实时荧光定量PCR具体实验步骤.docx
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实时荧光定量PCR具体实验步骤.docx
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实时荧光定量PCR具体实验步骤
实时荧光定量PCR操作步骤
以下实验步骤仅供参考:
1样品RNA的抽提
①取冻存已裂解的细胞,室温放置5分钟使其完全溶解。
②两相别离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中参加0.2ml的氯仿,盖紧管盖。
手动剧烈振荡管体15秒后,15到30℃孵育2到3分钟。
4℃下12000rpm离心15分钟。
离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相,中间层以及无色水相上层。
RNA全部被分配于水相中。
水相上层的体积大约是匀浆时参加的TRIZOL试剂的60%。
③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。
加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA,混匀后15到30℃孵育10分钟后,于4℃下12000rpm离心10分钟。
此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。
④RNA清洗移去上清液,每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中参加至少1ml的75%乙醇〔75%乙醇用DEPCH2O配制〕,清洗RNA沉淀。
混匀后,4℃下7000rpm离心5分钟。
⑤RNA枯燥小心吸去大局部乙醇溶液,使RNA沉淀在室温空气中枯燥5-10分钟。
⑥溶解RNA沉淀溶解RNA时,先参加无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次,使其完全溶解,获得的RNA溶液保存于-80℃待用。
2RNA质量检测
1〕紫外吸收法测定
先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。
然后取少量RNA溶液用TE稀释〔1:
100〕后,读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值,测定RNA溶液浓度和纯度。
①浓度测定
A260下读值为1表示40µgRNA/ml。
样品RNA浓度(µg/ml)计算公式为:
A260×稀释倍数×40µg/ml。
具体计算如下:
RNA溶于40µlDEPC水中,取5ul,1:
100稀释至495µl的TE中,测得A260=0.21
RNA浓度=0.21×100×40µg/ml=840µg/ml或0.84µg/µl
取5ul用来测量以后,剩余样品RNA为35µl,剩余RNA总量为:
35µl×0.84µg/µl=29.4µg
②纯度检测
RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度,比值范围1.8到2.1。
2〕变性琼脂糖凝胶电泳测定
①制胶
1g琼脂糖溶于72ml水中,冷却至60℃,10ml的10×MOPS电泳缓冲液和18ml的37%甲醛溶液(12.3M)。
10×MOPS电泳缓冲液
浓度 成分
0.4M MOPS,pH7.0
0.1M 乙酸钠
0.01M EDTA
灌制凝胶板,预留加样孔至少可以参加25µl溶液。
胶凝后取下梳子,将凝胶板放入电泳槽内,加足量的1×MOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。
②准备RNA样品
取3µgRNA,加3倍体积的甲醛上样染液,加EB于甲醛上样染液中至终浓度为10µg/ml。
加热至70℃孵育15分钟使样品变性。
③电泳
上样前凝胶须预电泳5min,随后将样品参加上样孔。
5–6V/cm电压下2h,电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2–3cm。
④紫外透射光下观察并拍照
28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓〔其大小决定于用于抽提RNA的物种类型〕,上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。
还有可能观察到一个更小稍微扩散的带,它由低分子量的RNA〔tRNA和5S核糖体RNA〕组成。
在18S和28S核糖体带之间可以看到一片弥散的EB染色物质,可能是由mRNA和其它异型RNA组成。
RNA制备过程中如果出现DNA污染,将会在28S核糖体RNA带的上面出现,即更高分子量的弥散迁移物质或者带,RNA的降解表现为核糖体RNA带的弥散。
用数码照相机拍下电泳结果。
3样品cDNA合成
①反响体系
序号 反响物 剂量
1 逆转录buffer 2μl
2 上游引物 0.2μl
3 下游引物 0.2μl
4 dNTP 0.1μl
5 逆转录酶MMLV 0.5μl
6 DEPC水 5μl
7 RNA模版 2μl
8 总体积 10μl
轻弹管底将溶液混合,6000rpm短暂离心。
②混合液在参加逆转录酶MMLV之前先70℃干浴3分钟,取出后立即冰水浴至管内外温度一致,然后加逆转录酶0.5μl,37℃水浴60分钟。
③取出后立即95℃干浴3分钟,得到逆转录终溶液即为cDNA溶液,保存于-80℃待用。
4梯度稀释的标准品及待测样品的管家基因〔β-actin〕实时定量PCR
①β-actin阳性模板的标准梯度制备阳性模板的浓度为1011,反响前取3μl按10倍稀释〔加水27μl并充分混匀〕为1010,依次稀释至109、108、107、106、105、104,以备用。
②反响体系如下:
标准品反响体系
序号 反响物 剂量
1 SYBRGreen1染料 10μl
2 阳性模板上游引物F 0.5μl
3 阳性模板下游引物R 0.5μl
4 dNTP 0.5μl
