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第七章分子生物学其它实验技术
第七章分子生物学其它实验技术
实验一M13克隆和DNA序列分析
一、原理和用途
DNA的序列分析是DNA分子克隆研究中最重要的方法之一,对于从分子水平上研究基因的结构与功能的关系,以及克隆DNA片段的操作方面,都有着十分广泛的实用价值。
根据DNA序列,可以得知限制性酶切位点;可以了解蛋白质的编码区和上、下游调控序列,进而研究编码基因的表达;可以确定基因诱变后特异的碱基变化;在疾病基因诊断中,可提示疾病的分子缺陷,并确认某个位置的碱基突变,从而找出疾病发生的机制。
目前用于测序的技术主要有Sanger等(1977)发明的双脱氧链末端终止法和Maxam和Gilbert(1977)发明的化学修饰法。
这两种方法在原理上差异很大,但都是根据核苷酸在某一固定的点开始,随机在某一个特定的碱基处终止,产生A、T、C、G四组不同长度的一系列核苷酸,然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测,从而获得DNA序列。
目前应用广泛的是M13噬菌体克隆-双脱氧核苷酸(ddNTP)的DNA测序法。
M13噬菌体克隆-双脱氧核苷酸(ddNTP)测序法的基本原理是:
M13噬菌体是一种单链DNA噬菌体,但它在感染宿主(大肠杆菌)后,在菌体细胞内复制成为双链并繁殖,又以单链形式透出菌体,再度感染新的宿主菌。
把一段待测DNA用遗传工程方法插入双链的M13复制型DNA中,经过培养扩增,在培养物的上清液中可以提取到单链的M13噬菌体的DNA。
该单链DNA已含有插入待测DNA的序列,作为单链模板。
在待测DNA的3´端人工合成一段引物,在DNA聚合酶I作用下,复制链延长。
2’,3’-双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)掺入到核苷酸生长末端,取代了脱氧核苷(dNTP)之后,由于ddNTP没有3’-OH基团,所以核苷酸链就不再能够继续延长(终止了链的合成),这种复制延长的终止是随机的,于是形成分子量、长度、大小不等的片段。
然后再电泳分离,自显影,读图分析碱基序列。
例如在同一个反应试管中,加入同一种DNA合成的引物和模板,DNA聚合酶,ddTTP,dTTP,以及其它3种脱氧核苷三磷酸(dATP、dGTP和dCTP),其中dATP是带32P放射性标记的,那么经过适当的温育之后,将会产生出不同长度的DNA片段混合物。
它们全都具有同样的5’-末端,并在3’末端的ddTTP处终止。
将这种混合物,加到变性的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离,就可以获得一系列全都以3’-末端ddTTP为终止残基的DNA片段的电泳谱带模式。
使用其它核苷酸的抑制物,如ddATP,ddCTP,ddGTP,并分别在不同反应试管中温育,然后连同第一个ddTTP反应,平行加到同一变性凝胶上作电泳分离,最后再通过放射自显影技术,检测单链DNA片段的放射性条带。
结果可以从放射性X光片上,直接读出DNA的核苷酸顺序。
由于M13噬菌体克隆-双脱氧核苷酸(ddNTP)测序法采用的是DNA分子克隆的方法,即将不同限制酶消化切割的DNA限制片段,随机地克隆到一种合适的载体分子上。
使用这样的克隆程序的本身,就可以保证所有来自同一个重组体克隆的后代,都含有一种同源的插入序列。
另一个突出优点是,序列测定反应中所必须的引物序列是M13mp载体上多克隆位点两侧的已知序列(正向引物和负向引物),所有的待测定的DNA片段,都可以共用一种引物,此引物称做“通用引物”(universalprimer),这样就避免了合成和分离各种不同引物的许多麻烦。
