戴安离子色谱及液相色谱在奶制品检测中的应用.docx
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戴安离子色谱及液相色谱在奶制品检测中的应用
戴安中国有限公司
目录
离子色谱法及液相色谱法同时检测奶制品中三聚氰胺和三聚氰酸...................2
离子色谱法(等度法、梯度法)..............................................................2液相色谱法(C18分析柱法、CS10分析柱法)..................................................4液相色谱/质谱法..........................................................................5
离子色谱法检测奶粉和奶制品中的硝酸盐及亚硝酸盐.............................8
奶制品中的有机阳离子、胆碱、乙酰胆碱以及乌拉胆碱的分析....................10
离子色谱检测奶制品中的微量碘............................................11
牛奶中硫氰酸根的测定...................................................12
牛奶中高氯酸盐的测定...................................................13
牛奶中羟脯氨酸的测定...................................................15
牛奶中三价铬和六价铬的测定..............................................17
●
1
●
三聚氰胺,简称三胺,学名三氨三嗪,别名蜜胺、氰尿酰胺、三聚酰胺,是一种重要的氮杂环有机化工原料,具有一定的肾毒性。
因为其分子中含有大量氮元素(大约66%),而用全氮法检测蛋白质含量时不能够区分这种“伪蛋白氮”,所以一些不法乳制品厂家或无良的奶农,为了追求最大利益而不顾消费者的生命健康和安危,向产品中大量添加三聚氰胺粉以提高“蛋白质”含量。
三聚氰酸与三聚氰胺结构类似,在化工生产过程中经常同时存在。
因此,如果在奶粉生产过程中直接加入化工原料三聚氰胺,事实上也同时掺入了混在三聚氰胺当中的三聚氰酸,当三聚氰胺和三聚氰酸同时存在时,分子结构上的氢氧基与氨基之间会形成水合键,将二者连接起来,形成网格结构,当混在奶粉中的这种网格结构被摄入人体后,由于胃酸的作用,三聚氰胺和三聚氰酸相互解离,分别被吸收入血液,并被运送到肾脏,准备随尿液排出体外,但在肾脏细胞中,两种物质又一次相遇,再次结合成网格结构-不溶于水的大分子复合物-并沉积下来,形成结石,结果造成肾小管的物理阻塞,导致尿液无法顺利排除,使肾脏积水,最终导致肾脏衰竭。
婴幼儿由于主要营养来源来自于奶粉,而一旦大量食用含有三聚氰胺和三聚氰酸的奶粉,会形成肾结石,长期摄入会造成肾衰竭和死亡。
成年人长期摄入三聚氰胺和三聚氰酸,也会造成不同程度的肾损伤,因此,无论从任何层面上讲,三聚氰胺和三聚氰酸都应该被严令禁止加入到任何食品中。
据2007年6月的《美国兽医学会杂志》报道,2007年3月中旬以来,美国发生4000多起猫、狗等宠物中毒死亡事件。
