纯化水需氧菌总数计数方法的验证2015.docx
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目 录
一、引言
1、概述
2、验证的目的
二、验证方法合格标准
三、主要材料确认
1、仪器设备确认
2、辅助材料确认
3、人员确认
4、商品培养基及灭菌培养基确认
5、菌种及菌液的制备
四、样品制备
1、稀释液 2、供试液制备 3、操作方法
五、方法验证
1、需氧菌总数的计数方法验证
2、计算菌回收率公式
六、验证结果及评价
七、再验证周期
八、验证结论批准
一、引言
1、概述:
根据《中国药典》2015年版三部通则 “1105 非无菌产品微生物限度检查:
微生物计数法”(以下简称《药典》)的要求,对内控标准中有“微生物限度”检查项的产品进行该项验证。
根据《中国药典》2015年版三部纯化水进行方法学确认。
2、验证目的:
确保药品微生物限度检查实验的准确性,在建立药品的微生物限度检查法时,应进行需氧菌总数计数方法的验证,以确认所采用的方法适合于该样品的需氧菌总数的测定。
二、验证方法合格标准
1.前提条件:
培养基适用性实验应符合规定,即:
被检R2A培养基上菌落平均数与对照培养基上菌落平均数比值应为0.5~2,且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致。
2.计数方法适用性试验:
在3次独立的平行试验中,若试验组的菌回收率(试验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数的值与菌液对照组的平均菌落数的比值)均在0.5~2范围内,照该供试液制备方法和计数法测定供试品的需氧菌总数。
三、主要材料确认
1、仪器、设备确认
名 称
型 号
存放地点
厂 家
工作 状态
校验 期至
生化培养箱 (30~35℃)
HPS-400
118室
南京实验仪器厂
立式压力蒸汽 灭菌器
LDZX-100KBS
116室
上海申安医疗 器械厂
生物安全柜
BSC-1100ⅡB2
阳性室
北京东联哈尔仪器 制造有限公司
冰箱
HY-S13-03
116室
北京低温设备厂
热空气消毒箱
GX625E
116室
天津市泰斯特仪器 有限公司
检查结果:
检查人:
复核人:
日期:
2、辅助材料确认
2.1移液器、接种环、酒精灯、记号笔、酒精棉球、试管架、试管、玻璃平皿、止血钳等
2.2需灭菌物品见《微生物限度检查法验证记录》
2.3一次性无菌用具见下表
无菌备品的检查
备品名称
批号
有效期
包装情况
薄膜过滤器
无热原吸头
无菌橡胶医用手套
检查结果:
检查人:
复核人:
日期:
3、人员确认
化验员 经设备操作、微生物检验技术和实验室生物安全等方面的培
训,考核合格后上岗。
4、商品培养基及灭菌培养基
4.1 所用培养基均不得有结块、吸潮、异味、颜色发生改变等现象。
培养基检查结果,如下
品名
批号
储藏条件
有效期
生产厂家
胰酪大豆胨琼脂培养基
阴凉 干燥处
三年
R2A琼脂培养基
阴凉 干燥处
三年
检查结果:
检查人:
复核人:
日期:
4.2已灭菌培养基的检查结果及结论见《微生物限度检查法验证记录》。
5、菌种及菌液的制备
5.1菌种来源:
黑龙江省药检所、公司收集的制药用水系统中的菌落。
菌种确认
菌种名称
传代日期
代数
管号
传代人
形态确认
铜绿假单胞菌
年 月 日
枯草芽孢杆菌
年 月 日
水系统环境菌(冻干三)
取用一周内该车间水系统环境菌
水系统环境菌(冻干二)
取用一周内该车间水系统环境菌
水系统环境菌(固体车间)
取用一周内该车间水系统环境菌
5.2菌液的制备
分取铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、水系统环境菌(冻干三)、水系统环境菌(冻干二)、水系统环境菌(固体车间)的新鲜培养物少许接种至胰酪大豆胨琼脂培养基上(环境菌应预先用胰酪大豆胨琼脂培养基平板增菌),30~35℃培养18~24小时;上述培养物用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液制成每1ml含菌数小于100cfu的菌悬液。
菌悬液制备后在室温下放置,应在2 小时内使用;若保存在2~8℃可在24h内使用。
5.2.1阴性对照:
菌液制备时应进行2个平板或试管的阴性对照试验,以确认菌种制备有效。
5.3菌液菌落数:
详见《微生物限度检查法验证记录》
四、样品制备
1稀释液:
氯化钠-蛋白胨缓冲液。
2供试液制备:
薄膜过滤法
取本品1ml加氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml,混匀。
3操作方法:
取上述供试液100ml,按薄膜过滤法过滤,滤完后取出滤膜,菌面朝上贴于已装载冷却凝固的R2A琼脂培养基平板上,平行制备两个平皿。
需氧菌总数计数平板倒置于30~35℃培养箱培养5天。
五、方法验证
1.培养基适用性试验及有效期考察
1.1 R2A琼脂培养基制备基础方法:
取18.124g,加水1000ml,微温溶解后,装入4个250ml三角瓶。
使用量较大时,按照验证的装载方式及灭菌程序,在其限定内调整单次灭菌量。
可能的装载方式:
80L灭菌锅 250ml*10瓶*3层或者500ml*7瓶*3层
100L灭菌锅 250ml*22瓶*2层或者500ml*15瓶*2层