DNA碱基序列测定的方法还有很多,近年来还应用荧光标记代替了同位素标记,它是用4种不同最大吸收峰的荧光物质标记4种不同碱基,这样就可用仪器代替人工读图谱,再经过计算机处理,序列测定可完全自动化,效率大为提高,这样连成一体的仪器称为全自动测序仪。
二、实验材料
外源DNA和M13噬菌体载体。
三、溶液与缓冲液
1.M13mp系列载体
2.E.coliJML01及感受态细胞
3.TE缓冲液
4.T4DNA连接酶及缓冲液
5.DATP
6.SOB培养基:
100mL中含2.0gTryptone,0.5gYeastextract,0.05gNaCl,1.5%琼脂,混匀后加入KCl0.186g(pH7.0)。
7.100mmol/LIPTG:
24mgIPTG溶于lmLddH2O。
8.2%X-gal(M/V):
溶于二甲基甲酰胺。
9.2×YT培养基:
100mL中含1.6g胰蛋白胨,1.0g酵母粉,0.5gNaCl,1.5%琼脂(pH7.0)。
10.0.7%YT上层琼脂:
YT液体培养基中入0.7%琼脂。
11.LB培养基:
100mL中含1.0g胰蛋白胨,0.5g酵母粉,1.0gNaCl,1.5%琼脂(pH7.0)。
12.PEG
13.3mol/LNaAc
14.M13引物:
互补于M13克隆位点3’端DNA单链的人工合成的17个碱基的寡核苷酸片段。
15.[α-32P]dATP。
16.DNA聚合酶I(Klenow片段)。
17.10%过硫酸胺
18.TEMED
19.尿素
20.按表7-1加入4种dNTP底物混合物。
表7-1四种测序反应管中4种dNTP加入量
混合物
dATP
(mol/L)
dCTP
(mol/L)
dGTP
(mol/L)
dTTP
(mol/L)
XA
1.96
245
245
245
XC
1.94
16
322
322
XG
1.94
322
16
322
XT
1.94
322
322
16
21.4种ddNTP:
0.125mmol/LddATP
0.5mmol/LddCTP
0.5mmol/LddGTP
1.0mmol/LddTTP
22.上样液:
0.1%二甲基苯蓝
0.1%溴酚蓝
95%甲酰胺
10mmol/LEDTA
23.40%(W/V)丙烯酰胺:
N,N’-亚甲基双丙烯酰胺(19:
1):
丙烯酰胺38g
N,N’-亚甲基双丙烯酰胺2g
溶于ddH2O
定容至l00mL。
24.5×TBE:
Tris54.0g
Na2EDTA·2H2O0.93g
硼酸27.5g
加ddH2O至800mL
用硼酸调pH至8.0(约加2.5g)
用ddH2O定容至1L。
四、仪器设备及耗材
恒温摇床,台式高速离心机,恒温水浴锅,琼脂糖凝胶电泳装置,电热恒温培养箱,电泳仪无菌,工作台,微量移液器,吸头,EP管。
五、实验方法
1.外源DNA在M13噬菌体载体的克隆
(1)将适量的M13载体DNA与待克隆的外源DNA片段混合,两种DNA的体积合计不得超过7.5L;不足时,可加TE(pH8.0)将体积补足至7.5L。
加入1Ll0×T4DNA连接酶缓冲液和1L10mmol/LATP。
混匀后取出1L放于另一个含有9LTE(pH8.0)的管中,贮存于4℃备用。
注意:
10L连接反应液中应含M13DNA20ng(0.004pmol/L),待测插入片段取20ng~100ng(0.004pmol/L~0.02pmol/L),这种组合可得到适量的重组体,适于大多数克隆实验。
同时进行两个对照反应,其中:
①同等量的载体DNA,无外源DNA;②同等量的载体DNA和适量的对照DNA,后者应在以往的实验中曾成功地克隆于M13噬菌体(例如用识别四核苷酸序列并可产生合适粘端的限制酶消化的λ噬菌体DNA)。