美国食品药品管理局(FDA)从进口的部分小麦蛋白粉和大米蛋白粉中检出三聚氰胺等成分。
调查结果认为:
掺杂了6.6%三聚氰胺的小麦蛋白粉是导致宠物食品中毒的祸端。
2008年9月由于多例婴幼儿因饮用奶粉发生肾结石而爆发的奶粉掺有三聚氰胺事件,引起中国政府的极度重视,开始对牛奶及奶制品进行大规模监查。
目前三聚氰胺的检测方法主要集中在色谱或色谱与质谱联用技术上。
目前文献报道过的方法包括GC-MS方法,离子对试剂液相色谱-紫外检测法,LC-MS法和LC-MS/MS法等,但是上述各种方法都或多或少存在一些缺陷。
本资料为您介绍快速准确检测三聚氰胺的方法—离子色谱法和液相色谱/质谱法。
离子色谱法
本法是采用阳离子交换离子色谱-紫外检测的技术,对奶粉中三聚氰胺进行了准确定量,戴安公司为您提供等度以及梯度两种测定方法,为三聚氰胺的测定提供可靠的保障。
奶粉及液态奶样品前处理方法:
奶粉
一、奶粉:
(使用RP柱前处理,进样体积100微升)●称取1.00g奶粉样品,充分溶解于4mL去离子水中。
●使用色谱纯乙腈定容至10mL,充分混匀。
●室温沉降蛋白十分钟。
●取上清液,使用去离子水稀释十倍,依次过0.22微米尼龙滤头和活化过的RP柱。
●准备进样分析。
二、奶粉:
(使用NG1在线前处理,进样体积10微升)●称取1.00g奶粉样品,充分溶解于4mL去离子水中。
●使用色谱纯乙腈定容至10mL,充分混匀。
●室温沉降蛋白十分钟。
●取上清液,过0.22微米尼龙滤头。
三聚氰胺和三聚氰酸
●
2
●
●
准备进样分析。
(由于在定量环后,保护柱前,加一个可以去除疏水性组分的NG1柱,乙腈已将绝大部分蛋白沉淀,而残余的蛋白及脂肪则可被NG1小柱去除。
)
液态奶
一、液态奶:
(使用RP柱前处理,进样体积100微升)●取4mL牛奶样品。
●加入5mL色谱纯乙腈,充分混匀。
●室温沉降蛋白十分钟。
●取上清液,使用去离子水稀释十倍,依次过0.22微米尼龙滤头和活化过的RP柱。
●准备进样分析。
二、液态奶:
(使用NG1在线前处理,进样体积10微升)●取4mL牛奶样品。
●加入5mL色谱纯乙腈,充分混匀。
●室温沉降蛋白十分钟。
●取上清液,过0.22微米尼龙滤头。
●准备进样分析。
(由于在定量环后,保护柱前,加一个可以去除疏水性组分的NG1保护柱,乙腈已将绝大部分蛋白沉淀,而残余的蛋白及脂肪则可被NG1小柱去除。
)
注:
使用NG1时,在NG1柱前串接200微升体积的一段绿管,用于样品与流动相预混合。
每折合进样100针,应使用80%乙腈对NG1进行清洗,前后用水过度。
方法一:
等度法测定奶粉及奶制品中的三聚氰胺
测试对象:
奶粉、生鲜牛奶,本方法最低检出限为0.06mg/Kg(液态奶)或者0.1mg/Kg(奶粉样品),样品加标回收率为85%-105%,实际样品重现性RSD小于4%。
仪器准备:
戴安公司离子色谱紫外检测器色谱条件:
●淋洗液:
MSA(6mmol/L)或硫酸(3mmol/L)等度●色谱柱:
CS17色谱柱+CG17保护柱●柱温:
30℃
●进样体积:
10µL
●检测器:
紫外检测器UV,240nm●
分析时间:
12min
●
3
●
5mg/L三聚氰胺,出峰时间8.5min左右
2.00
4.00
6.00
9.50
-0.50
0.501-三聚氰胺
mAU
min
阳性牛奶样品,三聚氰胺浓度67.2mg/kg
2.00
9.50
0.50
1-三聚氰胺
mAU
min
4.00
6.00
8.00
1.00
1.50
1.80