5 Taq酶 1μl
6 阳性模板DNA 5μl
7 ddH2O 32.5μl
8 总体积 50μl
轻弹管底将溶液混合,6000rpm短暂离心。
管家基因反响体系:
序号 反响物 剂量
1 SYBRGreen1染料 10μl
2 内参照上游引物F 0.5μl
3 内参照下游引物R 0.5μl
4 dNTP 0.5μl
5 Taq酶 1μl
6 待测样品cDNA 5μl
7 ddH2O 32.5μl
8 总体积 50μl
轻弹管底将溶液混合,6000rpm短暂离心。
③制备好的阳性标准品和检测样本同时上机,反响条件为:
93℃ 2分钟,然后93℃1分钟,55℃2分钟,共40个循环。
5制备用于绘制梯度稀释标准曲线的DNA模板
①针对每一需要测量的基因,选择一确定表达该基因的cDNA模板进展PCR反响。
反响体系:
序号 反响物 剂量
1 10×PCR缓冲液 2.5ul
2 MgCl2溶液 1.5ul
3 上游引物F 0.5ul
4 下游引物R 0.5ul
5 dNTP混合液 3ul
6 Taq聚合酶 1ul
7 cDNA 1ul
8 加水至总体积为 25ul
轻弹管底将溶液混合,6000rpm短暂离心。
35个PCR循环〔94℃1分钟;55℃1分钟;72℃1分钟〕;72ºC延伸5分钟。
②PCR产物与DNALadder在2%琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色,检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。
③将PCR产物进展10倍梯度稀释:
将PCR产物进展10倍梯度稀释:
设定PCR产物浓度为1×1010,依次稀释至109、108、107、106、105、104几个浓度梯度。
6待测样品的待测基因实时定量PCR
①所有cDNA样品分别配置实时定量PCR反响体系。
体系配置如下:
序号 反响物 剂量
1 SYBRGreen1染料 10ul
2 上游引物 1ul
3 下游引物 1ul
4 dNTP 1ul
5 Taq聚合酶 2ul
6 待测样品cDNA 5ul
7 ddH2O 30ul
8 总体积 50ul
轻弹管底将溶液混合,6000rpm短暂离心。
②将配制好的PCR反响溶液置于RealtimePCR仪上进展PCR扩增反响。
反响条件为:
93℃2分钟预变性,然后按93℃1分钟,55℃1分钟,72℃1分钟,共40做个循环,最后72℃7分钟延伸。
7实时定量PCR使用引物列表
引物设计软件:
PrimerPremier5.0,并遵循以下原那么:
引物与模板的序列严密互补;引物与引物之间防止形成稳定的二聚体或发夹构造;引物不在模板的非目的位点引发DNA聚合反响(即错配)。
8电泳
各样品的目的基因和管家基因分别进展RealtimePCR反响。
PCR产物与DNALadder在2%琼脂糖凝胶电泳,GoldView™染色,检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。
实时荧光定量PCR
组织RNA提取:
一般认为100mg肝组织提取RNA500ng,100mg肺提取RNA200ng,脑内的RNA丰度适中,100mg脑组织,提取RNA5-200ng。
所以一个10mg的海马可匀出RNA约为20ng。
反转录反响
反转录反响参照TaKaRaRT-PCR说明书。
反转录反响条件如下。
37°C15min〔反转录反响〕
85°C5sec〔反转录酶的失活反响〕
RealTimePCR反响
选用脑源神经营养因子〔BDNF〕为目标基因,核糖体18SrRNA(18SrRNA)做为内参。
基因
引物序列
扩增片段长度
NR2B
NR2B(+)
CCGCAGCACTATTGAGAACA
213bp
NR2B(–)
ATCCATGTGTAGCCGTAGCC
18srRNA
18srRNA(+)
tttgttggttttcggaactga
198bp
18srRNA(–)
cgtttatggtcggaactacga
1〕按以下组份配制PCR反响液〔反响液配制请在冰上进展〕。
试剂
使用量
终浓度
SYBR®PremixExTaqTM〔2×〕
12.5μl
1×
PCRForwardPrimer〔10μM〕
1μl
0.4μM
PCRReversePrimer〔10μM〕
1μl
0.4μM
模板〔cDNA溶液〕
0.5μl
dH2O
10μl
Total
25μl
全班40人,分为5组,每组做8管。
4管做BDNF,4管做18SrRNA。
4管BDNF或者18SrRNA,采用相应的正反PCR引物。
每种基因做两个模板,一个模板采用原液浓度,一个模板采用稀释一倍浓度,体积均为0.5μl。
2〕三步法PCR
首先95°C作用3min。
PCR进展35个循环。
步骤
温度
时间
变性
95°C
30秒
退火
58°C
30秒
延伸
72°C
30秒
融解曲线
温度
时间
变温速度
95°C
0秒
20°C/秒
55°C
15秒
20°C/秒
95°C
0秒
0.1°C/秒
PCR疑难解答
当PCR结果不甚满意时,首先检查以下几方面并遵照执行:
1将PCR反响的试管与反响板紧贴。
2当酶反响混合物以70℃“热启动〞开场循环时,切记在参加酶后稍3微振荡一下,因为在0.2-ml的PCR管中不能均匀传热。
4不要随意减少dNTP的用量,它是一个系统的因素,必须与其它成份保持平衡。
5对于有问题的PCR反响,例如模板的量少,模板不纯和环状模板等,先尝试加Taq酶前的体系进展预变性,后加模板进展正常PCR扩增。
没有扩增产物:
1在提供MgCl2缓冲液中,以0.25mmol/L为梯度增加MgCl2浓度;无MgCl2的缓冲液以0.5mmol/L为梯度增加MgCl2浓度。
2泳道中出现模糊条带,如果DNA模板中存在RNA,那么按上述提示浓度补加MgCl2,因为在PCR反响中可能缺少游离的Mg2+。
3检查退火温度和变性条件,如果有需要的话,可降低退火温度。
4检查模板和引物的用量。
5增加循环次数和/或模板DNA的用量。
泳道中出现模糊条带:
1减少循环次数或模板
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