(2)在步骤
(1)的每个反应中各加入0.5L的T4DNA连接酶,略加振荡,于16℃温育4~6h。
(3)从-70℃冰箱中取出一份冻存的E.coliJML01感受态细菌(每管100L),于室温融化,然后冰浴10min。
(4)吸取5L连接反应液,加入到感受态细胞中,混匀,立即置冰浴中45min。
(5)42℃热激90s,立即将管放回冰浴之中,2min后加入175LSOB培养液,轻轻振荡混匀。
(6)将上述混合培养物涂布在预先用20LIPTG(100mmol/L)和100LX-gal(20mg/mL)的LB琼脂平板上。
(7)将平皿倒置,于37℃培养8~12h,观察白色噬菌斑。
2.制备重组M13单链DNA模板
(1)挑取白色单菌落,接种于5mL2×YT液体培养基中,37℃振荡培养过夜。
次日按1%比例稀释,继续培养至对数生长期。
(2)取2mL培养液加入10mL培养管中,再加入单个噬菌斑,于37℃振荡培养5~8h。
(3)将培养液转入1.5mLEppendorf管中,10000r/min离心10min。
(4)将上清液转入新的1.5mLEppendor管中,10000r/min再离心10min。
(5)吸取1.2mL上清液,加入到300LPEG溶液中,振荡混匀,室温或于4℃静置15min。
(6)10000r/min离心15min(沉淀M13颗粒),吸弃上清液,再离心2min,弃上清液。
(7)加入200LTE缓冲液,振荡,分散病毒颗粒。
(8)加入200L平衡酚,混匀,12000r/min离心5min。
(9)吸取180L上清液,加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25:
24:
1),混匀,同上抽提1次。
(10)吸取160L上清液,加入1/10体积的3mol/LNaAc、2.5体积无水乙醇,于-70℃放置30min,沉淀单链DNA。
(11)10000r/min离心15min,弃去上清液,沉淀用70%乙醇洗1次,离心5min,吸去上清液,再离心2min,吸去残余上清液,真空抽干沉淀。
(12)加入10LTE溶解沉淀,备用。
3.测序反应
(1)取4支1.5mL的Eppendorf管,标记A、C、G、T,分别加入以下试剂,备用。
A管:
1LXA、1L0.125mmol/LddATP,
C管:
1LXC、1L0.5mmol/LddCTP,
G管:
1LXG、1L0.5mmol/LddGTP,
T管:
1LXT、1L1.0mmol/LddTTP。
(2)于另一个1.5mLEppendorf管中加入4L重组M13单链DNA模板、2LL引物、1Ll0×聚合酶反应缓冲液,ddH20补至总体积12.4L,混匀。
置55℃~65℃保温10min,室温放置缓慢冷却,使引物与模板退火。
(3)加入lL[α-32p]dATP、1L大肠杆菌DNA聚合酶I(Klenow片段)、瞬时离心混匀。
(4)各取3L分别加入A、C、G、T管中,瞬时离心混匀。
(5)30℃水浴保温15min,各加入1L0.5mol/LdATP,瞬时离心混匀,再于30℃水浴保温15min。
(6)各管加入上样液4L,混匀,于95℃变性3min,速置冰中备用
4.测序凝胶板的制备、核苷酸链的电泳分离及放射自显影
(1)电泳用玻璃板处理
1确定凝胶接触面(制胶面),做上标记。
2制胶面用洗液处理,水冲净,洗洁净擦洗,水彻底冲净,竖起凉干。
3将凹槽玻璃板制胶面硅化(第一次使用的玻璃板需硅化2次),自然干燥。
(2)制胶模
1将玻璃板平放于实验台上,玻璃板间左右两侧边缘夹放0.4mm厚的边条。
2用胶带封住两侧及底边,夹子夹紧,30度水平夹角倾斜放置。
(3)配制6%聚丙烯酰胺凝胶溶液
1取12mL40%(W/V)丙烯酰胺:
N,N’-亚甲基双丙烯酰胺(19:
1),37g尿素、16mL5×TBE、适量ddH2O,微加热溶解后定容80mL。
2真空抽气10min。
3加入300L10%过硫酸胺、20LTEMED,混匀。
(4)灌胶
1混匀后,立即缓缓平稳地将溶液灌入胶膜中,不能出现气泡。
2将鲨鱼齿梳平端插入凹槽胶中深约0.5~1.0cm。
3胶凝固后,除去下端封边的胶带,将胶板安置在垂直板电泳槽上,上、下槽内加入TBE缓冲液。
4小心将鲨鱼齿梳拔出,用TBE缓冲液洗槽,可加入1滴溴酚蓝观察胶面是否平整。
观察后,更换槽内缓冲液,将梳子反过来插入,齿尖正好与胶面接触,不得深入胶内。
(5)预电泳:
2000V电压,预电泳1h。
(6)上样。
(7)电泳:
用移液器小吸头将核苷酸序列测定反应液,按ACGT的次序把4管内的产物加到聚丙烯酰胺-尿素凝胶板点入鲨鱼齿梳齿间,可分两次上样,第一次上样3.5L,2000V电压电泳2h后,第二次将剩余样品全部上样,3000V电压电泳6~7h。
(8)加X光片:
取下胶板,掀起带凹槽玻璃板,胶上铺一层保鲜膜,去除气泡,于暗室中压片,-20℃曝光过夜(暗盒上最好压上重物,以便使X-光片与胶贴紧)。
(9)X光片的显影、定影:
将曝光完毕后的X-光片在暗室置于水中湿润,然后置于显影液中显影,直至条带清晰显示为止。
用水淋洗片刻后置于定影液中定影15min以上,取出干燥。
(10)读片:
从第二次上样的底部找到插入片段与载体连接处的限制性酶切序列(此顺序是已知的),以此为起点,从下往上读就是新合成链5’向3’的碱基序列(见图7-1),其互补链就是原插入M13的待测DNA3´至5´的碱基序列。
每次可读出200~300个核苷酸序列。
六、作业与思考题
1.序列分析过程中的终止效应是如何产生的?
2.如何根据放射自显影X-光片上的条带确定测序的核苷酸序列?
实验二Western印迹分析(I)
一、原理和用途
Western印迹分析(Westernblotting)是将蛋白质经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离后转移到固相支持物上,然后用特异性抗体进行特异酶联免疫反应(ELISA)检测的免疫学方法。
它是将蛋白质电泳、印迹、免疫测定融为一体的特异蛋白质检测方法,具有很高的灵敏度,能达到标准的固相放射免疫分析水平。
粗蛋白提取物中,小于50ng的抗原可以测出,在较纯的制剂中,可测出1~5ng抗原。
其原理是:
转化的外源基因正常表达时,转基因细胞中含有一定量的目的蛋白。
从转化细胞中提取总蛋白或目的蛋白,将蛋白质样品溶解于含去污剂和还原剂的溶液中,经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳使蛋白质胺分子大小分离,将分离的各蛋白质条带原位转移到固相膜上,膜在高浓度的蛋白质溶液中温育,以封闭非特异性位点。
然后加入特异抗体(一抗),印迹上的目的蛋白(抗原)与一抗结合后,再加入能与一抗专一结合的二抗,最后通过二抗上标记化合物的性质进行检出。
根据检出结果,可得知被检细胞内目的蛋白表达与否、浓度大小及大致的分子量。
在基因工程中,Western印迹分析是非常有用的技术,特别对转基因高等生物的研究中,可用于检测
(1)外源基因在转基因个体中的表达活性;
(2)外源基因在转基因个体中表达的器官组织特异性;(3)外源基因在转基因个体中的表达调控。
本实验以转基因植物的基因表达检测为例,介绍Western印迹分析的基本方法。
二、实验材料
转基因及非转化植物相同器官或部位的组织材料。
三、溶液与缓冲液
1.蛋白提取缓冲液:
25mmol/LTris·HCl(pH7.5)
10mmol/LKCl
20mmol/LMgCl2
lmmol/LDTT
lmmol/LPMSF(现加)
