浅论丹参提取液对HMGB1胞外释放的抑制作用.docx
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浅论丹参提取液对HMGB1胞外释放的抑制作用
浅论丹参提取液对HMGB1胞外释放的抑制作用
【摘要】 目的:
研究丹参对内毒素脂多糖激活后巨噬细胞高迁移率族蛋白B1释放和内毒素血症小鼠血清HMGB1水平的影响。
方法:
使用不同浓度的丹参提取液处理100ng/mlLPS激活的培养巨噬细胞株RAW,观察培养上清液中HMGB1水平和细胞HMGB1mRNA表达的变化,并通过腹腔内注射LPS建立的内毒素血症小鼠模型,观察丹参提取液对内毒素血症小鼠血清HMGB1水平和存活率的影响。
细胞培养上清液和血清HMGB1含量采用酶联免疫分析方法检测,细胞HMGB1mRNA表达采用RTPCR方法检测。
结果:
丹参提取液明显抑制LPS激活后的巨噬细胞HMGB1释放和HMGB1mRNA表达,降低内毒素血症小鼠血清HMGB1水平并提高存活率。
结论:
丹参有抑制巨噬细胞HMGB1释放和保护内毒素血症小鼠的作用。
【关键词】丹参;高迁移率族蛋白B1;巨噬细胞;内毒素血症
[Abstract]Objective:
TostudytheeffectsofSalviamiltiorrhizaonthereleaseofhighmobilitygroupbox1(HMGB1)fromendotoxinstimulatedmacrophagesandserumHMGB1levelofendotoxemiamice.Methods:
HMGB1concentrationintheculturemediumandexpressionofHMGB1mRNAwereanalysedbyenzymelinkedimmunosorbentassayandRTPCR,respectively,after100ng/mllipopolysaccharide(LPS)stimulatedmacrophagelikeRAW cellsweretreatedwithdifferentdosesofSalviamiltiorrhizaextract.Inaddition,theeffectofSalviamiltiorrhizaextractwasinvestigatedonserumHMGB1levelandsurvivalrateofendotoxemiamicewhichwereestablishedbyintraperitonealinjectionofLPS.Results:
SalviamiltiorrhizaextractmarkedlysuppressedthereleaseofHMGB1andexpressionofHMGB1mRNAinLPSstimulatedmacrophages,anddecreasedserumHMGB1levelofendotoxemiamicewiththesurvivalrateelevated.Conclusion:
SalviamiltiorrhizasuppressedextracellularreleaseofHMGB1inendotoxinstimulatedmacrophages,andconferredprotectionagainstendotoxinlethality.
[Keywords]Salviamiltiorrhiza;highmobilitygroupbox1;macrophages;endotoxemia
胞外高迁移率族蛋白B1为近年发现的一种晚期炎症介质,在脓毒症、关节炎、肺炎、急性胰腺炎等疾病的发病机制中起着十分重要的作用[1-4]。
鉴于HMGB1在诸多炎症性疾病病理中的重要性,HMGB1靶向治疗研究已引起广泛重视[3,4]。
丹参(Salviamiltiorrhiza)为唇形科鼠尾草属植物的干燥根及根茎,具有活血通经、凉血消肿、祛痈肿丹毒之功效[5,6]。
我们在筛选中药抗HMGB1成分研究中发现丹参提取液具有明显抑制巨噬细胞HMGB1释放和保护内毒素血症小鼠的作用,现报告如下。
1材料与方法
实验材料
BALB/c小鼠由江苏省血吸虫病防治研究所提供;丹参购自甘肃天水药材供应站(经无锡市人民医院许英华主任药师鉴定);巨噬细胞株RAW购自中国科学院细胞库。
内毒素脂多糖为Sigma公司产品,mRNA提取试剂盒为Promega公司产品,MMLV一步法RTPCR试剂盒为上海捷瑞公司产品。
方法
丹参提取液的制备
丹参经纯水漂洗后,水煎2次,合并2次水煎液,μm过滤器过滤并调整浓度至1g/ml(按生药计算)。
HMGB1浓度测定
采用酶联免疫分析方法。
小鼠HMGB1ELISA试剂盒为武汉中美科技有限公司产品,按产品使用说明书进行。
HMGB1mRNA表达检测
应用mRNA提取试剂盒,在细胞培养皿中直接裂解细胞mRNA。
HMGB1引物:
5′ATGGGCAAAGGAGATCCTA3′,5′ATTCATCATCATCATCTTCT3′。
以三磷酸甘油醛脱氢酶作为内参对照,引物:
5′TCCCTCAAGATTGTCAGCAA3′,5′AGATCCACAACGGATACATT3′。
HMGB1mRNA表达水平以HMGB1与GADPH基因扩增条带光密度比值表示。
培养细胞实验
巨噬细胞株RAW使用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液在37℃,5%CO2培养箱中进行培养,隔天传代1次。
细胞贴壁覆盖80%~90%时进行实验。