8.00
0.001.001.502.002.503.003.50-0.200.00
离子色谱法及液相色谱法同时检测奶制品中三聚氰胺和三聚氰酸
10ppm三聚氰胺标准溶液色谱图,13.5分钟左右出峰三聚氰胺阳性样品色谱图
●
4
●
色谱峰:
三聚氰胺131mg/kg
5.0
10.0
15.0
min
50
100
150
200
1-三聚氰胺-13.487
mAU
5.0
10.0
15.0
19.0
02040
6080100
1201-三聚氰胺-13.480
mAU
min液相色谱法
戴安也为您提供液相色谱检测三聚氰胺的方法,方法都与国家标准相符。
方法一:
样品前处理:
与原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法(GB/T22388—2008)方法一致色谱条件:
流动相:
10mM的庚烷磺酸钠与柠檬酸(10mM)缓冲溶液:
乙睛=92:
8检测波长:
240nm
色谱柱:
DionexAcclaim120,C18,5µm,120A,4.6×250mm仪器:
DionexU3000高效液相色谱仪
Pump:
LPG-3400低压四元梯度泵,内置真空脱气机AutoSampler:
WPS-3000ColumnOven:
TCC-3000
Detector:
DAD-3000二极管阵列检测器
该方法三聚氰胺约11min出峰,方法检测限是0.29ppm
方法二:
梯度法测定奶粉及奶制品中的三聚氰胺
测试对象:
奶粉、生鲜牛奶、液态奶、巧克力豆、奶糖、饼干等,本方法最低检出限为0.03mg/Kg(液态奶)或者0.05mg/Kg(奶粉样品),样品加标回收率为77-121%,实际样品重现性RSD小于4%,结果令人满意。
仪器准备:
仪器:
戴安公司离子色谱紫外检测器色谱条件:
●淋洗液:
MSA梯度或硫酸梯度
●色谱柱:
CS17色谱柱+CG17保护柱●柱温:
30℃
●进样体积:
25µL
●
检测器:
紫外检测器,240nm
方法二:
样品前处理:
与原料乳中三聚氰胺快速检测液相色谱法(GB/T22400-2008)方法完全一致方法条件:
●实验仪器:
戴安U3000液相色谱或戴安离子色谱●检测器:
紫外检测器
●色谱柱:
IONPACCS10分析柱
●
流动相:
磷酸盐缓冲溶液-乙腈(70+30,体积比),混匀。
(磷酸盐缓冲液:
0.05mol/L。
称取6.8g磷酸二氢钾(准确至0.01g),加水800mL完全溶解后,用磷酸调节pH至3.0,用水稀释至1L,用滤膜(水
相,0.45µm)过滤。
)●流速:
1.5mL/min●检测波长:
240nm●进样量:
25µL
●
最低检出限:
0.06mg/kg(样品稀释一百倍后进样,计算检出限为0.6ppb
浓度为10ppm的三聚氰胺标准品色谱图,进样量20µL
0.0
10.0
20.0
-10.0
1-三聚氰胺-11.073
mAU
min
15.0
0.020.040.0
60.080.0
5.0
加标样品色谱图,三聚氰胺与样品中的杂质均能被基线
分离,最大限度的将杂质引起的误差降到最低
0.0
10.0
20.0
-2.0
3-三聚氰胺-11.043
mAU
min
15.0
0.05.0
10.0
15.0
20.0
5.0
1-2-11.683
5-14.123
2ppm标准品谱图0.0
10.0
-10.0
1-三聚氰胺-5.713
mAUmin
15.0
0.05.0
20.030.040.0