2.100%丙酮溶液(含0.09%β-巯基乙醇)。
3.样品缓冲液:
50mmol/LTris·HCl(pH6.8)
2%SDS
10%甘油
5%β-巯基乙醇
0.1%溴酚兰
4.30%单体贮液:
称取29.2g丙烯酰胺(Acr),0.8g甲叉双丙烯酰胺(Bis),ddH2O定容至100mL,4℃保存。
5.10%过硫酸铵:
一般现配现用。
称1g过硫酸铵,ddH2O定容至10mL。
6.浓缩胶缓冲液:
Tris3.03g
ddH2045mL
10%SDS2mL
用浓盐酸调pH至6.8,
ddH2O定容至50mL,复调pH至6.8。
7.4×分离胶缓冲液:
1.5mol/LTris·HCl
0.4%SDS,pH8.8
8.4×浓缩胶缓冲液:
0.5mol/LTris·HCl
0.4%SDS,pH6.8
9.10%SDS:
称取5gSDS,加双蒸水至50mL。
10.TEMED(N,N,N',N'-四甲基乙二胺)。
11.10×电极缓冲液:
甘氨酸144g
Tris30g
10%SDS100mL
加蒸馏水至1000mL
12.固定液:
95%乙醇131mL
冰乙酸25mL
加蒸馏水至250mL
13.浸泡液:
95%乙醇79mL
醋酸钠17g
25%戊二醛1.25mL
硫代硫酸钠0.5g
加蒸馏水至250mL。
14.银染液:
AgNO30.25g
甲醛50L
加蒸馏水定容至250mL。
15.显色液:
碳酸钠6.25g
甲醛25L
加蒸馏水定容至250mL
16.脱色液:
乙醇250mL
冰乙酸80mL
加蒸馏水定容至1000mL
17.考马斯亮蓝染液:
0.29g考马斯亮蓝R-250溶解在250mL脱色液中。
在使用前边搅拌边加热至60℃。
18.第一抗体:
用被检蛋白质制备的兔抗血清。
19.第二抗体:
用碱性磷酸酶标记的羊抗兔IgG。
20.转移缓冲液:
380mmol/L甘氨酸
50mmol/LTris
0.1%SDS
20%甲醇
加水至1000mL
21.封闭液:
含3%牛血清白蛋白(BSA)的TNT缓冲掖。
22.TNT缓冲液:
10mmol/lTris·HCl(pH8.0),
150mmol/LNaCl
0.05%Tween20
23.DAB显色液:
10mmol/LTris·HCl(pH7.6)
0.3%CoCl2
0.6%二氨基联苯胺(DAB)
30%H2O2。
24.碱性磷酸酶缓冲液:
100mmol/LNaCl
50mmol/LMgCl2
100mmol/LTris·HC1(pH9.5)
25.NBT/BCIP显色液:
碱性磷酸酶缓冲液10mL,加0.075%氯化硝基四氮唑蓝(75mgNBT溶于1mL二甲基甲酰胺)33L,0.075%5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸(50mgBCIP溶于1mL二甲基甲酰胺)11L。
四、仪器设备及耗材
高速低温离心机,电泳仪,垂直平板电泳槽,摇床,洗脱仪,转移电泳槽,硝酸纤维素膜(NC膜),其它:
离心管、Tip头、一次性PE手套。
五、实验方法
1.植物可溶性蛋白的提取(4℃下进行)
(1)分别从转基因及非转化植物相同器官或部位剪取2g材料,用蒸馏水洗净,投到置4℃冰浴的研钵中;
(2)分别加入2倍体积的4℃下存放的蛋白提取液,研磨至匀浆;
(3)10000r/min离心,取上清液;
(4)加入5倍体积的冷丙酮(含0.09%的β-硫基乙醇),置-20℃1h;
(5)12000r/min离心,收集沉淀;
(6)冰冻干燥机干燥成粉末保存;
(7)使用时,用样品缓冲液溶解蛋白,取待测蛋白溶液lmL,适当稀释,在波长260nm和280nm下测吸光值,然后利用下列公式估计蛋白含量:
蛋白质浓度(mg/mL)=1.45A280-0.74A260。