灭菌条件为:
121℃、0.1MPa,15min。
含第7日、14日、21日的有效期考察,每次适用性试验需要使用600ml;共需3次。
1.1.1对照培养基的制备:
取对照培养基一袋,加水300ml,微温溶解,装入相同容积三角瓶中,与被检培养基相同条件同时灭菌。
1.2接种上述5种菌株至待测R2A琼脂培养基平板(每个平板中含培养基15~20ml),每个菌株平行制备2个平板;同样方法接种上述菌株至对照培养基。
培养温度30~35℃,时间不超过3天。
被检培养基上每种菌株的平均菌落数与对照培养基上的平均菌落数比值应在0.5~2,且菌落形态大小与对照培养基一致。
1.3在第7日、14日和21日按1.2方法使用1.1配制的R2A琼脂培养基,及新制备的对照培养基进行培养基适用性检查。
稳定性及有效期考察表
次数
比值(0.5~2)及性状一致性
铜绿
枯草
冻干二菌落
冻干三菌落
固体菌落
第一次
第二次
第三次
结论:
评价人:
评价日期:
2需氧菌总数的计数方法验证
2.1设置试验组、菌液对照组、供试品对照组,分别取三个不同日期的供试品(选择储罐取样点)进行3次独立的平行试验,并分别计算各试验菌每次试验的回收率。
试验菌液为铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌。
(1)试验组 取上述供试液100ml,分别加入含菌数不大于100cfu/ml的试验菌液1ml,按薄膜过滤法过滤。
过滤完毕后取出滤膜,菌面朝上贴于已装载冷却凝固的R2A琼脂培养基平板上,平行制备两个平皿。
(2)菌液对照组 取上述供试液100ml,加入氯化钠-蛋白胨缓冲液1ml,按薄膜过滤法过滤。
过滤完毕后取出滤膜,菌面朝上贴于已装载冷却凝固的R2A琼脂培养基平板上,平行制备两个平皿。
(3)供试品对照组 取氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml,分别加入含菌数不大于100cfu/ml的试验菌液1ml,按薄膜过滤法过滤。
过滤完毕后取出滤膜,菌面朝上贴于已装载冷却凝固的R2A琼脂培养基平板上,平行制备两个平皿。
2.2 上述实验三个纯化水车间(冻干粉针二车间、冻干粉针三车间、口服固体制剂车间)同步进行,可使用同一组阴性对照;培养温度30~35℃,时间不超过3天。
各组实验检查结果及结论见检验记录。
2.2.1需要主要材料:
、已灭菌R2A琼脂培养基720ml、薄膜过滤器36套。
2.3计算菌回收率公式:
试验组菌的回收率=
试验组平均菌落数供试品对照组平均菌落数
菌液对照组的平均菌落数
计数方法适用性表
次数
回收率比值(冻干二)
铜绿假单胞菌
枯草芽孢杆菌
第一次
第二次
第三次
次数
回收率比值(冻干三)
铜绿假单胞菌
枯草芽孢杆菌
第一次
第二次
第三次
次数
回收率比值(固体)
铜绿假单胞菌
枯草芽孢杆菌
第一次
第二次
第三次
结论:
评价人:
评价日期:
3.供试品检查
3.1每个车间三批样品(同一个点、不同日期,减少随机误差,便于统计分析,)按上述验证的方法检验,即取水样1ml,加氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释至100ml,取该100ml溶液进行薄膜过滤,取滤片,菌面向上,贴于R2A琼脂培养基平板;平行制备两个平板,同法以氯化钠-蛋白胨缓冲液代替样品进行阴性对照试验;将上述平板于30~35℃培养不少于5天;阴性对照不得有菌生长(同时检验的各批产品可使用一个阴性对照平板)且三批检验均应能获得准确结果。
3.2每日主要材料:
已灭菌R2A琼脂培养基200ml,薄膜过滤器10套。
3.3检验结果
次数
日期
车间
冻干二
冻干三
固体
第一次
月 日
第二次
月 日
第三次
月 日
结论:
评价人:
评价日期:
六、验证结果及评价:
方案实施人员是否经过相关技术培训或路演 口;实施前仪器设备操作及人员能力确认是否有效 口; 实施前相关校准、检定及标准物质、关键耗材准备是否充分 口; 实施项目是否完整、正确 口;
实施过程是否未曾发生偏差、变更或其它异常 口; 需要说明的情况:
评价人:
评价日期:
七、再验证周期:
需要进行本次再确认的情况主要有:
纯化水生产工艺变更、检验培养基供应商变更、检验用薄膜过滤器的形式变更;检验人员的不稳定因素;若有其他可能影响计数准确性的变更应考虑实施本确认。
否则,本确认再验证周期为5年。
八、验证结论批准:
验证小组:
日期:
附件一:
微生物限度检查法验证记录
微生物限度检查法验证记录
品名:
纯化水 取样口:
来源:
1.实验室环境
操作室名称 环境
微生物限度室
阳性对照室
压差(Pa)
温度(℃)
湿度(%)
沉降菌(cfu)
检查结果:
检查人:
日期:
2.灭菌物品确认
灭菌物品
灭菌方式
温度
时间
日期
无菌服、口罩
湿热
平皿、量筒
干热
检查结果:
检查人:
日期:
3.灭菌后培养基的确认
3.1灭菌后培养基瓶和塞子不得有破裂,避免形成气泡,培养基应呈均匀溶液状态,不得有析出沉淀,PH值不能超过规定值的±0.2,不得污染微生物。
促生长能力符合规定。
已配制灭菌培养基在有效期内,如下表所示:
品名
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- 纯化 水需氧菌 总数 计数 方法 验证 2015