5.0
-5.010.015.025.035.0稀释100倍样品谱图检测含量:
6.825ppb
0.0
10.0
-3.9
1-三聚氰胺-5.760
mAU
min15.0
0.0
3.0
6.0
9.0
12.5
5.0
-3.0
液相色谱/质谱法
特点:
使用戴安公司最新开发的混合基质柱WAX-1分离被分析物。
该色谱柱利用疏水和离子交换混合作用机理来达到特殊的选择性和保留。
液相色谱运行时间仅用8分钟,戴安公司的MSQ质谱检测器确保选择性和灵敏度。
对于两种物质(2-200ng/mL)的线性都能达到R2>0.9995。
方法检出限(MDL),三聚氰胺为3.97ng/mL,三聚氰酸为3.32ng/mL。
本检测条件下MSQ质谱检测器的检出限<5ng/mL。
全波段扫描三聚氰胺和三聚氰酸的质谱图
●4000r/min离心10min
●上清液经三氯乙酸润湿的滤纸过滤●用三氯乙酸溶液定容到25mL
●
取5mL滤液,加入5mL水混匀后待净化
净化
●固相萃取柱:
混合型阳离子固相萃取柱,使用前依次用3mL甲醇、5mL水活化●将待净化液转移至固相萃取柱中,依次用3mL水、3mL甲醇洗涤后抽干●用6mL氨化甲醇洗脱,流速不超过1mL/min●洗脱液用50℃氮气吹干
●残留物加1mL液相的流动相定容,涡旋1min混匀●
过0.2µm滤膜
仪器:
戴安SummitHPLC或U3000液相色谱系统自动进样器柱温箱
戴安MSQPlus单四极质谱检测器,ESI源Chromeleon®变色龙软件
色谱条件:
分析柱:
戴安公司Acclaim混合基质柱WAX-1(150×2.1mm,5µm)淋洗液:
等度90%乙腈/10%20mMpH4醋酸铵缓冲液(v/v)
样品前处理:
提取
1、液态奶、奶粉、酸奶等样品:
●
称取2.0g样品(精确到0.01g)于50mL具塞塑料离心管中●加入15mL三氯乙酸溶液和5ml乙腈●混匀后超声10min,再振荡10min●4000r/min离心10min
●上清液经三氯乙酸润湿的滤纸过滤●用三氯乙酸溶液定容到25mL●取5mL滤液,加入5mL水混匀后待净化
2、奶酪、奶油等样品:
●称取2.0g样品(精确到0.01g)于研钵中●加入海沙研磨成干粉状转入50mL具塞塑料离心管中●用15mL三氯乙酸溶液清洗研钵并加入离心管●加入5mL乙腈●混匀后超声10min,再振荡10min
离子色谱法及液相色谱法同时检测奶制品中三聚氰胺和三聚氰酸
流速:
0.25mL/min柱温:
20℃进样量:
5µL
MSQ质谱条件
分析模式:
SIM带极性切换锥孔电压:
50V
间隔时间:
0.5S,对于所有SIM通道探针温度:
500℃
扫描:
4SIM全程扫描(每次500ms),两个不同极性的全扫描(100-400m/z,250ms)分析物及内标结果见表和色谱图。
MSQ质谱条件
名称开始质量数(m/z)结束质量数(m/z)时间范围(分钟
扫描时间(毫秒
极性锥电压(V
正极全扫描1004000-8250pos.50负极全扫描1004000-8250pos.50名称
Mass(m/z)
Span(m/z)
时间范围(分钟
扫描时间(毫秒
极性
锥电压(V
SIMGROUP1
三聚氰胺
1270.50-5500pos.50三聚氰胺-15N3(内标)
130
0.5
0-5
500
pos.
50
SIMGROUP2
三聚氰酸
1280.55-8500neg.50三聚氰酸-13C3(内标)
131
0.5
5-8
500
neg.