2.SDS-PAGE分离蛋白质
(1)制胶:
根据待检蛋白质的分子质量,确定需配制度凝胶浓度(表7-2)。
按表7-3配制相应浓度的胶。
表7-2丙烯酰胺浓度与被分离蛋白质的关系(SDS-PAGE)
丙烯酰胺浓度
分离蛋白质(Da)
5.0
0.57~2.12×105
7.5
3.6~9.4×104
10.0
1.6~6.8×104
15.0
1.2~4.3×104
表7-3SDS-PAGE分离胶的配方
贮液
分离胶中丙烯酰胺终浓度(%)
5.0
7.5
10.0
12.0
15.0
30%单体贮液(mL)
2.50
3.75
5.00
6.00
7.50
4×分离胶缓冲液(mL)
3.75
3.75
3.75
3.75
3.75
H2O(mL)
8.75
7.50
6.25
5.25
3.75
10%过硫酸铵(μL)
200
200
200
200
200
TEMED(μL)
10
10
10
10
10
(2)在配制凝胶时,将水、30%单体贮液混合完全后,真空脱气5min,然后加入过硫酸铵和TEMED,充分混合后,缓慢地倒入已经固定在夹心垂直平板电泳槽两片玻璃的窄缝中,并注意在本操作过程中不能产生任何气泡。
然后尽快地在分离胶的上面轻轻地覆盖一层水,在室温下静置15~30min。
当凝胶完全聚合后,则在水相和凝胶的交界处有一明显的亮线。
除去上层水相,并用滤纸条吸干,再灌以浓缩胶。
浓缩胶的配方如表7-4。
灌制好浓缩胶后,立即插上样品梳子。
凝固后将电极缓冲液倒入电泳槽,并使负极槽液面高于短玻璃片,正极槽液面可稍低,轻轻将梳子拔出。
表7-4SDS-PAGE浓缩胶的配方
贮液
取用体积(mL)
30%单体贮液
0.650
4×浓缩胶缓冲液
1.250
H20
3.050
10%过硫酸铵
100
TEMED
10
(2)点样
将转基因植物蛋白质提取液、非转化植物蛋白质提取液、负对照样品、正对照样品及蛋白质分子量标准样品分别与载样缓冲液等体积混合,使用前100℃加热3~5min,每孔上样量一般为2~10g,蛋白液的浓度一般为lmg/mL。
记录样品顺序。
(3)电泳:
先以10~15mA稳流电泳,待溴酚蓝指示线(蓝色)到达浓缩胶和分离胶界面时,改为20~30mA稳流电泳。
电泳结束后,溴酚蓝泳动至接近凝胶边缘时停止电泳。
3.转移蛋白质
(1)电泳结束后,取出胶,置转移缓冲液中浸泡30min。
(2)剪取硝酸纤维素膜,于转移缓冲液中浸泡。
(3)将转移装置中的海绵置转移缓冲液中浸泡。
(4)将膜铺在胶上,排出气泡。
用两块3MM滤纸将胶和膜夹好,再夹上海绵,放入电转移槽中。
注意膜的一面靠正极(见图7-2)。
(5)电泳槽中加入转移缓冲液,60V、40℃下转移2.5h。
(6)取下胶和膜,倒扣于滤纸上,用铅笔在膜上描出胶上点样孔位置,揭去胶,从膜上剪下分子质量标准样品的泳道条带,置氨基黑中染色,照相。
4.封闭
(1)将转移后的硝酸纤维素膜置TNT缓冲液中冲洗2~3次。
(2)转入含1%BSA的TNT缓冲液中,37℃封闭30min,其间轻轻摇动。
5.免疫反应
(1)将封闭后的膜置TNT缓冲液中漂洗2~3次,每次5~10min。
(2)加入用TNT稀释的第一抗体10mL,37℃轻轻摇动1h。
(3)将结合了第一抗体的硝酸纤维膜,置TNT缓冲液中洗三次,每次5~10min。
(4)取1L第二抗体,用TNT缓冲液稀释至8mL。
(5)膜置NTN液中,加入稀释好的二抗,37℃轻轻摇动1h。
6.酶显色反应
(1)将硝酸纤维膜用TNT缓冲液洗三次,每次5~10min。
(2)将膜放入NBT/BCIP显
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- 第七 分子生物学 其它 实验 技术