以LPS组和丹参处理组各25只,后者于注射LPS后0,24,48,72h以15g/kg剂量给小鼠腹腔内注射丹参提取液,观察小鼠存活情况。
统计学方法
采用SPSS统计软件包进行双侧t检验分析和χ2检验分析,为差异有统计学意义。
2结果
丹参提取液对巨噬细胞HMGB1释放的作用
丹参提取液明显抑制LPS激活后巨噬细胞株RAW HMGB1的释放,并呈剂量相关性,见表1。
表1丹参提取液对巨噬细胞株RAW培养上清液中HMGB1水平的影响,Tab1EffectofSalviamiltiorrhizaextractonHMGB1 levelintheculturemediumofmacrophagelike RAW cells。
丹参提取液对巨噬细胞HMGB1mRNA表达的影响
巨噬细胞株RAW受LPS激活20h后HMGB1mRNA表达显着升高,而丹参提取液对其表达具有明显抑制作用,见图1。
丹参提取液对内毒素血症小鼠血清HMGB1水平和存活率的影响
丹参提取液对内毒素血症小鼠有明显的保护作用,96h后小鼠存活率由32%提高至64%,见图2。
同时,丹参提取液明显降低了内毒素血症小鼠血清HMGB1水平,见表2。
表2丹参提取液对内毒素血症小鼠血清HMGB1水平的影响,Tab2EffectofSalviamiltiorrhizaextractonserumHMGB1levelofendotoxemiamice
3讨论
高迁移率族蛋白因其在聚丙烯酰胺凝胶电泳中的高迁移能力而得名,包括HMGA,HMGB,HMGN3个家族,而HMGB家族有3个成员即HMGB1,HMGB2,HMGB3。
HMGB1作为核内一种典型的非组蛋白,长期以来的研究主要集中在其核内功能,包括参与核小体的构建和稳定,调节基因的转录、参与DNA的重组修复和复制等。
1999年,Wang等[7]发现HMGB1可通过活化细胞的主动分泌释放到胞外并介导炎症反应,为内毒素血症和脓毒症的重要炎症介质,随后胞外HMGB1的致炎作用引起广泛兴趣和重视。
近年来的研究[1-4]证实,胞外HMGB1为一种重要的炎症介质和致炎细胞因子,参与多种疾病如脓毒症、关节炎、急性胰腺炎、肺炎、系统性红斑狼疮、脑膜炎、肾脏疾病、心血管疾病等的发病过程。
目前,HMGB1靶向治疗研究已引起人们关注,而HMGB1靶向治疗的关键是研发有效的HMGB1拮抗剂。
目前已发现有HMGB1拮抗作用的有抗HMGB1抗体、HMGB1Abox蛋白和丙酮酸乙酯等[4,7]。
中国使用中药历史悠久、资源丰富,中药对许多疾病具有明显的疗效,世界各国对中药的研究和应用也日趋重视,但对中药及其有效成分的抗HMGB1作用研究甚少。
本课题组在严重急性呼吸综合征暴发期间,曾对国内治疗SARS的几种主要中药配方进行抗HMGB1作用的实验研究,发现这些中药配方具有明显抑制巨噬细胞株RAW和人外周血单核细胞的HMGB1释放作用,并提出HMGB1参与SARS的发病机制[8]。
最近,Chen等[9]和Li等[10]研究发现绿茶提取物和绿茶主要成分表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)具有抑制HMGB1释放的作用,后者可明显提高脓毒症小鼠的存活率。
丹参是最常用的活血化瘀中药之一,在《神农本草经》中被列为上品,现代药理研究发现丹参具有保护心脏缺血缺氧、改善微循环、抑制血小板聚集和血栓形成、中枢镇静、抗氧化、抗菌消炎及增强免疫功能等作用[5]。
本研究显示,丹参提取液对内毒素致巨噬细胞HMGB1释放具有明显的抑制作用,其作用机制与抑制细胞HMGB1基因表达有关,但其信号转导过程值得进一步研究。
动物实验结果显示,丹参提取液能明显降低内毒素血症小鼠血清HMGB1水平,同时能提高内毒素血症小鼠的存活率。
鉴于胞外HMGB1为内毒素血症致死的重要炎症介质,丹参提取液可能通过抑制细胞HMGB1释放、降低血清HMGB1水平而阻止内毒素血症的发展和恶化。
徐鑫荣等[11]报道,丹参注射液能改善内毒素休克兔的心、肝、肺功能,减轻全身炎症反应及部分脏器病理损害,丹参注射液对内毒素休克多器官损伤的保护作用可能与丹参抑制HMGB1释放有关。
我们下一步将对丹参抗HMGB1作用的有效成分进行研究。
【参考文献】
[1]KluneJR,DhuparR,CardinalJ,etal.HMGB1:
endogenousdangersignaling[J].MolMed,2008,14(7-8):
476-484.
[2]KarlssonS,PettilV,TenhunenJ,etal.HMGB1asapredictoroforgandysfunctionandoutcomeinpatientswithseveresepsis[J].IntensiveCareMed,2008,34(6):
1046-1053.
[3]WangH,ZhuS,ZhouR,etal.TherapeuticpotentialofHMGB1targetingagentsinsepsis[J].ExpertRevMolMed,008,4(10):
e32.
[4]YangH,OchaniM,LiJ,etal.Reversingestablishedsepsiswithantagonistsofendogenoushighmobilitygroupbox1[J].ProcNatlAcadSciUSA,2004,101
(1):
296-301.
[5]刘艾林,李铭源,王一涛,等.丹参药理学活性物质基础研究现状[J].中国药学杂志,
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