50
离子色谱法检测奶粉和奶制品中的
硝酸盐及亚硝酸盐
自然界中的硝酸盐及亚硝酸盐的形成机理:
含氮有机物在微生物的作用下,可逐渐分解成氨,在氧的作用下,
氨可进一步被微生物转化为亚硝酸盐和硝酸盐,硝酸盐在一定条件下亦可还原为亚硝酸盐。
大量的亚硝酸盐被人体血液吸收后,可使正常的血红蛋白(二价铁)变成变性血红蛋白(三价铁),从而失去携带氧气的功能,出现组织缺氧现象;另外亚硝酸盐与蛋白质代谢的中间产物仲胺反应,还能生成亚硝胺,亚硝胺具有一定的致癌性。
在奶牛的喂养过程中,如果环境水源、喂养饲料的添加剂以及奶牛生长环境等硝酸盐、亚硝酸盐含量过高,都会发生牛奶中的硝酸盐及亚硝酸盐的超标,随着人们生活质量的提高,牛奶及奶制品在人们日常生活中所占比重越来越大,因此,加强预防和检测牛奶及奶制品的硝酸盐污染是非常必要的。
本部分介绍了离子色谱检测牛奶及奶制品中硝酸盐、亚硝酸盐的方法,该方法对亚硝酸盐和硝酸盐检出限分别为0.05mg/L和0.075mg/L。
注:
本方法为国标GB5009食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定中的推荐方法
样品前处理
提取:
牛奶:
准确量取5mL试样于25mL比色皿中,加5-10mL纯水,加入3%乙酸2mL,摇匀超声10min,75℃放置5min。
采用定量滤纸初步过滤。
取部分溶液于10000rpm速度离心15min,取上清液备用。
奶粉,奶制品:
准确称取试样2.50g,置于50mL容量瓶中,加水40mL,加入3%乙酸2ml,摇匀,超声30min,置75℃水浴中放置5min,用水稀释至刻度。
溶液经滤纸过滤后,取部分溶液于10000rpm离心15min,取上清液备用。
净化:
取滤液15mL依次通过OnGuardIIRP柱(如果氯离子大于100mg/L,则需要依次通过OnGuardIIAg柱和Na柱),弃去前面3ml(1.0cc),收集后面洗脱液待测。
OnGuardIIRP柱(1.0cc)使用前依次用10ml甲醇、10mL水通过,活化30minOnGuardIIAg柱(1.0cc)和OnGuardIINa柱(1.0cc)用10mL水通过,活化30minOnGuardIIRP柱、Ag柱和Na柱可以用C18柱、Ag型树脂柱和Na型树脂柱代替
色谱条件:
色谱柱:
氢氧化物选择性,可兼容梯度洗脱的高容量阴离子交换柱,如IonPacAS11-HC4mm×250mm(带
IonPacAG11-HC型保护柱4mm×50mm)。
淋洗液:
淋洗液自动发生器,浓度为6~70mmol。
或选配二元或四元梯度泵混合产生梯度程序(使用高纯的、
质量浓度为50%浓氢氧化钠溶液,配制成含OH-为100mmol/L的淋洗液,然后再进行调整稀释)。
抑制器:
连续自动再生膜阴离子抑制器检测器:
电导检测器,检测池温度:
35℃淋洗液流速:
1.0mL/min进样体积:
50µL
测定:
标准曲线
移取硝酸盐和亚硝酸盐混合标准使用液,加水稀释,制成系列标准溶液,其中由于不同样品中硝酸盐含量差
离子色谱法检测奶粉和奶制品中的硝酸盐及亚硝酸盐
别较大,故针对不同类型的样品,需制作不同标准曲线,含硝酸盐浓度为0.0、0.03、0.75、0.15、0.3、0.45、0.6mg/L或0.0、5.0、10.0、20.0、50.0、75.0和100.0mg/L和亚硝酸盐浓度为0.00、0.005、0.010、0.025、0.50、0.75、1.00mg/L的混合标准溶液,用1.0mL注射器从低到高浓度依次进样,得到上述各浓度标准溶液的色谱图。
以硝酸盐和亚硝酸盐的浓度(µg/L)为横坐标,以峰高(µS)或峰面积为纵坐标,绘制标准曲线,并计算线性回归方程。
样品测定:
用1.0mL注射器分别吸取空白和试样溶液,在相同工作条件下,依次注入离子色谱仪中,记录色谱图。
根据保留时间定性,分别测量空白和样品的峰高(µS)或峰面积(µS*min)。
结果计算:
试样中硝酸盐或亚硝酸盐含量按式
(1)计算………………………………
(1)式中:
X——试样中硝酸盐(以NO3-计)或亚硝酸盐(以NO2-计)的含量,单位为毫克每千克(mg/kg)c——测定用试样溶液中的硝酸盐或亚硝酸盐浓度,单位为毫克每升(mg/L)co——试剂空白液中硝酸盐或亚硝酸盐的浓度,单位为毫克每升(mg/L)V——试样溶液体积,单位为毫升(mL)f——试样溶液稀释倍数
m——试样取样量,单位为克(g)
计算结果表示到小数点后两位。
硝酸盐和亚硝酸盐混合标准溶液的色谱图
(01000
CCVfX−×××=
×1
µS
min
32.6
-0.100
-0.050
0.0000.0500.100
0.1500.2000.2500.3002
色谱峰:
1NO2
0.1ppm2
NO30.6ppm
奶制品中的有机阳离子、胆碱、乙酰胆碱
以及乌拉胆碱的分析
胆碱又被称为“记忆因子”,是合成乙酰胆碱的重要原料,能帮助中枢神经传递资讯,是大脑思维、记忆
等智力活动的必需物质,胆碱在心血管和肝健康以及人体正常的新陈代谢中发挥着重要作用。
婴幼儿以及幼小动物由于自身尚无合成胆碱的功能,体内所需要胆碱全部依赖外界供给,氯化胆碱是维生素之一,卵磷脂的主要成份,氯化胆碱经常作为胆碱添加剂添加到婴幼儿食品、维生素配方、运动饮料和小动物饲料中。
胆碱是一种季胺碱,具有强碱性,氯化胆碱是胆碱的盐酸盐,化学名称为三甲基(2-烃乙基)氯化铵,传统的氯化胆碱的检测为间接检测,根据检测的Cl-含量进行计算得出胆碱含量,故一些不法商人趁机掺假,许多廉价无机氯化物和有盐酸盐,如NaCl、NH4Cl、三甲胺盐酸盐等均可能作为掺假物掺加到奶制品及小动物饲料中。
戴安公司的离子色谱法检测胆碱采用阳离子交换柱,电导检测器,可以直接得到胆碱的色谱峰,方法准确快速。
色谱条件
分析柱:
IonPacCS12A,CG12A淋洗液:
18mN硫酸流速:
1mL/min进样体积:
10µL
检测方式:
抑制型电导,CSRSⅡ,自循环模式
A.100ppm胆碱
B.婴儿配方奶粉
婴儿配方奶粉中胆碱与常规阳离子的分离谱图
5
10
15
20
25
3.5
µS
1
510
152025
2
µS
1
min
min
234
5
6
7
色谱峰:
1.系统峰2.Na3.NH44.K
5.胆碱,9.1ppm6.Mg
7.Ca
奶制品中的有机阳离子、胆碱、乙酰胆碱以及乌拉胆碱的分析
离子色谱检测奶制品中的微量碘
碘是人体必需的微量元素,碘的缺乏或过量摄入都会使人的甲状腺功能紊乱,影响身体和智力的发展,婴幼儿所需碘主要来源于母乳和婴幼儿配方奶粉,所以对产妇和婴幼儿配方奶粉以及牛奶中碘的检测是十分必要的。
本方法用带有脉冲安培检测器的离子色谱检测了婴儿配方奶粉、孕产妇专用奶粉以及鲜牛奶中的微量碘,以NaOH作淋洗液,直接进样,方法的检测限达1µg/L
样品前处理:
牛奶
●
量取7.0mL牛奶●加入2mL体积分数为3%的醋酸稀释至10mL,摇匀●于3500转/分速度下离心3min●上清液用0.45µm滤膜过滤,取5.0mL滤液●加入0.2mL3mol/LNaOH混匀●于3500转/分下离心3分钟●用0.45µm滤膜再过滤
样品经过上述两步处理分别脱去蛋白质和脂肪等有机物后可用于离子色谱直接进样分析。
脱脂奶粉
●在100mL烧杯中称取脱脂奶粉样品0.95g●加入10mL水溶解
●加
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- 离子 色谱 奶制品 检测 中的 应用