min后的检测线显色结果见表11。
表11NC膜层析显色结果
NC膜型号
AE99
AE98Fast
ND140
AE100
试剂展开速度(s)
87
70
135
65
5min后检测线显色情况
+++
+
++
+
由表可知,AE98Fast、AE100试剂展开速度较快,5min内检测线显色较浅,AE98、AE99试剂展开速度较慢,AE99上检测线显色较ND140上检测线显色深,且背景颜色很浅,四种膜中,AE99更符合试纸条设计要求。
金标垫多采用玻璃纤维素等蛋白质吸附性低的纤维素膜。
样品垫多采用玻璃纤维或纤维素滤膜,玻璃纤维吸收量小,一般用于测定血液制品,纤维素膜吸收量大,一般用于尿样或大量体液的检测,并可在其中加入一定的封闭剂或增稠剂以优化试验过程。
吸收垫多采用具有高吸水能力的纤维素滤膜,通过改变吸收垫的大小可以调整试验结束的时间。
背衬板用于支撑NC膜,一般为附有压力敏感胶的聚脂板或塑料板。
6.2.1结合释放垫的选择
将稀释好的金标抗体滴加在Glass33、Glass24、GFC20300,温箱烘干后,组装试纸条,比较不同玻璃纤维素膜上金标抗体的释放情况,比较NC膜上的检测线显色情况。
表12结合释放垫选择结果
玻璃纤维素膜
Glass33
Glass24
GFC20300
金标抗体释放情况
少量残余
少量残余
释放完全
检测线显色情况
++
++
+++
结果见表12。
由表可知Glass24组装的试纸条上检测线较GFC20300组装的试纸条上检测线颜色浅,检测完成后GFC20300上有少量的金标抗体残余。
故选择Glass33作为结合释放垫。
6.2.2样品垫的选择
用CB-SB08、CB-SB06、Glass33组装试纸条,各滴加100µl的样品,5min后比较样品垫对样品的吸收情况,比较NC膜上的检测线显色情况。
结果见表13。
由表可知,3种样品垫都能完全吸收100µl样品,5min后Glass33组装的试纸条检测线显色较其他两种颜色深,故选择Glass33作为样品垫。
表13样品垫选择结果
样品垫型号
CB-SB08
CB-SB06
Glass33
样品吸收情况
吸收完全
吸收完全
吸收完全
检测线显色情况
++
++
+++
6.2.3吸收垫的选择
用Cottonlinters2668,Cottonlinters300,Cottonlinters900三种棉线纸张分别组装试纸条,比较各棉线纸张的厚度、对层析反应后样品溶液的吸收情况。
结果见表14。
由表可知,3种吸收垫5min内都能将由NC膜层析过去的样品溶液吸收完全。
3种膜的厚度分别为:
0.90mm、1.83mm、2.59mm,考虑到Glass33和,NC膜AE99的厚度,故Cottonlinters2668与试纸条的其他材料匹配较佳。
表14吸收垫选择结果
吸收垫型号
2668
300
900
层析后溶液吸收情况
吸收完全
吸收完全
吸收完全
6.4金标抗体喷涂量的选择
结合释放垫上金标抗体的喷涂量对试纸条的灵敏度有很大的影响,但金标抗体的喷涂量不是一个固定不变的值。
胶体金标记抗体蛋白过程中,标记时胶体金溶液的pH值固定,稳定胶体金的最佳蛋白用量固定,标记时搅拌子转速固定,标记所用时间固定,但金标抗体在低温超速离心纯化后浓度有较大差异。
同样的转速,超速离心后有时离心管管底有致密黑色金颗粒贴壁,有时没有,这必然导致纯化后金标抗体浓度的不同。
不同批次的金标抗体在往结合释放垫上喷涂时都需要做预实验,先调节包被抗原浓度,调节金标抗体稀释倍数,组装少量试纸条测试ENR标准品,符合检测要求才能组装其他试纸条。
按每1cm2玻璃纤维素膜(Glass33)喷涂70µl、80µl和90µl金标抗体,将稀释后的金标抗体滴加到玻璃纤维素膜上,干燥后分别组装试纸条。
将阴性鸡肉样本40ng/ml、60ng/ml、80ng/ml的鸡肉样本分别作5倍稀释,用组装好的试纸条进行测试。
结果见表15。
从表
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